Name: Oznaczanie liczby nefronów w całej nerce metodą maceracji kwasowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Naucz się szybkiej i niezawodnej metody maceracji kwasowej do oznaczania liczby nefronów w całej nerce. Technika ta umożliwia badanie wpływu genów i czynników środowiskowych na rozwój oraz utratę nefronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL107632).

Materiały eksploatacyjne i odczynniki wymienione poniżej służą do oznaczania całkowitej liczby nefronów nerkowych u jednej myszy, czyli dwóch nerek. Modyfikacje dotyczące stosowania metody maceracji kwasowej u szczurów są oznaczone gwiazdkami. Wszystkie protokoły eksperymentalne były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w Centrum Medycznym Uniwersytetu Mississippi.
1. Procedura izolacji nerki
<ol>
	<li>Zważ mysz (lub inny gatunek) i poddaj ją eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu (5% - 8%) lub pentobarbitalu (150 mg/kg wstrzyknięcia dootrzewnowego).</li>
	<li>Po uśpieniu myszy otwórz jej jamę brzuszną za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych wzdłuż linii środkowej.</li>
	<li>Ostrożnie unieś jelita i tkankę tłuszczową rozrodczą na prawą stronę jamy brzusznej. Przez grube rozwarstwienie odizolować lewą nerkę. Za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych przeciąć lewą tętnicę nerkową i żyłę i ostrożnie usunąć lewą nerkę, umieszczając nerkę w odpowiednio oznakowanej (numer / identyfikator myszy) łodzi wagowej zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforem (PBS).</li>
	<li>Powtórz procedurę dla prawej nerki.</li>
	<li>Wyjmij każdą nerkę z odpowiedniej łodzi wagowej i umieść ją na gazie chirurgicznej wstępnie zwilżonej PBS.</li>
	<li>Pozostawiając nerkę na gazie chirurgicznej, należy szybko usunąć wszelkie przylegające tkanki nienerkowe (takie jak tkanka tłuszczowa okołonerkowa lub nadnercza), a następnie usunąć torebkę nerkową. Zważyć każdą nerkę indywidualnie, zapisując masę lewej i prawej nerki oddzielnie w zeszycie laboratoryjnym.</li>
</ol>
2. Procedury homogenizacji, inkubacji i odcedzania
<ol>
	<li>Po zważeniu każdej nerki opróżnij każdą łódź wagową z PBS i umieść nerki z powrotem w odpowiednio oznakowanej łodzi do ważenia. Za pomocą czystej żyletki przetnij nerkę na pół, wzdłuż. Ułóż każdą połówkę nerki skierowaną w dół i pokrój każdą połówkę na 2 mm lub mniejsze kawałki.</li>
	<li>Używając tej samej żyletki, ostrożnie zbierz i umieść posiekane kawałki nerki w oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml (numer/identyfikator myszy; lewa i prawa nerka).</li>
	<li>Powtórz procedurę dla przeciwnej nerki, używając nowej żyletki. Umieść posiekaną nerkę w oddzielnie oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>W dobrze wentylowanym dygestorium dodaj 5 ml 6 M kwasu solnego (HCl) do każdej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Załóż nasadkę na rurkę stożkową, delikatnie wymieszaj mieszaninę nerek/HCl i umieść stożkową rurkę o pojemności 15 ml w podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 90 minut (*120 minut dla nerek szczurów).</li>
	<li>Krótko mieszać każdą probówkę o pojemności 15 ml co 15 minut podczas inkubacji, aby upewnić się, że cała tkanka jest wystawiona na działanie kwasu HCl.</li>
	<li>Wprowadzić igłę 18 G do strzykawki o pojemności 5 ml (*strzykawka 10 ml dla szczurów) i ostrożnie wyjąć tłok strzykawki. Umieścić strzykawkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (probówka #1) w dygestorium.</li>
	<li>Usunąć roztwór nerki/HCl z łaźni wodnej i wlać roztwór tkankowy do otwartego końca strzykawki, a następnie odłożyć stożkową probówkę o pojemności 15 ml na bok w stojaku na probówki. Ostrożnie wymienić tłok i powoli wciskać tłok tak, aby wytłoczyć roztwór przez igłę do rurki #1.</li>
	<li>Umyj stożkową probówkę o pojemności 15 ml 5 ml roztworu PBS. Zakręć PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aby rozpuścić pozostałą tkankę nerkową.</li>
	<li>Ponownie ostrożnie wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej igłę 18 G i wlać zawartość stożkowej probówki o pojemności 15 ml do otwartego końca strzykawki. Ostrożnie wymienić tłok i przepłukać strzykawkę, delikatnie naciskając tłok do rurki #1. Powtórz ten proces 2x (w sumie wykonane 3x).</li>
	<li>Wprowadzić igłę 21 G do nowej strzykawki o pojemności 5 ml (*strzykawka 10 ml dla szczurów) i ostrożnie wyjąć tłok strzykawki. Umieścić strzykawkę z dołączoną igłą 21-G w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml (probówka #2).</li>
	<li>Wlać zawartość z probówki #1 do otwartego końca strzykawki zawierającej igłę 21-G. Ostrożnie włożyć tłok i przepłukać strzykawkę, delikatnie naciskając tłok strzykawki i umieszczając wyciśnięty roztwór w probówce #2.</li>
	<li>Przemyć probówkę #1 5 ml roztworu PBS. Zakręć PBS w probówce #1, aby rozpuścić pozostałą tkankę nerkową.</li>
	<li>Ponownie ostrożnie wyjąć tłok z 5 ml strzykawki zawierającej igłę 18 G i wlać zawartość z probówki #1 do otwartego końca strzykawki. Ostrożnie wymienić tłok i przepłukać strzykawkę, delikatnie naciskając na tłok, wytłaczając roztwór do probówki #2. Powtórz ten proces 2x (w sumie wykonane 3x).</li>
	<li>Zwiększ całkowitą objętość probówki #2 do 50 ml, dodając dodatkowy PBS, aż do linii 50 ml na probówce #2.</li>
	<li>Inkubować probówkę #2 zawierającą roztwór tkanki nerkowej w stojaku na probówki na płytce kołyskowej w lodówce nastawionej na 4 °C przez noc (minimum 8 - 10 godzin).</li>
</ol>
3. Liczenie kłębuszków nerkowych i ekstrapolacja liczby nefronów
<ol>
	<li>Wyjmij probówkę #2 z lodówki i ponownie zawieś granulowaną chusteczkę, delikatnie obracając probówkę kilka razy, aby uzyskać jednorodny roztwór. Zalecamy liczenie kłębuszków nerkowych w ciągu 5 dni po przetworzeniu.</li>
	<li>Ostrożnie podzielić 500 μl roztworu nerkowego do pojedynczego dołka na 12-dołkowej płytce. Powtórz to 2 razy, umieszczając każdą podwielokrotność w oddzielnym studzince, tak aby na nerkę przypadały trzy studzienki roztworu nerkowego do analizy w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Dodać 500 μl PBS do każdej z trzech studzienek zawierających roztwór nerkowy, w celu rozcieńczenia w stosunku 1:1.</li>
	<li>Za pomocą odwróconego mikroskopu policz liczbę kłębuszków nerkowych na studzienkę. Liczenie jest wspomagane przez użycie siatki 16 oddzielnych sekcji umieszczonych na dnie każdej studzienki. Policz liczbę kłębuszków nerkowych na każdą sekcję z siatką, a następnie zsumuj liczbę kłębuszków na siatkę, aby uzyskać całkowitą liczbę kłębuszków na studzienkę. Kłębuszki nerkowe są łatwe do zidentyfikowania po ich kulistej budowie. Dodatkowe identyfikatory obejmowały czerwonawy odcień spowodowany naczyniami włosowatymi wypełnionymi krwią, a także tętniczki przed- lub po-tętniczki, które pozostają przyczepione do ciała poszczególnych kłębuszków nerkowych (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Dodać całkowitą liczbę kłębuszków nerkowych zliczonych na każdą z trzech studzienek, a następnie podzielić je przez trzy, aby uzyskać średnią liczbę kłębuszków nerkowych na 500 μl roztworu nerkowego. Jeśli odchylenie w średniej liczbie kłębuszków nerkowych na studzienkę jest większe niż 10%, powtórz procedurę liczenia nefronów, zwracając szczególną uwagę na jednorodny charakter roztworu nerkowego. Pomnóż liczbę kłębuszków nerkowych liczonych na studzienkę razy 100, aby uzyskać średnią liczbę kłębuszków nerkowych. Całkowita liczba nefronów może być wyrażona na nerkę lub, na podstawie masy nerki, na mg lub g tkanki.</li>
</ol>

<ol><li>Hall, J. E., Guyton, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+JE+%22Guyton+and+Hall+Textbook+of+Medical+Physiology%22">Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology</a>. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).</li>
<li>Wang, X., Garrett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+hypertension%2C+and+CKD%3A+physiological+and+genetic+insight+from+humans+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models.</a> Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).</li>
<li>Didion, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+model+to+explore+the+Brenner+hypothesis%3A+Linking+nephron+endowment+and+number+with+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension.</a> Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).</li>
<li>Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+adaptation+to+renal+injury+or+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nephron adaptation to renal injury or ablation.</a> American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).</li>
<li>Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+correlation+between+blood+pressure+and+nephron+endowment+in+a+genetic+model+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension.</a> Hypertension. 68, A052(2016).</li>
<li>Luyckx, V. A., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+importance+of+nephron+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The clinical importance of nephron mass.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).</li>
<li>Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fewer+nephrons+at+birth%3A+a+missing+link+in+the+etiology+of+essential+hypertension%3F%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension?</a> American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age%2C+kidney+weight%2C+and+body+surface+in+normal+man%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).</li>
<li>Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+with+the+aging+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Chronic+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes with the aging kidney.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).</li>
<li>Denic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+substantial+loss+of+nephrons+in+healthy+human+kidneys+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).</li>
<li>Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number+in+patients+with+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22+The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nephron number in patients with primary hypertension.</a> The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).</li>
<li>Hoy, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+glomerular+volume%2C+renal+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).</li>
<li>Hoy, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+volumes+of+individual+glomeruli+in+kidneys+at+autopsy%3A+association+with+age%2C+nephron+number%2C+birth+weight+and+body+mass+index%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index.</a> Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).</li>
<li>Hughson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertension%2C+glomerular+hypertrophy+and+nephrosclerosis%3A+the+effect+of+race%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).</li>
<li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+variability+and+risk+for+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size variability and risk for kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).</li>
<li>Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomeruli+and+blood+pressure.+Less+of+one%2C+more+of+the+other%3F%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other?</a> American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).</li>
<li>Clark, A. T., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+nephron+endowment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of nephron endowment.</a> American Journal of Physiology. 276 (4 Pt 2), F485-F497 (1999).</li>
<li>Benz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+glomerular+alterations+in+genetically+determined+low+nephron+number%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+fibroblast+growth+factor+receptors+1+and+2+in+the+ureteric+bud%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud.</a> Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).</li>
<li>Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmented+and+accelerated+nephrogenesis+in+TGF-beta2+heterozygous+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice.</a> Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).</li>
<li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+renal+function%2C+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li>
<li>Stelloh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prematurity+in+mice+leads+to+reduction+in+nephron+number%2C+hypertension+and+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria.</a> Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).</li>
<li>Galinsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intra-amniotic+lipopolysaccharide+on+nephron+number+in+preterm+fetal+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).</li>
<li>Bertam, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+and+how+we+determine+nephron+number%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Why and how we determine nephron number.</a> Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).</li>
<li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li>
<li>Beeman, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+glomerular+number+and+size+in+perfused+kidneys+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).</li>
<li>Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+existence+of+non-urine+forming+nephrons+in+the+diseased+kidney+of+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).</li>
<li>Bonvalet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+of+glomeruli+in+normal+and+hypertrophied+kidneys+of+mice+and+guinea-pigs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs.</a> The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).</li>
<li>Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+estimation+of+the+absolute+number+of+glomeruli+in+the+kidneys+of+lambs%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs.</a> Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).</li>
<li>Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+the+isolation+of+mouse+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Improved method for the isolation of mouse glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+deficiency+and+predisposition+to+renal+injury+in+a+novel+one-kidney+genetic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).</li>
<li>Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+biopsies+can+be+used+for+estimations+of+glomerular+number+and+volume%3A+a+pig+study%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study.</a> Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).</li>
<li>Fassi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+glomerular+injury+in+the+MWF+rat+is+predicted+by+inborn+nephron+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).</li>
<li>Wintour, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+nephron+number+in+adult+sheep%2C+hypertensive+as+a+result+of+prenatal+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment.</a> The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).</li>
<li>Van Vuuren, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+growth+of+congenital+solitary+kidneys+in+pigs+reflects+increased+nephron+numbers+rather+than+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy.</a> PLoS One. 7 (11), e49735(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przy dobrej technice eksperymentalnej metoda maceracji kwasowej jest idealna do szacowania liczby nefronów w całej nerce. Chociaż nerka jest rozpuszczona w kwasie, kłębuszki pozostają w dużej mierze nienaruszone i są łatwe do zidentyfikowania, co sprawia, że liczenie poszczególnych kłębuszków nerkowych jest stosunkowo łatwe i proste. Technika maceracji kwasowej jest szczególnie korzystna z kilku powodów. Po pierwsze, metoda maceracji kwasowej jest szybką i wygodną metodą, która wymaga stosunkowo niewielkich nakładów fina...

Nefron jest zarówno podstawową strukturą, jak i funkcjonalną jednostką klasy nerki<sup="xref">1. Strukturalnie nefron składa się z kłębuszków nerkowych (naczyń włosowatych i podocytów) znajdujących się w torebce Bowmana i kanalika nerkowego, składającego się z kanalika proksymalnego, pętli Henlego i kanalika dystalnego, który kończy się w przewodzie zbiorczym. Funkcjonalnie rolą nefronu jest filtracja i reabsorpcja wody i elektrolitów oraz wydzielanie odpadów. Ogólnie rzecz biorąc, nefrosteneza kończy się w 36 tygodniu ciąży u ludzi i wkrótce po urodzeniu u kilku gatunków, takich jak myszy i szczury2. Wyposażenie nefronu odnosi się do całkowitej liczby nefronów, z którymi dana osoba się rodzi, podczas gdy liczba nefronów to całkowita liczba nefronów zmierzona w dowolnym momencie po urodzeniu3. Terminy liczba nefronowa i liczba kłębuszkowa są często używane zamiennie. Ponieważ na nefron przypada tylko jeden kłębuszek nerkowych, ocena liczby kłębuszków nerkowych jest ważnym substytutem szacowania liczby nefronów.
Ocena wyposażenia nefronów i liczby nefronów jest interesująca klinicznie, ponieważ badania wykazały związek między wyposażeniem nefronów a zmniejszoną liczbą nefronów ze zwiększoną częstością występowania chorób sercowo-naczyniowych4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Opierając się na wynikach badań nerek podczas autopsji, Brenner zaobserwował, że osoby z nadciśnieniem tętniczym wykazywały niższą całkowitą liczbę nefronów niż osoby z prawidłowym ciśnieniem16. W związku z tym Brenner wysunął hipotezę, że istnieje odwrotna zależność między liczbą nefronów a ryzykiem rozwoju nadciśnienia w późniejszym życiu. Brenner wysunął również hipotezę, że zmniejszenie liczby nefronów zostało zrekompensowane przez nefrony, które pozostały. W celu utrzymania prawidłowego współczynnika filtracji w nerce, szczątkowe nefrony kompensują to poprzez zwiększenie powierzchni kłębuszków nerkowych (przerost kłębuszków nerkowych), działając w ten sposób nad złagodzeniem niekorzystnego wpływu utraty nefronów na czynność nerek4,16.
Podczas gdy ochrona w krótkim okresie, przerost kłębuszków nerkowych, w dłuższej perspektywie, prowadzi do zwiększonej retencji sodu i płynów, zwiększonej objętości płynu zewnątrzkomórkowego i wzrostu ciśnienia tętniczego krwi, prowadząc do błędnego koła dalszego wzrostu ciśnienia w naczyniach włosowatych kłębuszków nerkowych, przebarwienia kłębuszków nerkowych oraz bliznowacenia nefronów (stwardnienia) i urazów4,16.
Uzyskanie szacunków lub obliczeń liczby nefronów oferuje kilka eksperymentalnych korzyści: 1) dostarcza informacji dotyczących procesu nefrogenezy, który następnie może być powiązany z określonymi genami lub czynnikami w środowisku zarodkowym lub matczyno-płodowym, oraz 2) istnieje związek liczby nefronów z chorobami sercowo-naczyniowymi, a zatem istnieje możliwość, że szacunki liczby nefronów mogą być wykorzystane do przewidywania przyszłego ryzyka sercowo-naczyniowego2,17,18,19,20,21,22. Oprócz środowiska matczyno-płodowego, kilka chorób bezpośrednio wpływa na liczbę nefronów i czynność nerek, w tym miażdżyca, cukrzyca, nadciśnienie, a nawet normalne starzenie się2,9,10,11,12,22,23. Dlatego ocena liczby nefronów w całej nerce jest ważna, aby zrozumieć zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe, które wpływają na nefrogenezę (tj. wyposażenie nefronów) i liczbę nefronów w ciągu życia danej osoby i wynikający z tego wpływ na czynność nerek i zdrowie układu sercowo-naczyniowego.
Obecnie dostępnych jest kilka metod określania i ilościowego określania liczby nefronów, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia24,25,26,27,28,29,30. Zaawansowane metody określania liczby nefronów w całej nerce obejmują metody stereologiczne, takie jak metoda dyssektory/frakcjonowania oraz obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego25,26. Metoda dyssektoryzacji/frakcjonowania, często uważana za złoty standard w określaniu liczby nefronów w całej nerce, jest zarówno kosztowna, jak i czasochłonna. Ostatnie postępy i ulepszenia w obrazowaniu i przetwarzaniu rezonansu magnetycznego dostarczyły narzędzi do indywidualnego liczenia każdego nefronu. Jednak rezonans magnetyczny jest nie tylko czasochłonny, ale także niezwykle kosztowny. Ponadto zarówno metoda dyssektorycyjna/frakcjonująca, jak i rezonans magnetyczny wymagają zaawansowanej wiedzy technicznej, co ogranicza stosowanie tego typu metod w większości laboratoriów badawczych.
Większość metod określania liczby nefronów dokonuje obliczeń lub szacunków na podstawie identyfikacji kłębuszków nerkowych, ponieważ są one łatwo identyfikowalne strukturalnie. W artykule opisano i zademonstrowano metodę maceracji kwasowej do szacowania liczby nefronów w całej nerce27. Metoda maceracji kwasowej jest szybka, niezawodna i znacznie tańsza niż inne metody, takie jak metoda dyssektorycji/frakcjonowania i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego. Co więcej, metoda maceracji kwasowej zapewnia wysoce powtarzalne oszacowania liczby nefronów, które według doniesień mieszczą się w zakresie określonym za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego26.

<table><tbody><tr><td>Znieczulenie izofluranem</td> Abbott <td>Laboratories</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>System parownika izofluranu i przepływomierz</td><td>Braintree Scientific</td><td>VP I</td><td>Obejmuje zaopatrzenie w tlen klasy medycznej</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Leica LED DMIL Microsystems</td><td></td><td>DMIL LED</td><td>Dowolna marka również odpowiednia</td></tr><tr><td>Cyfrowa kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>2239</td><td>Dowolna marka również odpowiednie</td></tr><tr><td>nożyczki chirurgiczne ToughCut Fine</td><td>Fine Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Krawędź tnąca 25 mm, długość 11,5 cm; Końcówki: ostre-ostre; Kształt końcówki: proste</td></tr><tr><td>Mikro kleszcze preparacyjne 4 1/4 cala.</td><td>Biomed Res Instruments, Inc</td><td>10-1760</td><td>Zakrzywiona końcówka</td></tr><tr><td>Płyta z pleksiglasu 5 cali x 7 cali.</td><td>dowolne źródło odpowiednie</td><td>nie dotyczy</td><td>Dowolna marka nadaje się również</td></tr><tr><td>Sześciokątne naczynie wagowe z polistyrenu</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-2002-100</td><td>Dowolna marka również</td></tr><tr><td>odpowiednia Żyletki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Jednokrawędziowa stal węglowa 0,009</td></tr><tr><td>Gąbki z gazy 4 x 4 cale 8-warstwowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>MSD-1400250</td><td></td></tr><tr><td>10x koncentrat soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493-4L</td><td>Rozcieńczony do 1x&nbsp;</td></tr><tr><td>6 N Roztwór kwasu hydrocholowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3750-32</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>Dowolna marka nadaje się również 50</td></tr><tr><td>ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>Dowolna marka również odpowiednia</td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka 5 ml</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-07944-06</td><td>Dowolna marka nadaje się również</td></tr><tr><td>do jednorazowego użytku 18G1.5 igła</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td>Dowolna marka nadaje się również</td></tr><tr><td>do jednorazowej igły 21G1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5B</td><td>Dowolna marka nadaje się również</td></tr><tr><td>12-dołkowe wielodołkowe płytki do hodowli komórkowych z pokrywką</td><td>Cole Palmer</td><td>#FW-01959-06</td><td>Dowolna marka również odpowiednia</td></tr><tr><td>Modułowy stojak na probówki z polipropylenu</td><td>Cole Palmer</td><td>#EW-06733-00</td><td>Możliwość umieszczenia probówek stożkowych o pojemności 15 i 50 ml; dowolna marka również odpowiednia</td></tr></tbody></table>

oznaczanie liczby nefronów w całej nerce metodą maceracji kwasowej

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Wyposażenie nefronu odnosi się do całkowitej liczby nefronów, z którymi dana osoba się rodzi, ponieważ nefrosteneza u ludzi kończy się po 36 tygodniach ciąży i po urodzeniu nie powstają żadne nowe nefrony. Liczba nefronów odnosi się do całkowitej liczby nefronów zmierzonej w dowolnym momencie po urodzeniu. Zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe wpływają zarówno na wyposażenie, jak i liczbę nefronów. Zrozumienie, w jaki sposób określone geny lub czynniki wpływają na proces nefrogenezy oraz utraty lub zaniku nefronów, jest ważne, ponieważ uważa się, że osoby z niższym wyposażeniem lub liczbą nefronów są bardziej narażone na rozwój chorób nerek lub układu krążenia. Zrozumienie, w jaki sposób narażenie środowiskowe w ciągu życia danej osoby wpływa na liczbę nefronów, będzie również miało kluczowe znaczenie dla określenia przyszłego ryzyka choroby. W związku z tym zdolność do szybkiej i wiarygodnej oceny liczby nefronów w całej nerce jest podstawowym wymogiem eksperymentalnym pozwalającym lepiej zrozumieć mechanizmy, które przyczyniają się do lub promują nefrogenezę lub utratę nefronów. W tym miejscu opisujemy metodę maceracji kwasowej do szacowania liczby nefronów w całej nerce w oparciu o procedurę opisaną przez Damadiana, Shawayriego i Brickera, z niewielkimi modyfikacjami. Metoda maceracji kwasowej zapewnia szybkie i wiarygodne oszacowanie liczby nefronów (ocenianej przez zliczanie kłębuszków nerkowych), która mieści się w granicach 5% liczby oznaczonej przy użyciu bardziej zaawansowanych, choć kosztownych metod, takich jak rezonans magnetyczny. Co więcej, metoda maceracji kwasowej jest doskonałą metodą wysokoprzepustową do oceny liczby nefronów w dużej liczbie próbek lub warunkach eksperymentalnych.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne szacunki liczby nefronów w całej nerce w uznanym modelu nadciśnienia u myszy oraz genetycznym modelu przewlekłej choroby nerek związanej z wiekiem u szczura. Dla osób rozpoczynających pracę z metodą maceracji kwasowej wyróżniono kluczowe cechy identyfikacyjne kłębuszków, takie jak kulista struktura z dołączonymi lub bez dołączonych struktur przed- lub poarteriolarnych bądź cewkowych (Rysunek 1).
<p class="jove_content...

Szacunki liczby nefronów w całej nerce są ważne klinicznie i eksperymentalnie, ponieważ istnieje odwrotny związek między liczbą nefronów a zwiększonym ryzykiem chorób nerek i układu krążenia. W niniejszej pracy przedstawiono zastosowanie metody maceracji kwasowej, która zapewnia szybkie i wiarygodne oszacowanie liczby nefronów w całej nerce.

Oznaczanie liczby nefronów w całej nerce metodą maceracji kwasowej

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Metoda maceracji kwasowej może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące nerek i tego, w jaki sposób określone geny przyczyniają się do rozwoju nefronów lub wpływają na ich rozwój, a także jak określone schorzenia, takie jak cukrzyca lub nadciśnienie, wpływają na liczbę nefronów. Jest to ważne, ponieważ całkowita liczba nefronów, z którymi rodzą się osoby, jest określana podczas rozwoju płodu, a utrata nefronów jest związana z patologią nerek. Głównymi zaletami metody maceracji kwasowej jest to, że jest szybsza, bardziej powtarzalna, niedroga i mniej czasochłonna niż inne metody liczenia nefronów, takie jak rezonans magnetyczny.Technika ta ułatwia korelację wpływu liczby nefronów na czynność nerek, co jest ważne dla lepszego zrozumienia, w jaki sposób określone geny wpływają na funkcję i rozwój nefronów. Badanie genów lub czynników, które wpływają na ogólną liczbę nefronów, będzie miało zasadnicze znaczenie dla rozwoju metod farmakologicznych lub genetycznych mających na celu ograniczenie utraty nefronów związanych z chorobą. Dzięki dobrej technice eksperymentalnej i praktyce, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, powinny łatwo opanować metodę maceracji kwasowej, co pozwoli na wiarygodne i powtarzalne oszacowanie liczby nefronów w całej nerce.Zacznij od użycia cienkich nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć jamę brzuszną myszy wzdłuż linii środkowej. Ostrożnie przenieś jelita i tkankę tłuszczową rozrodczą na prawą stronę zwierzęcia. Stosując grubą sekcję, wyizoluj lewą nerkę i przetnij lewą tętnicę nerkową i żyłę, aby ostrożnie usunąć nerkę, umieszczając narząd w odpowiednio oznakowanej łodzi do ważenia PBS.Zbierz prawą nerkę w ten sam sposób i umieść obie nerki na gazie chirurgicznej wstępnie zwilżonej PBS. Szybko usuń wszelkie przylegające tkanki nienerkowe i torebki nerkowe. Następnie zważ każdą nerkę indywidualnie, rejestrując osobno wagę lewego i prawego narządu.Po zważeniu umieść każdą nerkę z powrotem w odpowiednio oznakowanej łodzi wagowej bez PBS i użyj czystej żyletki, aby przeciąć każdy narząd na pół wzdłuż. Umieść każdą połówkę nerki przeciętą stroną do dołu i pokrój każdą połówkę na dwa milimetry lub mniejsze kawałki. Za pomocą tej samej żyletki ostrożnie przenieś posiekane kawałki nerki do odpowiednio oznakowanej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.W dobrze wentylowanym dygestorium dodaj pięć mililitrów sześciomolowego kwasu solnego do każdej probówki. Następnie delikatnie wymieszaj mieszaniny kwasu nerkowego przed umieszczeniem probówek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut. Pod koniec maceracji kwasowej przymocować jedną igłę o rozmiarze 18 G do jednej pięciomililitrowej strzykawki na nerkę i ostrożnie wyjąć tłoki strzykawki.Umieść strzykawki w pojedynczych stożkowych probówkach o pojemności 50 mililitrów w dygestorii i wlej roztwory nerkowe do otwartego końca każdej strzykawki, odkładając puste probówki na bok w stojaku na probówki. Następnie ostrożnie wymień tłoki, aby powoli wytłaczać każdy roztwór przez igły do 50-mililitrowych probówek. Umyj 15-mililitrowe stożkowe probówki pięcioma mililitrami roztworu PBS na probówkę, obracając PBS w celu rozpuszczenia pozostałej tkanki nerkowej.Wyciśnij zawartość prania do odpowiedniej rurki o pojemności 50 mililitrów, jak pokazano poniżej. Po wyciśnięciu trzeciego płukania wyposażyć każdą strzykawkę w igłę o rozmiarze 21. Wyciśnij zawartość 50-mililitrowych probówek do drugiego zestawu 50-mililitrowych probówek przez mycie igłą o mniejszym otworze i trzykrotnie wytłaczając zawartość pierwszej 50-mililitrowej probówki świeżym PBS, jak pokazano.Po trzecim praniu i wytłaczaniu zwiększ całkowitą objętość w każdej tubie do 50 mililitrów za pomocą dodatkowego PBS i umieść rurki w stojaku na płycie kołyskowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W ciągu pięciu dni od przetworzenia umieść siatkę zawierającą 16 oddzielnych sekcji na dnie sześciu dołków 12-dołkowej płytki. Delikatnie odwróć probówki z roztworem nerkowym kilka razy, aby ponownie zawiesić granulowane tkanki.Ostrożnie dodać trzy 500 mikrolitrów podwielokrotności każdego homogenizowanego roztworu na nerkę do każdego z trzech dołków płytki 12-dołkowej. Rozcieńczyć zawartość każdej studzienki równą objętością PBS. Umieść płytkę na stoliku mikroskopu odwróconego.Zidentyfikuj kłębuszki nerkowe na podstawie ich kulistej struktury, czerwonawego odcienia oraz tętnic przed- lub końcowych przyczepionych do ciał poszczególnych kłębuszków nerkowych. Policz liczbę kłębuszków nerkowych na każdą sekcję z siatką, aby zsumować liczbę kłębuszków na siatkę w celu obliczenia całkowitej liczby kłębuszków na studzienkę. Następnie pomnóż liczbę kłębuszków nerkowych na studzienkę razy 100, aby uzyskać średnią liczbę kłębuszków nerkowych.W tym reprezentatywnym eksperymencie całkowita liczba nefronów u myszy, którym podawano nośnik przez 14 dni, wynosiła około 12 500 nefronów na nerkę. Infuzja angiotensyny drugiej zwiększyła jednak ciśnienie przedsionkowe o około 40 milimetrów słupa rtęci i wiązała się ze znaczącym, prawie 26% zmniejszeniem całkowitej liczby nefronów. W tym genetycznym modelu agenezji nerek szczurów obliczono, że zwierzęta urodzone z dwiema nerkami zawierają około 27 500 nefronów na nerkę po maceracji kwasowej, jak wykazano, podczas gdy szczury urodzone z pojedynczą nerką miały znacznie niższą całkowitą liczbę nefronów.Szacunki z obu eksperymentów były zgodne z zakresami wcześniej zgłaszanymi u szczurów. Metoda maceracji kwasowej idealnie nadaje się do szacowania liczby nefronów w całych nerkach, zwłaszcza w laboratoriach, które nie są wyposażone w bardziej pracochłonne i kosztowne techniki liczenia nefronów, takie jak metoda frakcjonowania disektorowego lub rezonans magnetyczny. Metoda ta pozwala na wysokoprzepustowe, wydajne i powtarzalne oszacowanie liczby nefronów w całej nerce, które mieszczą się w granicach 5% liczb określonych za pomocą rezonansu magnetycznego.Ocena liczby nefronów ma znaczenie kliniczne, ponieważ zmniejszona liczba nefronów wiąże się ze zwiększonym ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych, takich jak przewlekła choroba nerek. Nie zapominaj, że praca z kwasem solnym może być bardzo niebezpieczna i że należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego.

estimation-nephron-number-whole-kidney-using-acid-maceration

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje test do barwienia mysich nerek metodą całościową przy użyciu metody oczyszczania tkanek zwanej CUBIC (clear, unstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis) i barwienia immunofluorescencyjnego. Nerka jest poddawana oczyszczaniu tkanek, w którym nerka jest odlipidowana, odbarwiana i traktowana roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła, aby tkanka była przezroczysta dla optymalnego obrazowania trójwymiarowego. Tkanka jest barwiona...

Technika barwienia całego narządu do trójwymiarowego obrazowania nerki

Technika wykorzystująca mikroskopię 2-fotonową intavital o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określenia filtracji gloemrarnej w kłębuszkach nerkowych na powierzchni. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie charakterystyk przepuszczalności makrocząsteczek zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami.  Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Platforma eksperymentalna moksowania może unieruchamiać szczury bez ograniczeń, a szczury mogą być poddawane wielopunktowej moksterapii w stanie czuwania, zapewniając dobrostan szczurów, chroniąc bezpieczeństwo operatorów, zapewniając skuteczność terapeutyczną i poprawiając efektywność eksperymentu.

Stosowanie moksyterapii oddzielonej ciastkami ziołowymi w leczeniu szczurów z przewlekłą niewydolnością nerek

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

Obecny protokół opisuje tworzenie zwierzęcego modelu nefropatii błoniastej (MN) oraz jak hamowanie Kemeng Fanga zmniejsza apoptozę podocytów szczurów MN poprzez aktywację szlaku sygnałowego PI3K/AKT.

Mechanizm hamowania apoptozy podocytów przez Kemeng Fang u szczurów z nefropatią błoniastą poprzez szlak sygnałowy PI3K / AKT

Naucz się szybkiej i niezawodnej metody maceracji kwasowej do oznaczania liczby nefronów w całej nerce. Technika ta umożliwia badanie wpływu genów i czynników środowiskowych na rozwój oraz utratę nefronów.

Oznaczanie liczby nefronów w całej nerce metodą maceracji kwasowej

Przeglądaj więcej filmów