Pomiar i interpretacja wskaźników zużycia tlenu w całych segmentach głowy muchy
7 stycznia 2019
Pomiar zmian w tempie przemiany materii jest kluczowy dla zrozumienia postępu różnych chorób i starzenia się. W tym miejscu przedstawiamy nową technikę pomiaru zużycia tlenu w całej głowie, która bardziej przypomina stan fizjologiczny i może pomóc w ujawnieniu nowych leków modyfikujących aktywność mitochondriów.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metabolizmu, takie jak, w jaki sposób aktywność metaboliczna jest zmieniana podczas procesu starzenia. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie nienaruszonego segmentu ciała, który posiada dane bardzo zbliżone do stanu naturalnego i fizjologicznego w porównaniu z klasyczną izolacją mitochondrialną. Procedurę zademonstrują Anuroop i Annika, studentka w moim laboratorium.
Aby rozpocząć protokół, włącz maszynę na godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu, aby było wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie żądanej temperatury i utrzymanie stabilności. Następnie w ustawieniach oprogramowania, w trybie administracyjnym, wybierz długość kalibracji wkładu i żądaną temperaturę. Następnie wprowadź następujący protokół:W zależności od projektu eksperymentalnego dodaj etapy iniekcji od portów A do D po wybranym kroku pomiaru.
Aby sprawdzić jakość i określić podstawowy OCR, dostosuj protokół przez co najmniej trzy cykle pomiarowe przed ustawieniem wstrzyknięcia pierwszego leku przez port A. Wstępnie skalibruj wkład jeden dzień lub co najmniej cztery godziny przed badaniem, dodając 1,0 mililitra kalibru do każdej studzienki i umieść wkład czujnika na wierzchu płytki. Przykryj wkład Parafilmem, jeśli zaplanowano jego uwodnienie na dłużej niż 24 godziny, aby zapobiec parowaniu. Przechowuj nabój w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez CO2 przez noc.
Następnie upewnij się, że eksperymentalne leki są dokładnie rozpuszczone w świeżej pożywce plus 2,5% glukozy. Zmierzyć i dostosować pH roztworu leku do pH nośnika w żądanej temperaturze. Odpipetować roztwór leku do przydzielonego mu portu iniekcyjnego.
Następnie załaduj wkład do urządzenia i rozpocznij kalibrację. Dostosuj świeżo przygotowaną pożywkę plus 2,5% glukozy do pożądanego pH za pomocą jednego normalnego HCl. Następnie przygotuj pojemnik na lód i połóż metalowy talerz na lodzie.
Otwórz opakowanie płytki oczkowej. Zanurz sieci w pożywce na 16-milimetrowej szalce Petriego. Zbierz jedną siatkę z podajnikiem i ustaw podajnik obok mikroskopu.
Dodaj małą kroplę pożywki do siatki dołączonej do podajnika. Następnie znieczul muchy, umieszczając je na lodowatej metalowej płytce. Za pomocą kleszczy chwyć brzuch muchy i zanurz go w pożywce na szalce Petriego pod mikroskopem.
Za pomocą drugiej pary kleszczy delikatnie usuń głowę muchy. Umieść głowicę na środku siatki przymocowanej do podajnika i sprawdź, czy głowica jest zanurzona w pożywce. Usuń zbędny płyn przed wyśrodkowaniem główek, aby uniknąć utraty główek podczas umieszczania ich w studni.
Gdy na siatce znajduje się 16 orłów, wyśrodkuj je. Za pomocą podajnika umieść siatkę w studni. Upewnij się, że głowice są uwięzione pod siatką i powoli dodaj 700 mikrolitrów pożywki plus 2,5% glukozy.
Upewnij się, że puste studzienki, które są używane jako tło, zawierają również siatkę z 700 mikrolitrami buforu plus 2,5% glukozy. Sprawdź studzienki pod siatkami pod mikroskopem pod pęcherzykami powietrza. Delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą pipety o długości jednego milimetra, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
Trzymaj głowice wyśrodkowane, aby uzyskać wiarygodny odczyt OCR. Następnie dodaj płytkę do maszyny i rozpocznij pomiar. Na końcu protokołu wyjmij wkład.
Potwierdź wzrokowo, że w wypełnieniach portów nie ma widocznych resztek. Następnie wyrzuć wkład i płytkę, jeśli głowice nie mają być używane do ekstrakcji białka. Pamiętaj, aby przyjrzeć się poziomom tlenu i pH, aby wykryć wszelkie nieprawidłowe studzienki przed analizą.
Ponadto ważne jest, aby wybrać odpowiednie obliczenia współczynnika zużycia tlenu w oparciu o poziomy tlenu. Po wykonaniu protokołu zaobserwowano, że poziom tlenu w głowach w wieku średnim spadał szybciej niż u młodych much. Gdy zakres poziomów tlenu jest podobny w różnych warunkach, lepiej jest użyć algorytmu AKOS do automatycznego generowania wskaźnika zużycia tlenu lub OCR, który niezawodnie odzwierciedla zmiany poziomu tlenu podczas pomiaru między głowami w młodym i średnim wieku.
Dodanie maślanu sodu lub SB, inhibitora KDAC, przejściowo zmienia dynamikę poziomu tlenu. Podczas gdy elementy sterujące pojazdu pokazują stały poziom tlenu podczas pierwszego i ostatniego tyknięcia, dodatek SB powoduje znaczny i przejściowy spadek poziomu tlenu w tych tyknięciach. Ponieważ obliczenia AKOS uwzględniają wszystkie tyknięcia i ignorują stan beztlenowy, generują mylący OCR, jak zaobserwowano w nieznormalizowanych poziomach OCR opartych na AKOS, które wykazują niewielką zmianę po wstrzyknięciu portu A. Stały algorytm, który dokładniej modeluje i przypomina OCR i zmiany poziomu tlenu, ujawnia zwiększony OCR po leczeniu SB.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pracować razem z dwiema osobami, aby zapewnić stosunkowo krótki czas na przygotowanie pojedynczej płytki. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody biochemiczne, takie jak Western Blot i spektrometria mas, aby odpowiedzieć na pytania związane z mechanizmami molekularnymi, na przykład tymi, które moderują zmiany metaboliczne.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorską technikę pomiaru całkowitego zużycia tlenu przez głowę, która w dużym stopniu odwzorowuje warunki fizjologiczne. Metoda ta ma na celu lepsze zrozumienie zmian metabolicznych zachodzących podczas starzenia się oraz progresji chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Metabolizm
- Fizjologia
Wstęp
- Zrozumienie tempa metabolizmu ma kluczowe znaczenie dla badania chorób i procesów starzenia.
- Tradycyjne metody często obejmują izolację mitochondriów, co może nie odzwierciedlać stanów fizjologicznych.
- Ta nowa technika wykorzystuje nienaruszony segment ciała w celu uzyskania dokładniejszych pomiarów.
- Może ona pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące zmian aktywności metabolicznej w czasie.
Cel badania
- Opracowanie metody pozwalającej na dokładny pomiar zużycia tlenu w preparatach całej głowy.
- Zbadanie, w jaki sposób aktywność metaboliczna zmienia się podczas procesu starzenia.
- Przedstawienie wniosków dotyczących potencjalnego wpływu leków na aktywność mitochondriów.
Zastosowane metody
- Kalibracja systemu pomiarowego przed rozpoczęciem eksperymentów.
- Przygotowanie leków eksperymentalnych i pożywek.
- Disekcja i przygotowanie głów much do pomiaru.
- Wykorzystanie specyficznych algorytmów do analizy tempa zużycia tlenu.
Główne wyniki
- Poziomy tlenu w głowach osobników w wieku średnim spadały szybciej niż w głowach osobników młodych.
- Algorytm AKOS dostarczał mylnych wyników w określonych warunkach.
- Algorytmy stałe dostarczyły bardziej wiarygodnych danych dotyczących tempa zużycia tlenu.
- Kolejne analizy biochemiczne mogą pozwolić na zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian metabolicznych.
Wnioski
- Nowa technika oferuje podejście bardziej istotne fizjologicznie do badania metabolizmu.
- Może ona ułatwić odkrywanie leków modulujących funkcję mitochondriów.
- Współpraca jest niezbędna do wydajnej realizacji protokołu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar zużycia tlenu w całych segmentach głów much dostarcza fizjologicznie istotnych danych na temat aktywności metabolicznej, umożliwiając dokładniejszą ocenę zmian w funkcji mitochondriów związanych z wiekiem oraz indukowanych przez leki. Podejście to wspiera walidację celu poprzez uchwycenie zachowania metabolicznego na poziomie tkanki, które może zostać pominięte w przypadku izolowanych mitochondriów lub kultur komórkowych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną wczesnych etapów odkrywania leków, wiążąc fenotypy metaboliczne ze stanami fizjologicznymi istotnymi dla modeli neurodegeneracji, starzenia się oraz chorób metabolicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z funkcją mitochondriów i regulacją metaboliczną w nienaruszonej tkance.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez pomiar zużycia tlenu w systemie zachowującym fizjologiczne właściwości.
- Wartość naukowa: Wyjaśnia aktywność szlaków poprzez dynamiczne pomiary OCR w odpowiedzi na perturbacje farmakologiczne.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do screeningu związków z odczytami metabolicznymi odzwierciedlającymi odpowiedzi na poziomie tkanki.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji i powtarzalności analizy dzięki kontrolowanemu przygotowaniu głowy oraz warunkom hodowlanym.
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościowe pomiary zmiennej zależnej (OCR), które wykrywają przejściowe zmiany metaboliczne, takie jak zmiany indukowane przez inhibitory deacetylazy lizynowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera badania nad systemami istotnymi dla chorób poprzez modelowanie zmian metabolicznych obserwowanych podczas starzenia się i neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki spójnemu fenotypowaniu metabolicznemu.
- Wartość naukowa: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez identyfikację związków, które gwałtownie zmieniają oddychanie mitochondrialne w całej tkance.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – zapewniając fenotypowanie metaboliczne, które pozwala na podjęcie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) przed poniesieniem znacznych nakładów na badania przedkliniczne.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja hipotez dotyczących dysregulacji metabolicznej w procesach starzenia i chorobach z wykorzystaniem preparatów z nienaruszonej tkanki.
- Przesiewanie: Uzyskanie gotowych do analizy, powtarzalnych odczytów metabolicznych w celu oceny wpływu związków na funkcje mitochondriów.
- Analityka: Generowanie ilościowych pomiarów OCR, umożliwiających porównanie stanów metabolicznych w różnych warunkach i po zastosowaniu różnych metod leczenia.
- Badania translacyjne: Powiązanie wczesnych odkryć metabolicznych z ciągłością przedkliniczną poprzez zachowane szlaki w starzeniu i neurodegeneracji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stworzenie uniwersalnej platformy do przesiewania metabolicznego w wielu obszarach terapeutycznych i dla różnych klas celów molekularnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach przesiewowych leków ukierunkowanych na mitochondria.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki zdefiniowanym procedurom preparowania tkanek, ładowania i kalibracji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wczesną identyfikację wad metabolicznych w procesie poszukiwania nowych leków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie efektów mitochondrialnych na poziomie tkankowym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z muszkami *Drosophila*, przeprowadzaniu sekcji oraz technikach analizy metabolicznej.
- Zależy od specjalistycznego oprzyrządowania do monitorowania poziomu tlenu i pH w czasie rzeczywistym.
- Wymaga standaryzacji przygotowania głów oraz warunków pożywek między zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu metody w innych systemach modelowych lub typach tkanek.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak czas żywotności tkanki oraz wrażliwość na wahania środowiskowe podczas pomiaru.
