Oznaczanie liczby nefronów w całej nerce metodą maceracji kwasowej

Metoda maceracji kwasowej może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące nerek i tego, w jaki sposób określone geny przyczyniają się do rozwoju nefronów lub wpływają na ich rozwój, a także jak określone schorzenia, takie jak cukrzyca lub nadciśnienie, wpływają na liczbę nefronów. Jest to ważne, ponieważ całkowita liczba nefronów, z którymi rodzą się osoby, jest określana podczas rozwoju płodu, a utrata nefronów jest związana z patologią nerek. Głównymi zaletami metody maceracji kwasowej jest to, że jest szybsza, bardziej powtarzalna, niedroga i mniej czasochłonna niż inne metody liczenia nefronów, takie jak rezonans magnetyczny

Technika ta ułatwia korelację wpływu liczby nefronów na czynność nerek, co jest ważne dla lepszego zrozumienia, w jaki sposób określone geny wpływają na funkcję i rozwój nefronów. Badanie genów lub czynników, które wpływają na ogólną liczbę nefronów, będzie miało zasadnicze znaczenie dla rozwoju metod farmakologicznych lub genetycznych mających na celu ograniczenie utraty nefronów związanych z chorobą. Dzięki dobrej technice eksperymentalnej i praktyce, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, powinny łatwo opanować metodę maceracji kwasowej, co pozwoli na wiarygodne i powtarzalne oszacowanie liczby nefronów w całej nerce.

Zacznij od użycia cienkich nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć jamę brzuszną myszy wzdłuż linii środkowej. Ostrożnie przenieś jelita i tkankę tłuszczową rozrodczą na prawą stronę zwierzęcia. Stosując grubą sekcję, wyizoluj lewą nerkę i przetnij lewą tętnicę nerkową i żyłę, aby ostrożnie usunąć nerkę, umieszczając narząd w odpowiednio oznakowanej łodzi do ważenia PBS.

Zbierz prawą nerkę w ten sam sposób i umieść obie nerki na gazie chirurgicznej wstępnie zwilżonej PBS. Szybko usuń wszelkie przylegające tkanki nienerkowe i torebki nerkowe. Następnie zważ każdą nerkę indywidualnie, rejestrując osobno wagę lewego i prawego narządu.

Po zważeniu umieść każdą nerkę z powrotem w odpowiednio oznakowanej łodzi wagowej bez PBS i użyj czystej żyletki, aby przeciąć każdy narząd na pół wzdłuż. Umieść każdą połówkę nerki przeciętą stroną do dołu i pokrój każdą połówkę na dwa milimetry lub mniejsze kawałki. Za pomocą tej samej żyletki ostrożnie przenieś posiekane kawałki nerki do odpowiednio oznakowanej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

W dobrze wentylowanym dygestorium dodaj pięć mililitrów sześciomolowego kwasu solnego do każdej probówki. Następnie delikatnie wymieszaj mieszaniny kwasu nerkowego przed umieszczeniem probówek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut. Pod koniec maceracji kwasowej przymocować jedną igłę o rozmiarze 18 G do jednej pięciomililitrowej strzykawki na nerkę i ostrożnie wyjąć tłoki strzykawki.

Umieść strzykawki w pojedynczych stożkowych probówkach o pojemności 50 mililitrów w dygestorii i wlej roztwory nerkowe do otwartego końca każdej strzykawki, odkładając puste probówki na bok w stojaku na probówki. Następnie ostrożnie wymień tłoki, aby powoli wytłaczać każdy roztwór przez igły do 50-mililitrowych probówek. Umyj 15-mililitrowe stożkowe probówki pięcioma mililitrami roztworu PBS na probówkę, obracając PBS w celu rozpuszczenia pozostałej tkanki nerkowej.

Wyciśnij zawartość prania do odpowiedniej rurki o pojemności 50 mililitrów, jak pokazano poniżej. Po wyciśnięciu trzeciego płukania wyposażyć każdą strzykawkę w igłę o rozmiarze 21. Wyciśnij zawartość 50-mililitrowych probówek do drugiego zestawu 50-mililitrowych probówek przez mycie igłą o mniejszym otworze i trzykrotnie wytłaczając zawartość pierwszej 50-mililitrowej probówki świeżym PBS, jak pokazano.

Po trzecim praniu i wytłaczaniu zwiększ całkowitą objętość w każdej tubie do 50 mililitrów za pomocą dodatkowego PBS i umieść rurki w stojaku na płycie kołyskowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W ciągu pięciu dni od przetworzenia umieść siatkę zawierającą 16 oddzielnych sekcji na dnie sześciu dołków 12-dołkowej płytki. Delikatnie odwróć probówki z roztworem nerkowym kilka razy, aby ponownie zawiesić granulowane tkanki.

Ostrożnie dodać trzy 500 mikrolitrów podwielokrotności każdego homogenizowanego roztworu na nerkę do każdego z trzech dołków płytki 12-dołkowej. Rozcieńczyć zawartość każdej studzienki równą objętością PBS. Umieść płytkę na stoliku mikroskopu odwróconego.

Zidentyfikuj kłębuszki nerkowe na podstawie ich kulistej struktury, czerwonawego odcienia oraz tętnic przed- lub końcowych przyczepionych do ciał poszczególnych kłębuszków nerkowych. Policz liczbę kłębuszków nerkowych na każdą sekcję z siatką, aby zsumować liczbę kłębuszków na siatkę w celu obliczenia całkowitej liczby kłębuszków na studzienkę. Następnie pomnóż liczbę kłębuszków nerkowych na studzienkę razy 100, aby uzyskać średnią liczbę kłębuszków nerkowych.

W tym reprezentatywnym eksperymencie całkowita liczba nefronów u myszy, którym podawano nośnik przez 14 dni, wynosiła około 12 500 nefronów na nerkę. Infuzja angiotensyny drugiej zwiększyła jednak ciśnienie przedsionkowe o około 40 milimetrów słupa rtęci i wiązała się ze znaczącym, prawie 26% zmniejszeniem całkowitej liczby nefronów. W tym genetycznym modelu agenezji nerek szczurów obliczono, że zwierzęta urodzone z dwiema nerkami zawierają około 27 500 nefronów na nerkę po maceracji kwasowej, jak wykazano, podczas gdy szczury urodzone z pojedynczą nerką miały znacznie niższą całkowitą liczbę nefronów.

Szacunki z obu eksperymentów były zgodne z zakresami wcześniej zgłaszanymi u szczurów. Metoda maceracji kwasowej idealnie nadaje się do szacowania liczby nefronów w całych nerkach, zwłaszcza w laboratoriach, które nie są wyposażone w bardziej pracochłonne i kosztowne techniki liczenia nefronów, takie jak metoda frakcjonowania disektorowego lub rezonans magnetyczny. Metoda ta pozwala na wysokoprzepustowe, wydajne i powtarzalne oszacowanie liczby nefronów w całej nerce, które mieszczą się w granicach 5% liczb określonych za pomocą rezonansu magnetycznego.

Ocena liczby nefronów ma znaczenie kliniczne, ponieważ zmniejszona liczba nefronów wiąże się ze zwiększonym ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych, takich jak przewlekła choroba nerek. Nie zapominaj, że praca z kwasem solnym może być bardzo niebezpieczna i że należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego.