Name: Fotowybielanie umożliwia obrazowanie pierścienia FtsZ w Cyanobacterium prochlorococcus w superrozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Odkryj metodę fotowybielania umożliwiającą obrazowanie superrozdzielcze pierścienia FtsZ w Prochlorococcus. Technika ta pozwala na szczegółowe badanie dynamiki białek w organizmach fotosyntetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Daiying Xu za pomoc techniczną i komentarze do manuskryptu. Badania te są wspierane przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (numer projektu 41476147) oraz Rady ds. Grantów Badawczych Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu w Chinach (numery projektów 689813 i 16103414).

1. Przygotowanie i utrwalenie próbki
<ol>
	<li>Zaszczepić 1 ml aksenu Prochlorococcus MED4 do 5 ml Pro99 na bazie wody morskiej Pro99 pożywka12. Hodować kultury Prochlorococcus w temperaturze 23 °C pod światłem z intensywnością 35 μmol fotonów/m2s. Pięć dni później zbierz 1 ml kultury do probówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Pięć dni po inokulacji Prochlorococcus MED4 osiągnie późną fazę logarytmiczną, z około 108 komórkami/ml, co jest odpowiednie do obrazowania STORM.</li>
	<li>Dodaj 100 μl formaldehydu świeżo przygotowanego z 25% paraformaldehydu (PFA) (w/v) i 2 μl 50% aldehydu glutarowego do probówki o pojemności 1,5 ml, aby utrwalić kulturę. Próbkę inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 min. 
	UWAGA: Próbka była przechowywana w ciemności w celu utrwalenia, ponieważ aldehyd glutarowy jest wrażliwy na światło.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 13 500 x g przez 1 minutę, następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl Pro99 medium12. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C do momentu barwienia immunologicznego.</li>
</ol>
2. Wstępne pokrycie szkiełka nakrywkowego kulkami polistyrenowymi
UWAGA: Koraliki polistyrenowe są uważane za znacznik odniesienia do korekcji dryfu.
<ol>
	<li>Zwiruj oryginalną fiolkę z kulkami polistyrenu i przygotuj rozcieńczenie 1:20 000 z 50% etanolem jako zawiesiną roboczą.</li>
	<li>Włącz płytę grzejną, ustaw temperaturę na 120 °C i umieść szkiełka nakrywkowe na płycie grzejnej.</li>
	<li>Załadować 100 μl zawiesiny roboczej na każde szkiełko nakrywkowe. Inkubować szkiełko nakrywkowe na płycie grzejnej przez 10 minut, a następnie ostrożnie przenieść szkiełka nakrywkowe na szalki Petriego w celu przechowywania w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Strona z przymocowanymi do niej koralikami powinna być skierowana do góry, a komórki powinny być przymocowane po tej samej stronie. Kulki są unieruchomione na szkiełkach nakrywkowych i wykorzystywane do korygowania dryfu próbki w czasie rzeczywistym podczas obrazowania STORM. Po unieruchomieniu koralików szkiełka nakrywkowe nie mogą zostać podpalone.</li>
</ol>
3. Powlekanie poli-L-lizyny na szkiełku nakrywkowym pokrytym koralikami
UWAGA: To jest zrobione w celu unieruchomienia komórek sinic.
<ol>
	<li>Dodać 100 μl poli-L-lizyny (1 mg/ml) na środek szkiełka nakrywkowego stroną pokrytą kulkami skierowaną do góry. Pozostaw na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety ostrożnie zaaspiruj niepodłączoną poli-L-lizynę i przenieś ją do probówki o pojemności 1,5 ml. Zachowaj poli-L-lizynę w temperaturze 4 °C do ponownego użycia.</li>
	<li>Opłucz szkiełko nakrywkowe 10 ml ultrafiltrowanej wody na 60-milimetrowej szalce Petriego, a następnie krótko osusz szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym.</li>
	<li>Przechowywać szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego (100 mm) do późniejszego wykorzystania. Aby zapobiec przyklejeniu się szkiełka nakrywkowego do naczynia, wyłóż szalkę Petriego warstwą parafilmu. 
	UWAGA: Szkiełko nakrywkowe, wstępnie pokryte koralikami i poli-L-lizyną, może być przechowywane w temperaturze pokojowej przez co najmniej pół roku. Dlatego zdecydowanie zaleca się wcześniejsze przygotowanie partii szkiełek nakrywkowych.</li>
</ol>
4. Unieruchomienie komórek na szkiełku nakrywkowym
<ol>
	<li>Przenieść wstępnie powleczone szkiełko nakrywkowe na nową szalkę Petriego z parafilmem na dnie, która będzie odtąd nazywana naczyniem barwiącym. Załadować 100 μl utrwalonej próbki na szkiełko nakrywkowe i pozostawić na 30 minut, aby umożliwić przyłączenie komórek.</li>
	<li>Przenieś szkiełko nakrywkowe do dołka na 12-dołkowej płytce, która będzie odtąd nazywana naczyniem do mycia. Dodać 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl, pH 7,4) do studzienki, aby przepłukać szkiełko nakrywkowe. Usuń bufor PBS i dodaj nowy bufor PBS, aby ponownie umyć szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
5. Permeabilizacja komórek sinic
<ol>
	<li>Usuń bufor PBS za pomocą pipety. Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego buforu permeabilizacyjnego do studzienki naczynia do mycia, który zawiera 0,05% niejonowego detergentu-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8,0) i 0,2 mg/ml lizozymu.</li>
	<li>Inkubować naczynie do mycia w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie usuń bufor przepuszczalności.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu PBS i umieścić naczynie do mycia na shakerze, który delikatnie potrząsa naczyniem do mycia przez 5 minut. Usuń bufor PBS. Powtórz ten krok 3 razy, aby umyć szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
6. Fotowybielanie pigmentów chlorofilu w etapie blokowania
<ol>
	<li>Przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do barwienia. Dodać 50 μl buforu blokującego, który zawiera 0,2% (v/v) niejonowego detergentu-100 i 3% (v/v) koziej surowicy, na wierzch szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Umieść całą płytkę barwiącą na lodzie i przenieś ją pod ksenonowym źródłem światła w celu fotowybielania przez co najmniej 60 minut, przy natężeniu światła 1 800 μmol fotonów/m2·s.</li>
	<li>Po fotowybielaniu i blokowaniu ostrożnie usuń bufor blokujący, adsorbując go krawędzią ręcznika papierowego. 
	UWAGA: Intensywność światła ksenonowego jest tak duża, że do ochrony oczu potrzebna jest para odpowiednich okularów przeciwsłonecznych. W międzyczasie owiń źródło światła i płytkę folią aluminiową, aby uniknąć wycieku światła, które może spowodować uszkodzenie oczu. Sprawdzaj szkiełko nakrywkowe co 15 minut, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe pozostaje wilgotne. Jeśli szkiełko nakrywkowe jest suche, dodać 50 μl buforu blokującego.</li>
</ol>
7. Wiązanie przeciwciał
<ol>
	<li>Przeciwciało anty-Anabaena FtsZ rozpuścić w 200 μl wody zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Rozcieńczyć 1 μl przeciwciała anty-FtsZ w 99 μl buforu blokującego. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do mycia. Dodaj 1 ml buforu PBS i umieść naczynie do mycia na shake'u. Delikatnie potrząsaj naczyniem myjącym przez 5 minut. Powtórz ten krok 3 razy, aby umyć szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do barwienia. Rozcieńczyć 1 μl przeciwciała drugorzędowego w 500 μl buforu blokującego. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego na szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do mycia. Przemyj go 1 ml buforu PBS na shakerze. Delikatnie potrząsaj naczyniem myjącym przez 5 minut. Owiń naczynie do mycia papierem aluminiowym, aby było odporne na światło. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	<li>Dodać 500 μl formaldehydu świeżo przygotowanego z 4% paraformaldehydu (PFA) (w/v) do studzienki. Inkubować szkiełko nakrywkowe przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń formaldehyd i powtórz krok prania 3x.</li>
	<li>Przechowywać szkiełko nakrywkowe w buforze PBS w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu wykonania obrazowania.</li>
</ol>
8. Przygotowanie bufora obrazowania STORM
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml buforu obrazowego zgodnie z Tabelą 1, bezpośrednio przed obrazowaniem STORM. 
	UWAGA: Ponieważ okres trwałości bufora do obrazowania wynosi około 2 godzin, należy przygotować go na świeżo, tuż przed użyciem. Unikać wirowania po dodaniu oksydazy glukozowej i katalazy. 
	UWAGA: Wioligogen metylowy jest materiałem trującym. Prosimy obchodzić się z nim ze szczególną ostrożnością. Cyklooktatetraen jest klasyfikowany jako rakotwórczy kot. 1 substancja chemiczna. Należy unikać wdychania i kontaktu ze skórą, a roztwór podstawowy cyklooktatetraenu i bufor do obrazowania należy przygotować w kapturze chemicznym.</li>
</ol>
9. Akwizycja obrazu danych STORM
<ol>
	<li>Załaduj szkiełko nakrywkowe do komory załadowczej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Świeżo przygotowany bufor do obrazowania należy delikatnie załadować do komory, aby uniknąć zmycia komórek sinicowych. Umieść prostokątne szkiełko nakrywkowe na górze bufora obrazowania, aby zapobiec jego reakcji z tlenem w powietrzu. Unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Włącz kamerę, światło LED i laser. Otwórz oprogramowanie STORM do akwizycji obrazu, wyznaczania położenia środka ciężkości i korekcji dryfu próbki13.</li>
	<li>Dodaj pół kropli olejku immersyjnego na wierzch soczewki. Załaduj komorę i upewnij się, że soczewka obiektywu styka się ze szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Zbadaj sygnał za pomocą lasera 750 nm. 
	UWAGA: Zawsze dołączaj drugą kontrolę ujemną bez barwienia przeciwciała, aby upewnić się, że autofluorescencja jest zmniejszona.</li>
	<li>Zidentyfikuj obszar próbki, który zawiera zarówno komórki, jak i znaczniki odniesienia. Uruchom oprogramowanie do korekcji dryftu próbki. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, idealny obszar próbki zawiera od 10 do 30 komórek. W międzyczasie komórki powinny być dobrze oddzielone, aby uniknąć nakładania się komórek.</li>
	<li>Uzyskaj jeden obraz szerokokątny jako odniesienie, ze wzmocnieniem zwielokrotnienia elektronów (EM) kamery na poziomie 300 i czasem naświetlania 30 ms (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Zwiększ intensywność lasera wzbudzającego 750 nm do wyższej mocy, około 4.5 kW/cm2. Gdy fluorofory przejdą w rzadki wzór mrugania, uzyskaj jeden obraz o super rozdzielczości, zbierając 10 000 klatek przy 33 Hz (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Jeśli fluorofory nie są wyizolowane, odczekaj kilka minut, aż więcej fluoroforów zostanie przełączonych w stan ciemny, a wyizolowane pojedyncze cząsteczki zaczną sekwencyjnie migotać. Opisana tutaj liczba ramek jest odpowiednia dla naszej próbki i musi zostać zoptymalizowana pod kątem innych docelowych konstrukcji.</li>
</ol>
10. Rekonstrukcja obrazów o wysokiej rozdzielczości na podstawie surowych danych
<ol>
	<li>Użyj wtyczki o nazwie QuickPALM (Table of Materials)14 w ImageJ, aby zrekonstruować kolorowy obraz 3D o wysokiej rozdzielczości. 
	UWAGA: Pojawi się wstępny obraz chromatyczny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C) wraz z kolorowym paskiem skali (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Kolor reprezentuje głębokość na osi z.</li>
	<li>Aby zademonstrować strukturę 3D w filmie, skonstruuj stos obrazów o wysokiej rozdzielczości z osią z przekrojami co 10 nm za pomocą QuickPALM14. Dostosuj jasność stosów i zduplikuj stos jednej komórki docelowej. Użyj wtyczki o nazwie 3D Viewer (Table of Materials)15 w ImageJ, aby wygenerować obraz 3D komórki. Nagraj obrót struktury 3D w celach demonstracyjnych.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier%3A+Super-resolution+imaging+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Wave+of+Cellular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li>
<li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li>
<li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531(2017).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus%5BTitle%5D)+AND+%22mbio%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657(2017).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division%3A+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li>
<li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li>
<li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="https://aslopubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.4319/lo.2002.47.4.0989">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li>
<li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879(2015).</li>
<li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuickPALM%3A+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans%3A+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li>
<li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prochlorococcus%3A+The+structure+and+function+of+collective+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li>
<li>Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="https://www.ingentaconnect.com/content/jmr/jmr/1993/00000051/00000003/art00008">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li>
<li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li>
<li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li>
<li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li>
<li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li>
<li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin%3A+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole opisaliśmy procedurę znacznego zmniejszenia autofluorescencji cyjanobakterii Prochlorococcus (ryc. 3C), a następnie barwienia immunologicznego białek w komórkach, co umożliwiło nam wykorzystanie STORM do badania morfologii pierścienia 3-D FtsZ w Prochlorococcus (ryc. 4). Protokół ten może zostać przyjęty do obrazowania w superrozdzielczości u innych organizmów fotosyntetycznych.
Wcześniejsze badania n...

Mikroskopie super-rozdzielcze mogą przekroczyć limit dyfrakcji światła i dostarczyć obrazy w rozdzielczościach subdyfrakcyjnych (< 200 nm). Są szeroko stosowane w wielu organizmach do badania lokalizacji białek i struktur subkomórkowych. Główne metody mikroskopii superrozdzielczej obejmują mikroskopię oświetlenia strukturalnego (SIM), mikroskopię zubożenia emisji wymuszonej (STED), STORM i mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotoaktywowaną (PALM). Mechanizmy i zastosowania tych mikroskopów o wysokiej rozdzielczości zostały omówione gdzie indziej1,2.
STORM może osiągnąć rozdzielczość tak wysoką jak 10 nm dzięki separacji przestrzennej3,4. W przypadku STORM tylko jedna cząsteczka w obszarze ograniczonym dyfrakcją jest aktywowana ("włączona"), a reszta cząsteczek jest utrzymywana w stanie nieaktywnym ("wyłączonym"). Poprzez akumulację szybkiego włączania i wyłączania pojedynczych cząsteczek można wygenerować obraz "nieograniczony dyfrakcyjnie"3. Tymczasem w STORM ma zastosowanie wiele rodzajów barwników organicznych i białek fluorescencyjnych, co pozwala na łatwą aktualizację ze zwykłej mikroskopii fluorescencyjnej do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości5,6.
STORM nie był szeroko stosowany w komórkach fotosyntetycznych, takich jak cyjanobakterie, glony i komórki roślinne z chloroplastami7,8, co wynika z faktu, że STORM wymaga dużej intensywności lasera do sterowania fotoprzełączaniem. Laser o wysokiej intensywności niekorzystnie wzbudza silne tło autofluorescencji w komórkach fotosyntetycznych i zakłóca lokalizację pojedynczej cząsteczki w obrazowaniu STORM. Aby wykorzystać STORM do zbadania struktur subkomórkowych lub interakcji białkowych w komórkach fotosyntetycznych, opracowaliśmy protokół fotowybielania w celu wygaszenia sygnałów autofluorescencji tła9. W rutynowej procedurze barwienia immunofluorescencyjnego próbki są wystawiane na działanie białego światła o dużym natężeniu podczas etapu blokowania, co obniża autofluorescencję komórek fotosyntetycznych, aby spełnić wymagania STORM. W związku z tym protokół ten umożliwia badanie organizmów barwnikowych za pomocą STORM.
Tutaj opisujemy protokół korzystania z STORM do obrazowania organizacji pierścienia FtsZ w jednokomórkowym picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ jest wysoce konserwatywnym białkiem cytoszkieletu podobnym do tubuliny, które polimeryzuje, tworząc strukturę pierścieniową (pierścień Z) wokół obwodu komórki10 i jest niezbędne do podziału komórki11. Zachowane komórki Prochlorococcus są najpierw fotowybielane w celu zmniejszenia tła autofluorescencyjnego i barwione immunologicznie pierwszorzędowym przeciwciałem anty-FtsZ, a następnie drugorzędowe przeciwciało anty-IgG królika (H+L) jest sprzężone z fluoroforem (np. Alexa Fluor 750). Ostatecznie STORM jest używany do obserwacji szczegółowych organizacji pierścieni FtsZ w Prochlorococcus na różnych etapach cyklu komórkowego.

<table><tbody><tr><td>Cząstki polistyrenu</td><td>Spherotech</td><td>PP-20-10</td><td>2,0-2,4 &mikro; </td></tr><tr><td>m Szkiełko nakrywkowe</td><td>Marienfeld</td><td>0111580</td><td>18 mm &puste;, Grubość nr 1</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00021000</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9155</td><td>mol wt 70 000-150 000</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego, 50%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sól disodowa, 2-hydrat</td><td>Złoto biotechnologia</td><td>E-210-500</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>anty- Anabaena Przeciwciało FtsZ</td><td>Agrisera</td><td>AS07217</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało</td><td>wtórne Life Technologies</td><td>A-21039</td><td>sprzężone z Alexa Fluor 750</td></tr><tr><td>D-glukoza bezwodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Viologen metylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>856177</tr><tr><td>Cyklooktatetraen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>XD-300 Mikroskop ksenonowy</td><td></td><td></td><td>250 W</td></tr><tr><td>STORM</td> Mikroskop <td></td><td>NBI</td><td>SRiS</td></tr><tr><td>Rohdea</td><td>NBI</td><td>SRiS 3.0</td><td>oprogramowanie do akwizycji obrazowania</td></tr><tr><td>Luna</td><td>NBI</td><td>SRiS 3.0</td><td>oprogramowanie do korekcji dryfu</td></tr><tr><td>QuickPALM</td><td></td><td></td><td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td></tr><tr><td>3D Viewer</td><td></td><td></td><td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home</td></tr></tbody></table>

fotowybielanie umożliwia obrazowanie pierścienia ftsz w cyanobacterium prochlorococcus w superrozdzielczości

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Mikroskopia superrozdzielcza jest szeroko stosowana do badania interakcji białek i struktur subkomórkowych w wielu organizmach. Jednak w organizmach fotosyntetyzujących rozdzielczość boczna obrazowania w superrozdzielczości wynosi tylko ~100 nm. Niska rozdzielczość wynika głównie z wysokiego tła autofluorescencji komórek fotosyntetycznych spowodowanego przez lasery o wysokiej intensywności, które są wymagane do obrazowania w superrozdzielczości, takiego jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM). W tym miejscu opisujemy metodę STORM wspomaganą fotowybielaniem, która została niedawno opracowana do obrazowania morskich picocyanobacterium Prochlorococcus. Po fotowybielaniu autofluorescencja Prochlorococcus jest skutecznie redukowana, dzięki czemu STORM można wykonać z rozdzielczością boczną ~10 nm. Za pomocą tej metody uzyskujemy in vivo trójwymiarową (3-D) organizację białka FtsZ i charakteryzujemy cztery różne morfologie pierścieni FtsZ podczas cyklu komórkowego Prochlorococcus. Metoda, którą tutaj opisujemy, może zostać zastosowana do obrazowania w superrozdzielczości innych organizmów fotosyntetyzujących.

Metoda STORM umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości poprzez stochastyczną aktywację poszczególnych fotoprzełączalnych fluoroforów. Po zapisaniu położenia każdego fluoroforu konstruowany jest obraz w superrozdzielczości na podstawie tych współrzędnych4. Z tego powodu precyzja lokalizacji fluoroforu ma kluczowe znaczenie dla rekonstrukcji obrazu w superrozdzielczości. Widma absorpcji Prochlorococcus osiągają maksima przy 47 nm i 680 nm, a Prochloroc...

Tutaj opisujemy metodę fotowybielania w celu zmniejszenia autofluorescencji sinic. Po fotowybielaniu stosuje się stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej w celu uzyskania trójwymiarowych obrazów pierścienia FtsZ cyjanobakterii o wysokiej rozdzielczości.

Fotowybielanie umożliwia obrazowanie pierścienia FtsZ w Cyanobacterium prochlorococcus w superrozdzielczości

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące lokalizacji białek i dynamiki w organizmach fotosyntetyzujących. Łącząc metodę fotowybielania z mikroskopem superrozdzielczym, jesteśmy w stanie wykryć dynamikę białek organizmów fotosyntetyzujących w niezwykłych szczegółach. Metoda ta nie tylko zapewnia wgląd w dynamikę białek Prochlorococcus.Może być również stosowany do wielu innych organizmów zawierających radio-re-dop-sing i bakteriochlorofil. Tę procedurę zademonstruje Yanxin Liu, doktorant z mojego laboratorium. Na początek dodaj pięć mililitrów pożywki Pro99 na bazie wody morskiej do kolby hodowlanej i zaszczep ją jednym mililitrem Prochlorococcus MED4.Hoduj Prochlorococcus w temperaturze 23 stopni Celsjusza pod światłem o intensywności 35 mikromoli fotonów na metr kwadratowy. Po pięciu dniach zbierz jeden mililitr kultury do 1,5 mililitrowej probówki. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego formaldehydu do probówki, aby utrwalić kulturę.Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 13 500 razy G przez jedną minutę. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach pożywki Pro99.Przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aż będzie gotowa do przeprowadzenia barwienia immunologicznego. Najpierw przekręć fiolkę z kulkami polistyrenu. Używając 50% etanolu, przygotuj rozcieńczenie od 1 do 20 000 jako zawiesinę roboczą.Włącz płytę grzejną i ustaw temperaturę na 120 stopni Celsjusza. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe na płycie grzejnej. Załaduj 100 mikrolitrów zawiesiny roboczej na każde szkiełko nakrywkowe i inkubuj szkiełka nakrywkowe na płycie grzejnej przez 10 minut.Następnie ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe na szalki Petriego perałkami do góry w celu przechowywania w temperaturze pokojowej. Gdy będziesz gotowy do pokrycia szkiełek nakrywkowych, wyjmij jeden, upewniając się, że jest perełką do góry. Dodaj 100 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu poli-L-lizyny do środka szkiełka nakrywkowego i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.Następnie za pomocą pipety ostrożnie zassaj niepodłączoną poli-L-lizynę i przenieś ją do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przechowuj tę poli-L-lizynę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Opłucz szkiełko nakrywkowe 10 mililitrami ultra przefiltrowanej wody na 60-milimetrowej szalce Petriego, a następnie krótko osusz je ręcznikiem papierowym.Przenieść powlekane szkiełko nakrywkowe na nową szalkę Petriego z Parafilmem na dnie, która będzie używana jako naczynie do barwienia. Załaduj 100 mikrolitrów utrwalonej próbki na szkiełko nakrywkowe i pozostaw na 30 minut, aby umożliwić przyłączenie komórek. Następnie użyj ręcznika papierowego, aby wchłonąć pozostały roztwór, a następnie przenieś szkiełko nakrywkowe do dołka w 12-dołkowej płytce w celu umycia.Dodaj jeden mililitr buforu PBS do studzienki, aby zmyć szkiełko nakrywkowe. Następnie wyjmij PBS i dodaj jeden mililitr świeżego PBS, aby umyć szkiełko nakrywkowe po raz drugi. Użyj pipety, aby usunąć PBS i zastąp go jednym mililitrem świeżo przygotowanego buforu przepuszczalnego.Inkubuj naczynie do mycia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie usuń bufor przepuszczalny. Rozpocznij proces mycia od dodania jednego mililitra świeżego buforu PBS.Umieść naczynie do mycia na shakerze, aby delikatnie mieszać naczynie przez pięć minut. Następnie wyjmij PBS i powtórz proces prania trzy razy. Przenieś umyte szkiełko nakrywkowe do naczynia do barwienia.Dodaj 50 mikrolitrów buforu blokującego na wierzch szkiełka nakrywkowego. Umieść całe naczynie do barwienia na lodzie, a następnie przenieś je pod ksenonowe źródło światła w celu fotowybielania przez co najmniej 60 minut. Po fotowybielaniu i blokowaniu użyj krawędzi ręcznika papierowego, aby usunąć bufor blokujący.Najpierw rozcieńczyć jeden mikrolitr przeciwciała anty-FtsZ w 99 mikrolitrach buforu blokującego. Umieścić 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na szkiełku nakrywkowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przenieś szkiełko nakrywkowe do dołka naczynia do mycia.Aby rozpocząć pranie, dodaj jeden mililitr PBS. Następnie przenieś naczynie do mycia do shakera i delikatnie potrząsaj nim przez pięć minut. Wyjmij PBS i powtórz cały proces mycia trzy razy.Następnie przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do barwienia. Umieścić 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego na szkiełku nakrywkowym i inkubować je w ciemności i temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przenieś szkiełko nakrywkowe z powrotem do naczynia do mycia.Aby rozpocząć pranie, dodaj jeden mililitr PBS. Owiń naczynie do mycia folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Przenieś płytkę do shakera i delikatnie potrząsaj nią przez pięć minut.Wyjmij PBS i powtórz cały proces mycia trzy razy. Bezpośrednio przed obrazowaniem STORM należy przygotować jeden mililitr bufora obrazowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Załadować szkiełko nakrywkowe do komory załadowczej.Dodaj świeżo przygotowany bufor do obrazowania, delikatnie unikając zmycia komórek sinic. Następnie umieść prostokątne szkiełko nakrywkowe na buforze obrazowania, aby zapobiec jego reakcji z tlenem zawartym w powietrzu. Włącz kamerę, diodę LED i laser, a następnie otwórz oprogramowanie STORM.Dodaj pół kropli olejku immersyjnego na wierzch soczewki. Załaduj komorę, upewniając się, że soczewka obiektywu styka się ze szkiełkiem nakrywkowym. I zbadaj sygnał za pomocą lasera o długości fali 750 nanometrów.Zidentyfikuj obszar próbki, który zawiera zarówno komórki, jak i znaczniki odniesienia. Następnie uruchom oprogramowanie do korekcji dryftu próbki. Zdobądź jeden obraz szerokokątny jako odniesienie, ze wzmocnieniem zwielokrotnienia elektronów kamery na poziomie 300 i czasem naświetlania 30 milisekund.Zwiększ intensywność lasera wzbudzającego 750 nm do około 4,5 kilowata na centymetr kwadratowy. Gdy fluorofory przejdą w rzadki wzór mrugania, uzyskaj jeden obraz w super rozdzielczości, zbierając 10 000 klatek przy 33 hercach. Następnie zrekonstruuj obrazy w super rozdzielczości z surowych danych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W tym badaniu STORM jest używany do uzyskania obrazowania w superrozdzielczości poprzez stochastyczną, aktywowaną pojedynczą fluorofory przełączane przez światło. Lokalizacja każdego fluoroforu jest rejestrowana, a następnie tworzony jest obraz o wysokiej rozdzielczości na podstawie tych lokalizacji. Podczas gdy widma absorpcyjne Prochlorococcus osiągają szczyt na 447 i 680 nanometrach i mają minimalną absorpcję powyżej 700 nanometrów, komórki Prochlorococcus MED4 nadal emitują wysoką autofluorescencję po wystawieniu na działanie ekstremalnie wysokiej intensywności lasera 750-nanometrowego, co jest wymagane do obrazowania STORM.Po zastosowaniu opisanej tutaj metody fotowybielania przez 30 minut obserwuje się, że autofluorescencja komórek zmniejsza się, chociaż nadal wykrywa się kilka komórek z autofluorescencją. Wydłużenie fotowybielania do 60 minut powoduje, że większość komórek traci swoją autofluorescencję. Wyniki te wskazują, że opracowana metoda fotowybielania jest w stanie znacznie zmniejszyć autofluorescencję organizmów fotosyntetyzujących.Po fotowybielaniu STORM służy do wizualizacji białka podziału komórkowego, FtsZ, w komórkach. Za pomocą STORM ujawniona została szczegółowa morfologia pierścienia FtsZ. Obracając obrazy 3D STORM, zidentyfikowano cztery różne typy morfologii: gromady, niekompletny pierścień, kompletny pierścień i podwójne pierścienie.Należy pamiętać, że natężenie światła i czas trwania fotowybielacza mogą się różnić w zależności od organizmu. Po jej opracowaniu, metoda ta toruje drogę naukowcom, którzy chcą szczegółowo zbadać organizację i potencjalną funkcję białek w komórkach fotosyntetycznych.

photobleaching-enables-super-resolution-imaging-ftsz-ring

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Weber, N. i wsp., Naturalna transformacja, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia skoncentrowany test oparty na diodach LED do badania fototaksji u sinic nitkowatych. Bakterie migrują w kierunku źródła światła, tworząc gęstą akumulację w oświetlonym środku, która jest wizualizowana i określana ilościowo poprzez analizę intensywności pikseli przechwyconego obrazu.

Test fototaksji sinic nitkowatych przy użyciu skupionego oświetlenia świetlnego

Źródło: Zhan, Y. i inni. Fotobielenie umożliwia obrazowanie pierścienia FtsZ w Cyanobacterium Prochlorococcus w superrozdzielczości. J. Vis. Exp. (2018).Ten film pokazuje procedurę fotobielenia pigmentów w komórkach cyjanobakterii przy użyciu światła ksenonowego w warunkach zimnych, aby poprawić obrazowanie fluorescencji białek regulujących wzrost.

Fotobielenie pigmentów cyjanobakterii do obrazowania białek regulujących wzrost

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Obecny protokół szczegółowo opisuje izolację fikobilisomów z cyjanobakterii poprzez wirowanie przez nieciągły gradient gęstości sacharozy. Frakcje nienaruszonych fikobilisomów potwierdza widmo emisji fluorescencji 77K i analiza SDS-PAGE. Otrzymane frakcje fikobilisomów nadają się do barwienia ujemnego TEM i analizy spektrometrii mas.

Izolacja i charakterystyka nienaruszonego fikobilisomu u cyjanobakterii

Obecny protokół opisuje krok po kroku obrazowanie autofluorescencyjne i ocenę zmian fikobiliproteinowych u czerwonych alg na podstawie analizy spektralnej. Jest to bezznacznikowa i nieniszcząca metoda oceny adaptacji komórkowej do ekstremalnych siedlisk, gdy dostępny jest tylko rzadki materiał, a komórki rosną powoli lub wcale w warunkach laboratoryjnych.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny fizjologii czerwonych alg

Prezentujemy prostą i przystępną metodę wizualizacji nitkowatych sinic w płaszczyźnie XY. Zastosowano matrycę agarozową o niskiej temperaturze topnienia, która pozwoliła na uzyskanie obrazów białek biorących udział w podziale, w orientacji pionowej. Dlatego metodologię tę można zastosować do dowolnego organizmu nitkowatego i różnych rodzajów białek.

Metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych

Ten artykuł przedstawia obszerny protokół dla PmbExM, techniki mikroskopii ekspansyjnej zaprojektowanej specjalnie dla biofilmów Proteus mirabilis. PmbExM wykorzystuje stopniową obróbkę enzymatyczną próbek biofilmu w celu uzyskania izotropowej, 4,3-krotnej ekspansji, umożliwiającej analizę w superrozdzielczości organizacji przestrzennej struktur komórkowych i subkomórkowych w tych siedzących zbiorowiskach drobnoustrojów.

Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Odkryj metodę fotowybielania umożliwiającą obrazowanie superrozdzielcze pierścienia FtsZ w Prochlorococcus. Technika ta pozwala na szczegółowe badanie dynamiki białek w organizmach fotosyntetycznych.

Fotowybielanie umożliwia obrazowanie pierścienia FtsZ w Cyanobacterium prochlorococcus w superrozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów