Fotowybielanie umożliwia obrazowanie pierścienia FtsZ w Cyanobacterium prochlorococcus w superrozdzielczości

Tutaj opisujemy metodę fotowybielania w celu zmniejszenia autofluorescencji sinic. Po fotowybielaniu stosuje się stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej w celu uzyskania trójwymiarowych obrazów pierścienia FtsZ cyjanobakterii o wysokiej rozdzielczości.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące lokalizacji białek i dynamiki w organizmach fotosyntetyzujących. Łącząc metodę fotowybielania z mikroskopem superrozdzielczym, jesteśmy w stanie wykryć dynamikę białek organizmów fotosyntetyzujących w niezwykłych szczegółach. Metoda ta nie tylko zapewnia wgląd w dynamikę białek Prochlorococcus.

Może być również stosowany do wielu innych organizmów zawierających radio-re-dop-sing i bakteriochlorofil. Tę procedurę zademonstruje Yanxin Liu, doktorant z mojego laboratorium. Na początek dodaj pięć mililitrów pożywki Pro99 na bazie wody morskiej do kolby hodowlanej i zaszczep ją jednym mililitrem Prochlorococcus MED4.

Hoduj Prochlorococcus w temperaturze 23 stopni Celsjusza pod światłem o intensywności 35 mikromoli fotonów na metr kwadratowy. Po pięciu dniach zbierz jeden mililitr kultury do 1,5 mililitrowej probówki. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego formaldehydu do probówki, aby utrwalić kulturę.

Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 13 500 razy G przez jedną minutę. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach pożywki Pro99.

Przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aż będzie gotowa do przeprowadzenia barwienia immunologicznego. Najpierw przekręć fiolkę z kulkami polistyrenu. Używając 50% etanolu, przygotuj rozcieńczenie od 1 do 20 000 jako zawiesinę roboczą.

Włącz płytę grzejną i ustaw temperaturę na 120 stopni Celsjusza. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe na płycie grzejnej. Załaduj 100 mikrolitrów zawiesiny roboczej na każde szkiełko nakrywkowe i inkubuj szkiełka nakrywkowe na płycie grzejnej przez 10 minut.

Następnie ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe na szalki Petriego perałkami do góry w celu przechowywania w temperaturze pokojowej. Gdy będziesz gotowy do pokrycia szkiełek nakrywkowych, wyjmij jeden, upewniając się, że jest perełką do góry. Dodaj 100 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu poli-L-lizyny do środka szkiełka nakrywkowego i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.

Następnie za pomocą pipety ostrożnie zassaj niepodłączoną poli-L-lizynę i przenieś ją do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przechowuj tę poli-L-lizynę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Opłucz szkiełko nakrywkowe 10 mililitrami ultra przefiltrowanej wody na 60-milimetrowej szalce Petriego, a następnie krótko osusz je ręcznikiem papierowym.

Przenieść powlekane szkiełko nakrywkowe na nową szalkę Petriego z Parafilmem na dnie, która będzie używana jako naczynie do barwienia. Załaduj 100 mikrolitrów utrwalonej próbki na szkiełko nakrywkowe i pozostaw na 30 minut, aby umożliwić przyłączenie komórek. Następnie użyj ręcznika papierowego, aby wchłonąć pozostały roztwór, a następnie przenieś szkiełko nakrywkowe do dołka w 12-dołkowej płytce w celu umycia.

Dodaj jeden mililitr buforu PBS do studzienki, aby zmyć szkiełko nakrywkowe. Następnie wyjmij PBS i dodaj jeden mililitr świeżego PBS, aby umyć szkiełko nakrywkowe po raz drugi. Użyj pipety, aby usunąć PBS i zastąp go jednym mililitrem świeżo przygotowanego buforu przepuszczalnego.

Inkubuj naczynie do mycia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie usuń bufor przepuszczalny. Rozpocznij proces mycia od dodania jednego mililitra świeżego buforu PBS.

Umieść naczynie do mycia na shakerze, aby delikatnie mieszać naczynie przez pięć minut. Następnie wyjmij PBS i powtórz proces prania trzy razy. Przenieś umyte szkiełko nakrywkowe do naczynia do barwienia.

Dodaj 50 mikrolitrów buforu blokującego na wierzch szkiełka nakrywkowego. Umieść całe naczynie do barwienia na lodzie, a następnie przenieś je pod ksenonowe źródło światła w celu fotowybielania przez co najmniej 60 minut. Po fotowybielaniu i blokowaniu użyj krawędzi ręcznika papierowego, aby usunąć bufor blokujący.

Najpierw rozcieńczyć jeden mikrolitr przeciwciała anty-FtsZ w 99 mikrolitrach buforu blokującego. Umieścić 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na szkiełku nakrywkowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przenieś szkiełko nakrywkowe do dołka naczynia do mycia.

Aby rozpocząć pranie, dodaj jeden mililitr PBS. Następnie przenieś naczynie do mycia do shakera i delikatnie potrząsaj nim przez pięć minut. Wyjmij PBS i powtórz cały proces mycia trzy razy.

Następnie przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do barwienia. Umieścić 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego na szkiełku nakrywkowym i inkubować je w ciemności i temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przenieś szkiełko nakrywkowe z powrotem do naczynia do mycia.

Aby rozpocząć pranie, dodaj jeden mililitr PBS. Owiń naczynie do mycia folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Przenieś płytkę do shakera i delikatnie potrząsaj nią przez pięć minut.

Wyjmij PBS i powtórz cały proces mycia trzy razy. Bezpośrednio przed obrazowaniem STORM należy przygotować jeden mililitr bufora obrazowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Załadować szkiełko nakrywkowe do komory załadowczej.

Dodaj świeżo przygotowany bufor do obrazowania, delikatnie unikając zmycia komórek sinic. Następnie umieść prostokątne szkiełko nakrywkowe na buforze obrazowania, aby zapobiec jego reakcji z tlenem zawartym w powietrzu. Włącz kamerę, diodę LED i laser, a następnie otwórz oprogramowanie STORM.

Dodaj pół kropli olejku immersyjnego na wierzch soczewki. Załaduj komorę, upewniając się, że soczewka obiektywu styka się ze szkiełkiem nakrywkowym. I zbadaj sygnał za pomocą lasera o długości fali 750 nanometrów.

Zidentyfikuj obszar próbki, który zawiera zarówno komórki, jak i znaczniki odniesienia. Następnie uruchom oprogramowanie do korekcji dryftu próbki. Zdobądź jeden obraz szerokokątny jako odniesienie, ze wzmocnieniem zwielokrotnienia elektronów kamery na poziomie 300 i czasem naświetlania 30 milisekund.

Zwiększ intensywność lasera wzbudzającego 750 nm do około 4,5 kilowata na centymetr kwadratowy. Gdy fluorofory przejdą w rzadki wzór mrugania, uzyskaj jeden obraz w super rozdzielczości, zbierając 10 000 klatek przy 33 hercach. Następnie zrekonstruuj obrazy w super rozdzielczości z surowych danych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W tym badaniu STORM jest używany do uzyskania obrazowania w superrozdzielczości poprzez stochastyczną, aktywowaną pojedynczą fluorofory przełączane przez światło. Lokalizacja każdego fluoroforu jest rejestrowana, a następnie tworzony jest obraz o wysokiej rozdzielczości na podstawie tych lokalizacji. Podczas gdy widma absorpcyjne Prochlorococcus osiągają szczyt na 447 i 680 nanometrach i mają minimalną absorpcję powyżej 700 nanometrów, komórki Prochlorococcus MED4 nadal emitują wysoką autofluorescencję po wystawieniu na działanie ekstremalnie wysokiej intensywności lasera 750-nanometrowego, co jest wymagane do obrazowania STORM.

Po zastosowaniu opisanej tutaj metody fotowybielania przez 30 minut obserwuje się, że autofluorescencja komórek zmniejsza się, chociaż nadal wykrywa się kilka komórek z autofluorescencją. Wydłużenie fotowybielania do 60 minut powoduje, że większość komórek traci swoją autofluorescencję. Wyniki te wskazują, że opracowana metoda fotowybielania jest w stanie znacznie zmniejszyć autofluorescencję organizmów fotosyntetyzujących.

Po fotowybielaniu STORM służy do wizualizacji białka podziału komórkowego, FtsZ, w komórkach. Za pomocą STORM ujawniona została szczegółowa morfologia pierścienia FtsZ. Obracając obrazy 3D STORM, zidentyfikowano cztery różne typy morfologii: gromady, niekompletny pierścień, kompletny pierścień i podwójne pierścienie.

Należy pamiętać, że natężenie światła i czas trwania fotowybielacza mogą się różnić w zależności od organizmu. Po jej opracowaniu, metoda ta toruje drogę naukowcom, którzy chcą szczegółowo zbadać organizację i potencjalną funkcję białek w komórkach fotosyntetycznych.