Chłonne pobieranie próbek mikrobiopsji i ekstrakcja RNA do minimalnie inwazyjnej, jednoczesnej analizy krwi i skóry

Metoda ta może ułatwić ustalenie biomarkerów chorób skóry, a także zmniejszyć ryzyko dla uczestników badań klinicznych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nie wymaga intensywnego treningu i nie pozostawia żadnych blizn. Pięć minut przed mikrobiopsją umieść pustą dwumililitrową probówkę wirówkową na suchym lodzie na pięć minut.

Nosząc jednorazowe rękawiczki, spryskaj ręce i narzędzia 70% etanolem przed odkażeniem miejsca aplikacji chusteczką nasączoną alkoholem. Wyjąć mikrobiopsję ze wysterylizowanego opakowania promieniowania gamma bez dotykania mikroigły i pociągnąć tłok, aż usłyszysz kliknięcie i tłok zablokuje się na swoim miejscu. Skierować załadowany wyrób pod mniej więcej kątem prostopadłym do skóry, z której ma być pobierana próbka, zwracając uwagę, aby obszar pobierania próbek znajdował się w ustalonym położeniu, a następnie przyłożyć przyrząd do skóry z siłą wywierającą co najmniej jeden kilogram

Następnie naciśnij spust i przytrzymaj urządzenie w miejscu przez co najmniej dziesięć sekund. Jeśli urządzenie zostanie zwolnione przed upływem dziesięciu sekund, istnieje większe prawdopodobieństwo zmian w wchłanianiu krwi, a także późniejszej analizie. Gdy próbka zostanie wchłonięta, delikatnie wyciągnij tłok i chłonną mikroigłę z etui i użyj sterylnych kleszczyków, aby pociągnąć za dwa otwory mikroigły, aby usunąć ją z tłoka.

Dodaj 50 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do probówki na suchym lodzie i umieść nienaruszoną mikroigłę w probówce po suchym lodzie igłą do dołu. Uważaj, aby końcówka mikroigły nie dotykała czegokolwiek podczas procesu usuwania. Wiruj probówkę przez trzy do pięciu sekund, aby pobrać próbkę materiału z końcówki mikroigłowej i inkubuj probówkę w bloku grzewczym lub łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji za pomocą sterylnych kleszczy umieść tylny koniec mikroigły na poziomie górnej krawędzi probówki do mikroigieł i zamknij pokrywę probówki tak, aby górna część mikroigły była utrzymywana na miejscu między nasadką a probówką. Odwirować probówkę, aby pobrać próbkę materiału z warstwy chłonnej urządzenia i użyć kleszczy, aby ostrożnie usunąć mikroigłę bez zanurzania końcówki z powrotem w roztworze buforowym. Ponownie odwirować próbkę i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.

Następnie dodać 250 mikrolitrów buforu kondycjonującego do membrany filtracyjnej kolumny oczyszczającej na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć bufor przez odwirowanie. Dodać 50 mikrolitrów 70% etanolu do wyekstrahowanej próbki RNA z delikatnym mieszaniem i przenieść mieszaninę do wstępnie kondycjonowanej kolumny oczyszczającej. Natychmiast odwirować probówkę dwa razy w celu usunięcia przepływu, a następnie przepłukać stu mikrolitrami pierwszego buforu do płukania.

W celu roztrawienia DNA dodać 40 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki inkubacyjnej DNA bezpośrednio na membranę kolumny oczyszczającej na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 40 mikrolitrami pierwszego buforu do przemłukiwania. Pod koniec wirowania przemyć kolumnę 100 mikrolitrami drugiego buforu do przemywania i sprawdzić, czy w kolumnie oczyszczającej nie ma pozostałości buforu do płukania. Przenieś kolumnę oczyszczającą do 0,5 mililitrowej mikrorurki wirówkowej dostarczonej w zestawie do ekstrakcji RNA i umieść końcówkę pipety bezpośrednio na membranie kolumny oczyszczającej, aby dodać 11 mikrolitrów wody RNA sPRE do kolumny.

Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować kolumnę jeden raz, aby rozprowadzić wodę sPRE RNA w całej kolumnie, a drugi raz w celu wymycia RNA. Następnie przechowuj całą próbkę RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jeśli synteza cDNA nie zostanie przeprowadzona natychmiast. Chłonna mikroigła do mikrobiopsji składa się z dwóch warstw stalowej płytki z warstwą chłonną pomiędzy nimi do jednoczesnego pobierania próbek skóry i krwi.

Zastosowanie mikrobiopsji chłonnej wywołuje jedynie niewielki rumień, który nie jest zauważalny po 48 godzinach. Po nakłuciu kilka maleńkich kawałków skóry jest wychwytywanych w pobliżu końcówki mikroigły, a krew jest wchłaniana przez bibułę filtracyjną. Gdy chłonna mikroigła zostanie usunięta natychmiast po nakłuciu, objętość próbki, a następnie ilość wyekstrahowanego mRNA jest znacznie mniejsza niż uzyskana po przytrzymaniu przez dziesięć sekund po nakłuciu.

Podobne poziomy ekspresji markerów skórnych wykrywa się po zastosowaniu mikrobiopsji chłonnej i jej poprzedniczki mikrobiopsji skóry za pomocą ilościowej analizy PCR. Jednak znacznie wyższy poziom ekspresji biomarkerów białych krwinek wykrywa się po pobraniu próbek z mikrobiopsji chłonnej, co sugeruje, że chłonna mikrobiopsja mikrobiopsyjna lepiej sprawdza się w pobieraniu krwi, zachowując przy tym taką samą zdolność do pobierania próbek skóry, jak w przypadku mikrobiopsji skóry. Dlatego podczas stosowania tej techniki należy pamiętać, że stosowanie urządzenia zgodnie z tym, co sugerujemy, jest niezbędne do uzyskania wiarygodnych wyników.

Tak więc, postępując zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak PCR w czasie rzeczywistym, w celu względnego profilowania ekspresji genów. Chociaż wciąż rozwijamy urządzenie, jesteśmy przekonani, że technika ta utorowała drogę do badań klinicznych w zakresie pobierania próbek, do dermatologicznych zastosowań kosmetycznych lub pediatrycznych, ponieważ jest tak prosta i mało inwazyjna.