Name: Pomiar i interpretacja wskaźników zużycia tlenu w całych segmentach głowy muchy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj nową technikę pomiaru zużycia tlenu w całych głowach Drosophila, która odzwierciedla fizjologiczne warunki. Metoda umożliwia badanie zmian metabolicznych podczas starzenia i postępu chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Andreasowi Ladurnerowi, Carli Margulis i ich zespołom za szerokie wsparcie eksperymentalne. Dziękujemy Caitlin Ondracek za jej komentarze do manuskryptu. Chcielibyśmy podziękować Sofii Vikström za pomoc w ustaleniu wczesnych faz tej techniki. Dziękujemy również May Sanderhoff za pomoc techniczną. LB jest finansowany przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (grant infrastrukturalny 01KX1012). SP został sfinansowany ze stypendium podoktorskiego AXA Research Fund oraz NSFC (Grant numer 81870900). AVV jest finansowany przez QBM.

1. Przygotowanie instrumentu
Uwaga: Do tego eksperymentu użyliśmy urządzenia Seahorse XF24 z "płytami wysepek". Działanie tej techniki wykorzystuje różne cykle mieszania, oczekiwania i pomiarów, a także możliwość dodawania substancji do komory pomiarowej.
<ol>
	<li>Włącz maszynę na długo przed rozpoczęciem eksperymentu, aby było wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie żądanej temperatury i pozostanie stabilne.</li>
	<li>W ustawieniach oprogramowania (tryb administracyjny) wybierz długość kalibracji wkładu (tutaj wybrano 20 minut) i żądaną temperaturę. 
	Uwaga: Podczas gdy pomiary mitochondriów lub tkanek ssaków są zwykle przeprowadzane w temperaturze 37 °C, temperatura otoczenia głowy muchy wynosi 25 °C, ale wyniki pomiarów w temperaturze 31 °C są publikowane. Użyliśmy 31 °C, ponieważ jest to najniższe ustawienie temperatury dla urządzenia w temperaturze pokojowej. Aby osiągnąć temperaturę 25 °C lub niższą, umieść maszynę w chłodniejszym pomieszczeniu lub w temperaturze 11 °C, jak ostatnio opublikowano21.</li>
	<li>W oprogramowaniu należy zastosować następujący protokół: 3 min mieszanie – 2 min oczekiwanie – 2 min pomiaru. W zależności od projektu eksperymentalnego, dodaj etapy wtrysku z portów A-D po wybranym kroku pomiaru.
	<ol>
		<li>W celu sprawdzenia jakości i określenia podstawowego OCR, należy odczekać co najmniej trzy cykle pomiarowe przed wstrzyknięciem pierwszego leku przez port A. Szczegółowy harmonogram protokołu można znaleźć w odnośniku Becker i wsp.13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie wkładu
<ol>
	<li>Wstępną kalibrację wkładu należy przeprowadzić dzień (lub co najmniej 4 godziny) przed badaniem. Dodać 1,0 ml Calibrant (pH 7,4) do każdego dołka i umieścić wkład czujnika na wierzchu płytki i przechowywać w temperaturze 37 °C bez CO2 przez noc lub do 72 godzin. Zapobiegaj parowaniu wkładu z parafilmem, jeśli jest on uwodniony przez ponad 24 godziny.</li>
	<li>Upewnij się, że eksperymentalne leki są dobrze rozpuszczone w pożywce (świeże podłoże + 2,5% glukozy) przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Zmierzyć i dostosować pH roztworu leku do pH nośnika w żądanej temperaturze, aby uniknąć jakiejkolwiek różnicy pH podczas wstrzykiwania leku.</li>
	<li>Odpipetować roztwór leku do przydzielonego mu portu iniekcyjnego. Na przykład użyj 77 μl dla portu A, aby uzyskać rozcieńczenie 1:10 w roztworze o stężeniu 770 μl, a następnie 85 μl dla portu B.</li>
	<li>Załaduj wkład do urządzenia i rozpocznij kalibrację.</li>
</ol>
3. Przygotowanie talerza
Uwaga: Zdecydowanie zaleca się, aby dwie osoby przygotowały talerz jednocześnie. Czas przygotowania jednej płytki na dwie osoby może wymagać ~45-60 minut.
<ol>
	<li>Dostosuj świeżo przygotowane podłoże + 2,5% glukozy do pożądanego pH za pomocą 1 N HCl. Upewnij się, że zmiany temperatury nie mają wpływu na pH.</li>
	<li>Przygotuj pojemnik na lód i połóż metalowy talerz na lodzie.</li>
	<li>Otworzyć opakowanie płytki wysepek (płytki 24-dołkowej) i zanurzyć sieci na szalce Petriego (92 mm x 16 mm) z podłożem.</li>
	<li>Zbierz jedną siatkę za pomocą podajnika (małego instrumentu, który mocno umieszcza siatkę w studzience) i niech podajnik stanie obok mikroskopu. Dodaj małą kroplę pożywki do siatki dołączonej do podajnika.</li>
	<li>Znieczulenie much (używano tu tygodniowych lub 4-tygodniowych samców kantońskich), umieszczając muchy na lodowatej metalowej płytce.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy chwyć brzuch muchy i zanurz go w pożywce na szalce Petriego pod mikroskopem.</li>
	<li>Za pomocą drugiej pary kleszczy delikatnie usuń głowę muchy. Umieść go na środku siatki przymocowanej do podajnika i sprawdź, czy głowica jest zanurzona w nośniku.</li>
	<li>Wyśrodkuj głowy, gdy w siatce jest ich 16. Usuń zbędny płyn przed wyśrodkowaniem głowic, aby zapobiec utracie główek podczas umieszczania ich w studzience. 
	Uwaga: Użyto 16 głowic muchowych, ponieważ liczba ta dawała wystarczające i stabilne dane w rozsądnym czasie przygotowania płytki podczas ustalania metody.</li>
	<li>Za pomocą podajnika umieść siatkę w studni. Upewnij się, że głowice są uwięzione pod siatką. Powoli dodawaj 700 μl pożywki + 2,5% glukozy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Powtórz proces dla każdej ze studzienek. 
	Uwaga: Zaleca się 20 dołków z próbkami głowic muchowych i 4 puste studzienki do kalibracji tła na płytkę. Upewnij się, że puste studzienki zawierają również siatkę z 700 μl buforu + 2,5% glukozy.</li>
	<li>Sprawdź studzienki pod siatkami pod mikroskopem pod pęcherzykami powietrza. Delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Trzymaj głowice wyśrodkowane, aby uzyskać wiarygodny odczyt OCR.</li>
	<li>Dodaj płytkę do maszyny i rozpocznij pomiar.</li>
</ol>
4. Analiza pomiarów OCR
<ol>
	<li>Na końcu protokołu wyjmij wkład.</li>
	<li>W ramach kontroli jakości należy zwrócić uwagę na wszelkie widoczne resztki w wypełnieniach portu. Wyrzuć wkład i płytkę (opcja 1), jeśli głowice nie mają być używane do ekstrakcji białka, np. (patrz opcja 2).</li>
	<li>Wyodrębnij pliki arkusza kalkulacyjnego i sprawdź jakość każdej studzienki pod kątem poziomu tlenu i pH. Upewnij się, że studzienki tła nie wykazują OCR i że poziom tlenu jest stabilny.
	<ol>
		<li>Użyj algorytmu do analizy danych, z których część można wybrać w odpowiednim oprogramowaniu. Użyj algorytmu AKOS dla wartości OCR2 jeśli zakres poziomów tlenu podczas całego pomiaru, między pierwszym a ostatnim wskazem (= podpomiar) jest podobny między dwiema próbkami biologicznymi, a poziom tlenu w ostatnich tyknięciach nie jest niższy niż 95 (mmHg) (OCR głowic jest wyraźnie niższy przy tym poziomie tlenu), (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Niektóre warunki spowodują, że próbka wygeneruje szybki OCR i może wykazywać niższy poziom tlenu podczas 1st tick i/lub w ostatnim ticku (anoxia) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). W takim scenariuszu należy użyć alternatywnej metody pomiaru, takiej jak algorytm FIXED. W przypadku anoksji OCR jest znacznie zmniejszony ze względu na niski poziom tlenu w roztworze. W związku z tym algorytm AKOS daje mylące odczyty. 
		Uwaga: Nowsza maszyna nie ma algorytmu FIXED. Dlatego preferowane jest wyodrębnienie całkowitego poziomu tlenu i wykreślenie szybkości na czas dla pierwszych 3-5 tyknięć (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. (Opcja 2) Analiza biochemiczna segmentu głowy
<ol>
	<li>Aby zmierzyć właściwości biochemiczne (metabolity, proteom itp.) segmentu głowy, należy dostosować czas pracy do wymagań, jednak w każdej chwili możliwe jest przerwanie protokołu i usunięcie płytki.</li>
	<li>Po wyjęciu płytki użyj niezaostrzonych kleszczy, aby zrobić otwór w siatce i usuń go, uwalniając w ten sposób głowice do pływania.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml z odciętą końcówką przenieść główki do fiolki.</li>
	<li>Szybko wyrzuć bufor i zatrzaskowo zamroź głowice w ciekłym azocie. Przechowuj głowice w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWallace%2C+DC+%22Mitochondrial+diseases+in+man+and+mouse%22">Mitochondrial diseases in man and mouse</a>. 283 (5407), Science. New York, N.Y. 1482-1488 (1999).</li>
<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Cunnane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+fuel+metabolism%2C+aging%2C+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease.</a> Nutrition. 27 (1), Burbank, Los Angeles County, Calif. 3-20 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+Y+%22Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals%3A+Untangling+the+knot%22">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot</a>. 350 (6265), Science. New York, N.Y. 1204-1207 (2015).</li>
<li>Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+energetics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial energetics and therapeutics.</a> Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mitochondrial+dysfunction+as+a+strategy+for+targeting+tumour+cells+in+metabolically+compromised+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments.</a> Nature communications. 5, 3295(2014).</li>
<li>Wheaton, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+inhibits+mitochondrial+complex+I+of+cancer+cells+to+reduce+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis.</a> eLife. 3, e02242(2014).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS one. 6 (3), e18317(2011).</li>
<li>Baker, D. J., Peleg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+Modeling+of+Mitochondrial+Metabolism+Dysregulation+during+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Biphasic Modeling of Mitochondrial Metabolism Dysregulation during Aging.</a> Trends in biochemical sciences. 42 (9), 702-711 (2017).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhao%2C+S+%22Regulation+of+cellular+metabolism+by+protein+lysine+acetylation%22">Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation</a>. 327 (5968), Science. New York, N.Y. 1000-1004 (2010).</li>
<li>Baeza, J., Smallegan, M. J., Denu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Dynamics+of+Protein+Acetylation+in+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Dynamics of Protein Acetylation in Mitochondria.</a> Trends in biochemical sciences. 41 (3), 231-244 (2016).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li>
<li>Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., de Angelis, M. H., Peleg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+transient+oxygen+consumption+increase+following+acute+HDAC%2FKDAC+inhibition+in+Drosophila+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue.</a> Scientific reports. 8 (1), 4199(2018).</li>
<li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).</li>
<li>Newell, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNewell%2C+C+%22Physiological+Entomology%22">Physiological Entomology</a>. 41, 96-102 (2016).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS one. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Wikstrom, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+assay+for+islet+respiration+reveals+uncoupling+of+rodent+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets.</a> PloS one. 7 (5), e33023(2012).</li>
<li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 11 (10), 1798-1816 (2016).</li>
<li>Kumar, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+a+Zebrafish+Model+of+Dravet+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Altered Glycolysis and Mitochondrial Respiration in a Zebrafish Model of Dravet Syndrome.</a> eNeuro. 3 (2), (2016).</li>
<li>Neville, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+method+for+measuring+whole+brain+metabolism+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems.</a> Journal of neuroscience. 296, 32-43 (2018).</li>
<li>Neville, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Analysis+of+Drosophila+melanogaster+Larval+and+Adult+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (138), (2018).</li>
<li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+extension+by+targeting+a+link+between+metabolism+and+histone+acetylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila.</a> EMBO reports. 17 (3), 455-469 (2016).</li>
<li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeleg%2C+S+%22Altered+histone+acetylation+is+associated+with+age-dependent+memory+impairment+in+mice%22">Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice</a>. 328 (5979), Science. New York, N.Y. 753-756 (2010).</li>
<li>Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+world+of+protein+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The world of protein acetylation.</a> Biochimica et biophysica acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).</li>
<li>Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+the+life+span%2C+vitality+and+fine+structure+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of ageing and development. 5 (5), 347-370 (1976).</li>
<li>Banh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTP1B+controls+non-mitochondrial+oxygen+consumption+by+regulating+RNF213+to+promote+tumour+survival+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia.</a> Nature cell biology. 18 (7), 803-813 (2016).</li>
<li>Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+and+their+inhibitors+in+cancer%2C+neurological+diseases+and+immune+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders.</a> Nature reviews. Drug discovery. 13 (9), 673-691 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Nasza nowa technika oferuje nowatorskie podejście do badania zmian metabolicznych związanych ze starzeniem się i chorobami w kontekście całych segmentów głowy muchy22. Metoda może być również odpowiednia do badania wpływu maślanu sodu KDAC na zużycie tlenu. Jak wykazaliśmy, inhibitory deacetlyazy lizyny (HDAC/KDAC) powodują zmiany OCR. Zasadniczo, ponieważ cele takich inhibitorów zwykle nie są zlokalizowane w mitochondriach (inhibitory te nie wpływają na deacetylazy klasy III, sirtuiny)24, takie leki można było testować tylko na poziomie co najmniej tkankowym. Rzeczywiście, różne leki są wstrzykiwane bezpośrednio do mózgu, omijając w ten sposób ewentualne przetwarzanie/modyfikację/inaktywację przez układ trawienny. W związku z tym nasza technika oferuje nowy wgląd w to, w jaki sposób takie leki bezpośrednio wpływają na segment głowy.
Istnieje kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, jak stwierdzono w protokole, zdecydowanie zalecamy przygotowanie talerza w ciągu jednej godziny, przy czym dwie pary rąk przygotowują talerz. Z naszego doświadczenia wynika, że jakość i stabilność pomiarów OCR jest lepsza, gdy są przygotowywane w odpowiednim czasie. Gdy trwa to zbyt długo, zwiększa się występowanie dołków o niskim OCR, a także krótszy czas trwania stabilnego OCR. Po drugie, ważne jest, aby przeprowadzić kontrolę jakości i upewnić się, że warunki eksperymentalne między różnymi próbkami są podobne (pH, poziom tlenu). Wreszcie, krytycznym krokiem jest wybór odpowiedniego algorytmu do analizy próbek. Jak wykazaliśmy, domyślny algorytm AKOS dawał mylące, a czasem przeciwstawne obliczenia w próbkach, które zużywały tlen w wysokim tempie13. W związku z tym podkreślamy znaczenie sprawdzania surowych danych pod kątem poziomu tlenu i porównywania wynikowych OCR.
Obecnie istnieje kilka ograniczeń związanych z tą techniką. W temperaturze pokojowej maszyna nagrzewa się do 31 °C (jest to minimalna temperatura pomiaru, gdy maszyna znajduje się w temperaturze pokojowej), co może stanowić stan naprężenia dla głowic muchowych25. Można temu jednak zaradzić, umieszczając maszynę w chłodni, co umożliwi pomiary w temperaturze 25 °C, a tym samym bez ewentualnego naprężenia cieplnego głowic muchowych. Ostatnie doniesienia wykazały, że maszyna jest ustawiana w temperaturze 11 °C, co umożliwia rejestrację much w temperaturze OCR w temperaturze 25 °C21. Niemniej jednak separacja głowy muchy powinna być wykonywana w temperaturze pokojowej. Co więcej, wahania temperatury utrudniają kontrolowanie zmian pH, dlatego zdecydowanie zaleca się testowanie wpływu warunków fizjologicznych/leków na OCR przy użyciu podobnych konfiguracji eksperymentalnych. Ponadto nie ustalono jeszcze udziału zużycia tlenu w mechanizmach nieniezależnych od mitochondriów26. Dzięki zastosowaniu różnych inhibitorów układu oddechowego, które są skuteczne w głowach much, możliwe byłoby ustalenie takich niemitochondrialnych wskaźników zużycia tlenu.
Warto zauważyć, że różne choroby ssaków charakteryzują się zmianami w metabolizmie energetycznym. Wśród nich są choroby, które charakteryzują się albo zmniejszeniem metabolizmu, takim jak choroba Alzheimera, albo przeprogramowaniem metabolicznym, takim jak rak. Co ciekawe, inhibitory KDAC są stosowane zarówno w chorobie Alzheimera, jak i w leczeniu raka27. Podczas gdy dokładne mechanizmy, za pomocą których inhibitory KDAC osiągają aspekt terapeutyczny, pozostają niejasne, dane z naszej techniki wspierają nowatorski pogląd, że takie inhibitory mogą modulować metabolizm.
Podsumowując, metoda ta jest cenna do pomiaru ogólnych wskaźników zużycia tlenu in vivo i dokładniej pokazuje wpływ leku na ogólny metabolizm, który może zostać pominięty w izolowanych protokołach mitochondriów12. Na przykład, wyniki uzyskane tą metodą, a nie poprzednimi technikami, pozwoliły na uzyskanie nowych informacji na temat związanej z wiekiem elastyczności metabolicznej podczas leczenia KDAC. Chociaż konieczne są dodatkowe prace w celu optymalizacji warunków eksperymentalnych dla głów much, połączenie naszej techniki i odpowiedniej analizy może prowadzić do dalszego wyjaśnienia aktywności mitochondriów w kontekście całych żywych tkanek.

Regulowana aktywność metaboliczna jest niezbędna dla przetrwania komórek i zdrowego funkcjonowania tkanki. Wykazano, że rozregulowana aktywność metaboliczna jest powiązana z początkiem i progresją różnych dolegliwości1. Na przykład niższa aktywność metaboliczna została wcześniej opisana w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i związane z wiekiem upośledzenie pamięci2,3. Ponadto uważa się, że dysfunkcja mitochondriów jest przyczynowo zaangażowana w proces starzenia4,5. Z drugiej strony, wyższe tempo mitochondriów i metabolizmu opisano w komórkach nowotworowych6, gdzie zastosowanie inhibitorów mitochondriów zmniejszyło nowotworzenie 7.
Jednym z odczytów aktywności metabolicznej jest wskaźnik zużycia tlenu (OCR) w mitochondriach. Co ciekawe, tego typu odczyt uzyskuje się przede wszystkim z izolowanych mitochondriów lub komórek, stąd większość tego, co jest opisywane w literaturze, opiera się głównie na odczycie, który nie przypomina stanu fizjologicznego. Technika ta ma jednak kilka wad. Po pierwsze, protokół izolacji mitochondriów może potencjalnie uszkodzić jego integralność8, co może być istotnym artefaktem przy porównywaniu mitochondriów wyizolowanych z młodych i starszych tkanek9. Co więcej, proces izolacji jest długi i może skutkować utratą istotnych modyfikacji potranslacyjnych białek, które regulują funkcję mitochondriów9,10,11. Co więcej, wykazano, że izolowane mitochondria nie reprezentują konsekwentnie tempa metabolizmu całych tkanek12,13. Taka biologiczna złożoność komórkowa może być postrzegana jako "całość jest większa niż suma jej części", tj. mitochondria mogą wykazywać różne tempo metabolizmu wewnątrz złożonej komórki w porównaniu z ich tempem metabolizmu po izolacji.
Chociaż komórki mogą oferować lepszy odczyt OCR niż izolowane mitochondria, komunikacja między komórkami w kontekście całej tkanki może zostać utracona. Na przykład w mózgu aktywność metaboliczna neuronów jest w dużym stopniu zależna od aktywności metabolicznej sąsiednich komórek glejowych14. W związku z tym ustanowienie nowych technik badania OCR w całej tkance lub całych organizmach może okazać się bardziej wnikliwe w zakresie występowania i progresji różnych zaburzeń.
Ostatnio pojawiły się nowe techniki rozwiązywania tych problemów i umożliwiania pomiaru OCR z całej tkanki, segmentu lub żywych organizmów. Na przykład w niedawnej pracy opisano pomiar tlenu z mięśnia lotu chrząszcza przy użyciu podejścia z włókien przepuszczalnych z respirometrem15. Nowe aparaty do mikrorespirometrii pozwalają na pomiar OCR wysp trzustkowych16,17. W związku z tym doniesiono, że technologia ta umożliwia pomiar OCR z całych robaków18 i Zebra fish19. Jednak obecność bariery trawiennej może stanowić wyzwanie dla testowania różnych leków w kontekście zmian OCR. Co ciekawe, ostatnie doniesienia Neville'a i współpracowników wykazały nową technikę pomiaru mózgu pojedynczej larwy marogona za pomocą płytki studziennej20,21.
W tym badaniu użyliśmy podobnej konfiguracji, aby umożliwić pomiar całego OCR od cało- żywych i nieruchliwych Drosophila22. Technika ta oferuje również drugorzędną przewagę w mierzeniu wpływu różnych leków na aktywność metaboliczną w całym segmencie, bez konieczności przechodzenia przez barierę układu pokarmowego13,22. Na przykład, wcześniej wykazano, że bezpośrednie wstrzyknięcie inhibitora deacetylazy lizyny (KDACi), leku, który uważa się za zmieniający mechanizm epigenetyczny w mózgu, spowodowało poprawę tworzenia wspomnień23. Jednak dzięki zastosowaniu naszej nowatorskiej techniki odkryliśmy, że hamowanie KDAC spowodowało szybki wzrost OCR, który sam w sobie może być czynnikiem przyczyniającym się do aktywności neuronalnej. Nasz protokół zapewnia prostą i nowatorską metodę oceny wpływu różnych leków, manipulacji genetycznych czy stanów fizjologicznych (choroba, starzenie się) na OCR w kontekście całej głowy.

<table><tbody><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8644</td><td>D-(+)-Roztwór glukozy 100 g/L w H2O, sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>test XF Podłoże</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td>Seahorse XF DMEM Pożywka, pH 7,4</td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Merck</td><td>817500</td><td>Rozpuszczony w buforze do oznaczania XF</td></tr><tr><td>Analizator Seahorse XF24/e24</td> Zestaw do testów zewnątrzkomórkowych <td>Agilent</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>XF24/e24Agilent</td><td>100850-001</td><td>Kartridż</td></tr><tr><td>XF24/e24 Mikropłytki do przechwytywania wysepek</td><td>Agilent</td><td>101122-100</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>do wstawiania ekranu przechwytywania konika morskiego</td><td>Agilent</td><td>101135-10</td><td>Wkładka</td></tr><tr><td>Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>821,472</td> szalka <td>Petriego 92 x 16 mm</td></tr></tbody></table>

pomiar i interpretacja wskaźników zużycia tlenu w całych segmentach głowy muchy

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulowana aktywność metaboliczna jest niezbędna do normalnego funkcjonowania żywych komórek. Rzeczywiście, zmieniona aktywność metaboliczna jest przyczynowo związana z postępem raka, cukrzycą, neurodegeneracją i starzeniem się, żeby wymienić tylko kilka. Na przykład zmiany w aktywności mitochondriów, metabolicznej elektrowni komórki, zostały scharakteryzowane w wielu takich chorobach. Ogólnie rzecz biorąc, wskaźniki zużycia tlenu w mitochondriach uważano za wiarygodny odczyt aktywności mitochondriów, a pomiary w niektórych z tych badań opierały się na izolowanych mitochondriach lub komórkach. Jednak takie warunki mogą nie reprezentować złożoności całej tkanki. Niedawno opracowaliśmy nowatorską metodę, która umożliwia dynamiczny pomiar wskaźników zużycia tlenu z całych izolowanych głów much. Stosując tę metodę, odnotowaliśmy niższe wskaźniki zużycia tlenu w całym segmencie głowy u młodych i starszych muszek. Po drugie, odkryliśmy, że inhibitory deacetylazy lizyny szybko zmieniają zużycie tlenu w całej głowie. Nasza nowatorska technika może zatem pomóc w odkryciu nowych właściwości różnych leków, które mogą wpływać na tempo metabolizmu. Co więcej, nasza metoda może dać lepsze zrozumienie zachowań metabolicznych w konfiguracji eksperymentalnej, która bardziej przypomina stany fizjologiczne.

Zdolność do rejestracji wysokiej jakości pomiarów OCR zależy od wycentrowania główki na środku siatki (Rysunek 1). Jest to istotne w przypadku urządzenia XF24, które posiada dość mały punkt czujnika tlenu w porównaniu do nowszego urządzenia XFe24, w którym czujnik jest większy. Jak wykazano wcześniej, centrowanie główek pozwala na uzyskanie stabilnego OCR przez co najmniej 20 kolejnych pomiarów u młodych much13.
Kluczowym aspektem korzystania z urządzeń jest zastosowanie właściwej analizy. Zaleca się monitorowanie poziomów tlenu podczas eksperymentów. Każdy pomiar trwający 2 min jest podzielony na 10 podpomiarów (tiksów). Dołek zawierający 16 zdrowych głów zazwyczaj wykazuje ciśnienie parcjalne tlenu (pO2) na poziomie 140-170 (mmHg) podczas pierwszego tiksu. W pierwszym przykładzie porównaliśmy głowy młodych i dojrzałych much (Rysunek 2A i 2B). Choć poziomy tlenu spadają szybciej w głowach osobników w średnim wieku, zaobserwowana różnica jest niewielka (Rysunek 2A). Ponadto zakres poziomów tlenu jest podobny w obu warunkach, od 165 podczas pierwszego tiksu do 120 podczas ostatniego tiksu. W takim przypadku preferowane jest użycie algorytmu AKOS do automatycznego wygenerowania OCR (pmol/min)2, który wiarygodnie odzwierciedla spadek poziomu tlenu w głowach młodych versus dojrzałych osobników (Rysunek 2B). Warto zauważyć, że program analityczny urządzenia automatycznie wybiera algorytm AKOS.
Jednakże, w oparciu o nasze obserwacje, automatyczne stosowanie algorytmu AKOS może prowadzić do mylących, a nawet przeciwstawnych wyników w odniesieniu do prawidłowego OCR. Takie artefakty mogą powstawać w warunkach wysokiego zużycia tlenu przez próbkę, prowadzącego do anoksji13,22. Na przykład dodanie maślanu sodu (SB), inhibitora KDAC, przejściowo zmienia dynamikę poziomów tlenu (Rysunek 3A). Podczas gdy w kontrolach z nośnikiem obserwuje się stabilne poziomy tlenu podczas pierwszego i ostatniego cyklu (tick), dodanie SB powoduje znaczny i przejściowy spadek poziomów tlenu w tych cyklach (Rysunek 3A). Sam SB nie zmienia poziomów tlenu w dołkach tła, w których nie dodano głowic (dane nie pokazane). Dane te potwierdzają tezę, że SB zwiększa zużycie tlenu. Ponieważ rejestracja pierwszego cyklu jest opóźniona (12 sekund do momentu zapisu pierwszego cyklu w fazie pomiarowej), pierwszy punkt danych w dołkach traktowanych SB jest już niższy. W związku z tym trudno jest uchwycić wczesne zmiany w zużyciu tlenu następujące po dodaniu tego inhibitora HDAC. Co więcej, poziomy tlenu w próbkach traktowanych SB są zredukowane do już niskich wartości (anoksja), co wskazują dane z ostatnich cykli. W stanie anoksji głowice spowalniają zużycie tlenu w ostatnich cyklach (Rysunek 3A). Ponieważ obliczenia AKOS uwzględniają wszystkie cykle i ignorują stan anoksji, generują one mylący wynik OCR. Rzeczywiście, nienormowane poziomy OCR oparte na AKOS wykazują niewielkie zmiany po wstrzyknięciu (linia przerywana) z portu A (Veh/SB) (Rysunek 3B).
Normalizacja poziomów OCR do pomiaru przed wstrzyknięciem na podstawie AKOS wykazuje bardzo podobne poziomy OCR przed i po wstrzyknięciu do portu A, co nie potwierdza zmian poziomu tlenu (Rysunek 3A). W takich okolicznościach zaleca się stosowanie algorytmu FIXED, który dokładniej modeluje/przypomina zmiany OCR i poziomu tlenu (Rysunek 3C). W konsekwencji pomiar znormalizowany na podstawie algorytmu FIXED wykazuje zwiększony OCR po zastosowaniu SB (Rysunek 3C).
Wadą nowej maszyny jest brak algorytmu FIXED. Dlatego w eksperymentach, w których wykorzystywane są próbki lub preparaty o wysokim zużyciu, zaleca się ręczne obliczanie pomiarów OCR poprzez wyznaczanie spadku poziomu tlenu w czasie dla pierwszych 3-5 odczytów w każdym pomiarze.
<img alt="Przygotowanie eksperymentu na szalce Petriego z wykorzystaniem mikropipety do analizy komórkowej lub pobierania próbek tkanek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Przykład dołka zawierającego 16 głów samców much w wieku jednego tygodnia. Głowy są wycentrowane pod siatką i unoszą się w medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Poziomy tlenu i wyniki OCR; wykresy porównujące grupę młodych i średnio starych osobników w czasie oraz pomiary." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywny przykład porównania pomiaru OCR między głowami much w wieku jednego tygodnia (młode) i czterech tygodni (średnio stare). (A) Poziomy tlenu przedstawiono dla trzech oddzielnych pomiarów; każdy 2 min pomiar jest podzielony na dziesięć pomiarów cząstkowych (kreski). (B) Kwantyfikacja (A). Poziomy pierwszej i ostatniej kreski są podobne, choć poziomy w próbce osobników średnio starych są nieco niższe. Kwantyfikacja nachylenia spadku poziomu tlenu jest wykorzystywana do wyznaczenia poziomów OCR. Jak opisano wcześniej22, OCR u much średnio starych jest o 10%-15% wyższy niż u much młodych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy tempa zużycia tlenu; efekty maślanu sodu; analiza OCR, słupki błędu wskazują wariancję." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przykład zmiany OCR pod wpływem maślanu sodu (SB) w głowach młodych much. (A) Poziomy tlenu zapisane z siedmiu pomiarów po dodaniu 15 mM SB. Linia przerywana oznacza wtryśnięcie leku (lub nośnika) z portu A. Warto zauważyć, że podczas gdy poziomy tlenu w punktach 1 i 10 pozostają stabilne w grupie kontrolnej (kolor niebieski), poziomy tlenu w tych punktach są przejściowo (przez sześć pomiarów po wtryśnięciu) obniżone w próbkach traktowanych SB (kolor pomarańczowy). Dodatkowo, spadek poziomów tlenu jest znacznie mniejszy podczas ostatnich punktów w próbkach traktowanych SB. N=3 na grupę (B) [Lewo] Nienormalizowane poziomy OCR obliczone za pomocą algorytmu AKOS. Obliczenia błędnie wykazują podobne poziomy OCR przed i po wtryśnięciu SB przez port A. [Prawo] Normalizacja OCR do pomiaru przed wtryśnięciem z portu A. (C) [Lewo] Obliczenia z „poprawionego” algorytmu dla (A) wykazujące nienormalizowany OCR. Tutaj OCR ściśle odzwierciedla przejściowy wzrost zużycia tlenu w głowach po traktowaniu SB; [Prawo] Normalizacja OCR do pomiaru przed wtryśnięciem z portu A. Słupki błędu na wszystkich wykresach wskazują S.E.M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Pomiar zmian w tempie przemiany materii jest kluczowy dla zrozumienia postępu różnych chorób i starzenia się. W tym miejscu przedstawiamy nową technikę pomiaru zużycia tlenu w całej głowie, która bardziej przypomina stan fizjologiczny i może pomóc w ujawnieniu nowych leków modyfikujących aktywność mitochondriów.

Pomiar i interpretacja wskaźników zużycia tlenu w całych segmentach głowy muchy

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metabolizmu, takie jak, w jaki sposób aktywność metaboliczna jest zmieniana podczas procesu starzenia. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie nienaruszonego segmentu ciała, który posiada dane bardzo zbliżone do stanu naturalnego i fizjologicznego w porównaniu z klasyczną izolacją mitochondrialną. Procedurę zademonstrują Anuroop i Annika, studentka w moim laboratorium.Aby rozpocząć protokół, włącz maszynę na godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu, aby było wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie żądanej temperatury i utrzymanie stabilności. Następnie w ustawieniach oprogramowania, w trybie administracyjnym, wybierz długość kalibracji wkładu i żądaną temperaturę. Następnie wprowadź następujący protokół:W zależności od projektu eksperymentalnego dodaj etapy iniekcji od portów A do D po wybranym kroku pomiaru.Aby sprawdzić jakość i określić podstawowy OCR, dostosuj protokół przez co najmniej trzy cykle pomiarowe przed ustawieniem wstrzyknięcia pierwszego leku przez port A. Wstępnie skalibruj wkład jeden dzień lub co najmniej cztery godziny przed badaniem, dodając 1,0 mililitra kalibru do każdej studzienki i umieść wkład czujnika na wierzchu płytki. Przykryj wkład Parafilmem, jeśli zaplanowano jego uwodnienie na dłużej niż 24 godziny, aby zapobiec parowaniu. Przechowuj nabój w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez CO2 przez noc.Następnie upewnij się, że eksperymentalne leki są dokładnie rozpuszczone w świeżej pożywce plus 2,5% glukozy. Zmierzyć i dostosować pH roztworu leku do pH nośnika w żądanej temperaturze. Odpipetować roztwór leku do przydzielonego mu portu iniekcyjnego.Następnie załaduj wkład do urządzenia i rozpocznij kalibrację. Dostosuj świeżo przygotowaną pożywkę plus 2,5% glukozy do pożądanego pH za pomocą jednego normalnego HCl. Następnie przygotuj pojemnik na lód i połóż metalowy talerz na lodzie.Otwórz opakowanie płytki oczkowej. Zanurz sieci w pożywce na 16-milimetrowej szalce Petriego. Zbierz jedną siatkę z podajnikiem i ustaw podajnik obok mikroskopu.Dodaj małą kroplę pożywki do siatki dołączonej do podajnika. Następnie znieczul muchy, umieszczając je na lodowatej metalowej płytce. Za pomocą kleszczy chwyć brzuch muchy i zanurz go w pożywce na szalce Petriego pod mikroskopem.Za pomocą drugiej pary kleszczy delikatnie usuń głowę muchy. Umieść głowicę na środku siatki przymocowanej do podajnika i sprawdź, czy głowica jest zanurzona w pożywce. Usuń zbędny płyn przed wyśrodkowaniem główek, aby uniknąć utraty główek podczas umieszczania ich w studni.Gdy na siatce znajduje się 16 orłów, wyśrodkuj je. Za pomocą podajnika umieść siatkę w studni. Upewnij się, że głowice są uwięzione pod siatką i powoli dodaj 700 mikrolitrów pożywki plus 2,5% glukozy.Upewnij się, że puste studzienki, które są używane jako tło, zawierają również siatkę z 700 mikrolitrami buforu plus 2,5% glukozy. Sprawdź studzienki pod siatkami pod mikroskopem pod pęcherzykami powietrza. Delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą pipety o długości jednego milimetra, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.Trzymaj głowice wyśrodkowane, aby uzyskać wiarygodny odczyt OCR. Następnie dodaj płytkę do maszyny i rozpocznij pomiar. Na końcu protokołu wyjmij wkład.Potwierdź wzrokowo, że w wypełnieniach portów nie ma widocznych resztek. Następnie wyrzuć wkład i płytkę, jeśli głowice nie mają być używane do ekstrakcji białka. Pamiętaj, aby przyjrzeć się poziomom tlenu i pH, aby wykryć wszelkie nieprawidłowe studzienki przed analizą.Ponadto ważne jest, aby wybrać odpowiednie obliczenia współczynnika zużycia tlenu w oparciu o poziomy tlenu. Po wykonaniu protokołu zaobserwowano, że poziom tlenu w głowach w wieku średnim spadał szybciej niż u młodych much. Gdy zakres poziomów tlenu jest podobny w różnych warunkach, lepiej jest użyć algorytmu AKOS do automatycznego generowania wskaźnika zużycia tlenu lub OCR, który niezawodnie odzwierciedla zmiany poziomu tlenu podczas pomiaru między głowami w młodym i średnim wieku.Dodanie maślanu sodu lub SB, inhibitora KDAC, przejściowo zmienia dynamikę poziomu tlenu. Podczas gdy elementy sterujące pojazdu pokazują stały poziom tlenu podczas pierwszego i ostatniego tyknięcia, dodatek SB powoduje znaczny i przejściowy spadek poziomu tlenu w tych tyknięciach. Ponieważ obliczenia AKOS uwzględniają wszystkie tyknięcia i ignorują stan beztlenowy, generują mylący OCR, jak zaobserwowano w nieznormalizowanych poziomach OCR opartych na AKOS, które wykazują niewielką zmianę po wstrzyknięciu portu A. Stały algorytm, który dokładniej modeluje i przypomina OCR i zmiany poziomu tlenu, ujawnia zwiększony OCR po leczeniu SB.Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pracować razem z dwiema osobami, aby zapewnić stosunkowo krótki czas na przygotowanie pojedynczej płytki. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody biochemiczne, takie jak Western Blot i spektrometria mas, aby odpowiedzieć na pytania związane z mechanizmami molekularnymi, na przykład tymi, które moderują zmiany metaboliczne.

measuring-interpreting-oxygen-consumption-rates-whole-fly-head

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Zaburzenia metaboliczne należą do najczęstszych chorób u ludzi. Genetycznie podatny organizm modelowy D. melanogaster może być wykorzystany do identyfikacji nowych genów regulujących metabolizm. W artykule opisano stosunkowo prostą metodę, która pozwala na badanie tempa przemiany materii u much poprzez pomiar ich produkcji CO2 .

Pomiar tempa przemiany materii u Drosophila za pomocą respirometrii

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) jest powszechnym wskaźnikiem funkcji mitochondriów i może być używany do badania różnych modeli chorób. Opracowaliśmy nową metodę wykorzystującą analizator Seahorse XF do bezpośredniego pomiaru OCR w ostrych wycinkach prążkowia od dorosłych myszy, która jest bardziej fizjologicznie istotna niż inne metody.

Pomiar wskaźnika zużycia tlenu w ostrych plastrach prążkowia od dorosłych myszy

Kulometryczna respirometria jest idealna do pomiaru tempa metabolizmu małych organizmów. Po dostosowaniu do Drosophila melanogaster w niniejszym badaniu, zmierzone spożycieO2 mieściło się w zakresie zgłoszonym dla dzikiego typu D. melanogaster w poprzednich badaniach. Konsumpcja O2 na muchę przez mutanty CASK, które są mniejsze i mniej aktywne, była znacznie niższa niż w przypadku typu dzikiego.

Pomiar zużyciaO2 u Drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Opisana jest zmodyfikowana metoda northern blot do pomiaru modyfikacji N 6-metylodenozyny (m6A) w RNA. Obecna metoda może wykrywać modyfikacje w różnych RNA i kontrolach w ramach różnych projektów eksperymentalnych.

Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Przedstawiamy prosty i niezawodny protokół pomiaru zawartości żelaza w tkankach roślinnych za pomocą metody kolorymetrycznej błękitu pruskiego.

Kolorymetryczna metoda pomiaru zawartości żelaza w roślinach

Analiza stabilnych izotopów węgla i tlenu w szkliwie ludzkich i zwierzęcych zębów została wykorzystana jako wskaźnik zastępczy dla indywidualnej diety i rekonstrukcji środowiska. W tym miejscu zapewniamy szczegółowy opis i dokumentację wizualną masowego i sekwencyjnego pobierania próbek szkliwa zębów, a także wstępnej obróbki próbek archeologicznych i paleontologicznych.

Pobieranie próbek i obróbka wstępna węglanu szkliwa zębów w celu stabilnej analizy izotopów węgla i tlenu

Poznaj nową technikę pomiaru zużycia tlenu w całych głowach Drosophila, która odzwierciedla fizjologiczne warunki. Metoda umożliwia badanie zmian metabolicznych podczas starzenia i postępu chorób.

Pomiar i interpretacja wskaźników zużycia tlenu w całych segmentach głowy muchy

Przeglądaj więcej filmów