Oznaczanie liczby nefronów w całej nerce metodą maceracji kwasowej
22 maja 2019
Szacunki liczby nefronów w całej nerce są ważne klinicznie i eksperymentalnie, ponieważ istnieje odwrotny związek między liczbą nefronów a zwiększonym ryzykiem chorób nerek i układu krążenia. W niniejszej pracy przedstawiono zastosowanie metody maceracji kwasowej, która zapewnia szybkie i wiarygodne oszacowanie liczby nefronów w całej nerce.
Metoda maceracji kwasowej może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące nerek i tego, w jaki sposób określone geny przyczyniają się do rozwoju nefronów lub wpływają na ich rozwój, a także jak określone schorzenia, takie jak cukrzyca lub nadciśnienie, wpływają na liczbę nefronów. Jest to ważne, ponieważ całkowita liczba nefronów, z którymi rodzą się osoby, jest określana podczas rozwoju płodu, a utrata nefronów jest związana z patologią nerek. Głównymi zaletami metody maceracji kwasowej jest to, że jest szybsza, bardziej powtarzalna, niedroga i mniej czasochłonna niż inne metody liczenia nefronów, takie jak rezonans magnetyczny
.Technika ta ułatwia korelację wpływu liczby nefronów na czynność nerek, co jest ważne dla lepszego zrozumienia, w jaki sposób określone geny wpływają na funkcję i rozwój nefronów. Badanie genów lub czynników, które wpływają na ogólną liczbę nefronów, będzie miało zasadnicze znaczenie dla rozwoju metod farmakologicznych lub genetycznych mających na celu ograniczenie utraty nefronów związanych z chorobą. Dzięki dobrej technice eksperymentalnej i praktyce, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, powinny łatwo opanować metodę maceracji kwasowej, co pozwoli na wiarygodne i powtarzalne oszacowanie liczby nefronów w całej nerce.
Zacznij od użycia cienkich nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć jamę brzuszną myszy wzdłuż linii środkowej. Ostrożnie przenieś jelita i tkankę tłuszczową rozrodczą na prawą stronę zwierzęcia. Stosując grubą sekcję, wyizoluj lewą nerkę i przetnij lewą tętnicę nerkową i żyłę, aby ostrożnie usunąć nerkę, umieszczając narząd w odpowiednio oznakowanej łodzi do ważenia PBS.
Zbierz prawą nerkę w ten sam sposób i umieść obie nerki na gazie chirurgicznej wstępnie zwilżonej PBS. Szybko usuń wszelkie przylegające tkanki nienerkowe i torebki nerkowe. Następnie zważ każdą nerkę indywidualnie, rejestrując osobno wagę lewego i prawego narządu.
Po zważeniu umieść każdą nerkę z powrotem w odpowiednio oznakowanej łodzi wagowej bez PBS i użyj czystej żyletki, aby przeciąć każdy narząd na pół wzdłuż. Umieść każdą połówkę nerki przeciętą stroną do dołu i pokrój każdą połówkę na dwa milimetry lub mniejsze kawałki. Za pomocą tej samej żyletki ostrożnie przenieś posiekane kawałki nerki do odpowiednio oznakowanej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.
W dobrze wentylowanym dygestorium dodaj pięć mililitrów sześciomolowego kwasu solnego do każdej probówki. Następnie delikatnie wymieszaj mieszaniny kwasu nerkowego przed umieszczeniem probówek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut. Pod koniec maceracji kwasowej przymocować jedną igłę o rozmiarze 18 G do jednej pięciomililitrowej strzykawki na nerkę i ostrożnie wyjąć tłoki strzykawki.
Umieść strzykawki w pojedynczych stożkowych probówkach o pojemności 50 mililitrów w dygestorii i wlej roztwory nerkowe do otwartego końca każdej strzykawki, odkładając puste probówki na bok w stojaku na probówki. Następnie ostrożnie wymień tłoki, aby powoli wytłaczać każdy roztwór przez igły do 50-mililitrowych probówek. Umyj 15-mililitrowe stożkowe probówki pięcioma mililitrami roztworu PBS na probówkę, obracając PBS w celu rozpuszczenia pozostałej tkanki nerkowej.
Wyciśnij zawartość prania do odpowiedniej rurki o pojemności 50 mililitrów, jak pokazano poniżej. Po wyciśnięciu trzeciego płukania wyposażyć każdą strzykawkę w igłę o rozmiarze 21. Wyciśnij zawartość 50-mililitrowych probówek do drugiego zestawu 50-mililitrowych probówek przez mycie igłą o mniejszym otworze i trzykrotnie wytłaczając zawartość pierwszej 50-mililitrowej probówki świeżym PBS, jak pokazano.
Po trzecim praniu i wytłaczaniu zwiększ całkowitą objętość w każdej tubie do 50 mililitrów za pomocą dodatkowego PBS i umieść rurki w stojaku na płycie kołyskowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W ciągu pięciu dni od przetworzenia umieść siatkę zawierającą 16 oddzielnych sekcji na dnie sześciu dołków 12-dołkowej płytki. Delikatnie odwróć probówki z roztworem nerkowym kilka razy, aby ponownie zawiesić granulowane tkanki.
Ostrożnie dodać trzy 500 mikrolitrów podwielokrotności każdego homogenizowanego roztworu na nerkę do każdego z trzech dołków płytki 12-dołkowej. Rozcieńczyć zawartość każdej studzienki równą objętością PBS. Umieść płytkę na stoliku mikroskopu odwróconego.
Zidentyfikuj kłębuszki nerkowe na podstawie ich kulistej struktury, czerwonawego odcienia oraz tętnic przed- lub końcowych przyczepionych do ciał poszczególnych kłębuszków nerkowych. Policz liczbę kłębuszków nerkowych na każdą sekcję z siatką, aby zsumować liczbę kłębuszków na siatkę w celu obliczenia całkowitej liczby kłębuszków na studzienkę. Następnie pomnóż liczbę kłębuszków nerkowych na studzienkę razy 100, aby uzyskać średnią liczbę kłębuszków nerkowych.
W tym reprezentatywnym eksperymencie całkowita liczba nefronów u myszy, którym podawano nośnik przez 14 dni, wynosiła około 12 500 nefronów na nerkę. Infuzja angiotensyny drugiej zwiększyła jednak ciśnienie przedsionkowe o około 40 milimetrów słupa rtęci i wiązała się ze znaczącym, prawie 26% zmniejszeniem całkowitej liczby nefronów. W tym genetycznym modelu agenezji nerek szczurów obliczono, że zwierzęta urodzone z dwiema nerkami zawierają około 27 500 nefronów na nerkę po maceracji kwasowej, jak wykazano, podczas gdy szczury urodzone z pojedynczą nerką miały znacznie niższą całkowitą liczbę nefronów.
Szacunki z obu eksperymentów były zgodne z zakresami wcześniej zgłaszanymi u szczurów. Metoda maceracji kwasowej idealnie nadaje się do szacowania liczby nefronów w całych nerkach, zwłaszcza w laboratoriach, które nie są wyposażone w bardziej pracochłonne i kosztowne techniki liczenia nefronów, takie jak metoda frakcjonowania disektorowego lub rezonans magnetyczny. Metoda ta pozwala na wysokoprzepustowe, wydajne i powtarzalne oszacowanie liczby nefronów w całej nerce, które mieszczą się w granicach 5% liczb określonych za pomocą rezonansu magnetycznego.
Ocena liczby nefronów ma znaczenie kliniczne, ponieważ zmniejszona liczba nefronów wiąże się ze zwiększonym ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych, takich jak przewlekła choroba nerek. Nie zapominaj, że praca z kwasem solnym może być bardzo niebezpieczna i że należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Metoda maceracji kwasowej zapewnia szybki i niezawodny sposób szacowania liczby nefronów w całej nerce, co jest kluczowe dla zrozumienia stanu zdrowia nerek i układu sercowo-naczyniowego. Technika ta jest szczególnie istotna w badaniu wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na rozwój oraz utratę nefronów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nefrologia
- Genetyka
- Patologia nerek
Wstęp
- Liczba nefronów jest powiązana z ryzykiem wystąpienia chorób nerek oraz chorób sercowo-naczyniowych.
- Całkowita liczba nefronów ustala się podczas rozwoju płodowego.
- Utrata nefronów wiąże się z różnymi patologiami nerek.
- Zrozumienie rozwoju nefronów może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
Cel badania
- W celu wykazania skuteczności metody maceracji kwasowej w liczeniu nefronów.
- W celu zbadania wpływu genów oraz schorzeń, takich jak cukrzyca, na liczbę nefronów.
- W celu usprawnienia badań nad funkcją i rozwojem nefronów.
Zastosowane metody
- Technika maceracji kwasowej do szacowania liczby nefronów.
- Porównanie z tradycyjnymi metodami liczenia nefronów.
- Ocena powtarzalności i wydajności metody.
- Zastosowanie w różnych kontekstach eksperymentalnych.
Główne wyniki
- Metoda maceracji kwasowej jest szybsza i bardziej powtarzalna niż inne techniki.
- Zapewnia ona wiarygodne oszacowanie liczby nefronów.
- Ułatwia badanie wpływu czynników genetycznych na rozwój nefronów.
- Umożliwia lepsze zrozumienie utraty nefronów związanej z chorobami.
Wnioski
- Metoda maceracji kwasowej jest cennym narzędziem w badaniach nad nefronami.
- Może ona pomóc w zidentyfikowaniu czynników wpływających na liczbę i funkcję nefronów.
- Opanowanie tej techniki może prowadzić do znaczących postępów w badaniach nad zdrowiem nerek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna ocena całkowitej liczby nefronów w nerce jest niezbędna do zrozumienia patofizjologii nerek oraz ryzyka sercowo-naczyniowego, szczególnie w ramach walidacji celów dla terapii nefroprotekcyjnych. Metoda maceracji kwasowej zapewnia szybkie, powtarzalne i kosztowo efektywne podejście do ilościowego określenia zasobu oraz utraty nefronów, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w modelach przedklinicznych. Pozwala to zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym na korelację manipulacji genetycznych lub środowiskowych z funkcjonalnymi efektami nerkowymi, zwiększając wiarygodność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez powiązanie modulacji genów lub czynników z mierzalnymi zmianami w liczbie nefronów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki ilościowej ocenie rozwoju i utraty nefronów w modelach genetycznych i chorobowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu badawczym, dostarczając wiarygodnego biomarkera strukturalnej integralności nerek powiązanego z długoterminowymi efektami funkcjonalnymi.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanej tkanki nerek do wysokoprzepustowego przesiewu związków lub modyfikatorów genetycznych wpływających na liczbę nefronów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowane, ilościowe zliczenia kłębuszków z odchyleniem <5% w porównaniu do MRI, zapewniając powtarzalność analizy w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Skalowalność: Ułatwia przetwarzanie dużych zestawów próbek, umożliwiając badania zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego w procesach odkrywczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia ciągłość translacyjną poprzez powiązanie pomiarów liczby nefronów z klinicznymi markerami ryzyka przewlekłej choroby nerek oraz chorób sercowo-naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Łączy modulację celu w fazie odkrywania z walidacją przedkliniczną dzięki spójnemu fenotypowaniu zorientowanemu na punkty końcowe.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza informacji dla kryteriów go/no-go poprzez kwantyfikację zachowania lub utraty nefronów jako mechanistycznego odczytu skuteczności lub toksyczności związku.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda maceracji kwasowej wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, dostarczając ilościowego fenotypu strukturalnego, który służy do dalszych ocen funkcjonalnych i bezpieczeństwa.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez umożliwienie bezpośredniego pomiaru liczby nefronów jako wskaźnika nefrogenezy lub utraty nefronów w odpowiedzi na interwencje genetyczne lub farmakologiczne.
- Przesiewy: Dostarcza gotowe do analizy zawiesiny tkankowe z powtarzalną izolacją kłębków, ułatwiając przesiewy bibliotek związków pod kątem aktywności nefronoprotekcyjnej.
- Analityka: Generuje ilościowe zliczenia kłębków na studzienkę, skalowalne do analizy statystycznej w celu porównania grup eksperymentalnych i zidentyfikowania istotnych efektów.
- Badania translacyjne: Łączy liczbę nefronów z istotnością chorobową, wspierając dopasowanie biomarkerów do punktów końcowych w klinicznej patologii nerek i układu sercowo-naczyniowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy ustandaryzowaną, niskokosztową platformę do kwantyfikacji nefronów, możliwą do zastosowania w wielu projektach, modelach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w strukturalnych fenotypach nerkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację pomiędzy laboratoriami i seriami eksperymentalnymi dzięki dobrze zdefiniowanemu, dostępnemu protokołowi.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wysokoprzepustowe liczenie nefronów bez konieczności polegania na kosztownej infrastrukturze obrazowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko, dostarczając przekładalnej metryki stanu strukturalnego nerek powiązanej z długoterminowym ryzykiem choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w histologicznej identyfikacji kłębków nerkowych na podstawie ich morfologii i charakterystyki barwienia.
- Zależy od dostępu do wyciągów, wirówek, mikroskopów z siatkami pomiarowymi oraz standardowych materiałów eksploatacyjnych do histologii.
- Wymaga standaryzacji przygotowania tkanek, czasu ekspozycji na kwas oraz protokołów liczenia pomiędzy zespołami w celu zminimalizowania zmienności międzyoperatorowej.
- Kwestie adaptacyjne obejmują specyficzny dla gatunku rozmiar nerek i gęstość kłębków, co wymaga optymalizacji pilotażowej dla modeli innych niż mysze.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wydajność ręcznego liczenia oraz zależność od przeszkolenia operatora w celu dokładnej identyfikacji kłębków, jak zaznaczono w protokole.
