Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań translacyjnych, takie jak związek między krążącymi biomarkerami a rokowaniem pacjenta. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny ekspresji panelu krążących biomarkerów za pomocą łatwej i niezawodnej metodologii przy niewielkiej ilości materiału wejściowego. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię pacjentów z rakiem, ponieważ może ona zidentyfikować krążące biomarkery przydatne w podejmowaniu decyzji i monitorowaniu leczenia pacjentów.

Metoda ta może również zapewnić wgląd w analizę krążących biomarkerów. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak analiza ekspresji biomarkerów tkankowych w celu molekularnej charakterystyki choroby. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy ekstrakcji są trudne do nauczenia.

Na początek przenieś 400 mikrolitrów próbki osocza do dwumililitrowej probówki wolnej od RNaz. Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu denaturującego do probówki. Dodaj cztery mikrolitry jednonanomolowego kolca.

Po wymieszaniu roztworu dodać 800 mikrolitrów kwaśnego fenolu-chloroformu. Wiruj roztwór przez 60 sekund i odwiruj z maksymalną prędkością przez 15 minut. Następnie przenieś lizat zawarty w górnej fazie wodnej do czystej probówki, uważając, aby nie zakłócić interfazy.

Zmierzyć objętość odzyskanej fazy wodnej i dodać 1/3 objętości etanolu do lizatu. Następnie umieść wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej. Przenieś do 700 mikrolitrów mieszaniny etanolu i lizatu do wkładu filtra.

Odwiruj wkład filtra przez 30 sekund przy 10 000 razy większej grawitacji. Następnie zmierz całkowitą objętość przepływu. Następnie dodaj 2/3 objętości etanolu do filtratu i dobrze wymieszaj.

Umieść drugi wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej. Następnie przenieś do 700 mikrolitrów próbki do wkładu i odwiruj przy 10 000 razy grawitacji przez 30 sekund przed odrzuceniem przepływu. Dodaj 700 mikrolitrów roztworu płuczącego mikroRNA do wkładu filtrującego i odwiruj go z probówką zbiorczą o wartości 10 000 razy większej niż grawitacja przez 15 sekund.

Wyrzuć przepływ i włóż wkład filtra z powrotem do tej samej rurki. Następnie przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów podgrzanego roztworu elucyjnego do wkładu.

Odwiruj wkład filtra przy 10 000 razy grawitacji przez 30 sekund, aby odzyskać mikroRNA. Przygotować koktajl mieszanki reakcji poliadenylacji zgodnie z protokołem tekstowym. Przenieść dwa mikrolitry próbki do każdego dołka płytki reakcyjnej.

Następnie dodaj trzy mikrolitry koktajlu reakcyjnego do każdej studzienki. Odwirować i krótko odwirować płytkę, aby odwirować zawartość. Następnie umieść płytkę w termocyklerze i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym.

Przygotuj koktajl mieszanki reakcji podwiązania w probówce wirówkowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów koktajlu do każdej studzienki płytki reakcyjnej. Następnie wymieszać zawartość płytki reakcyjnej na wytrząsarce z prędkością 1 900 obr./min przez jedną minutę, po czym następuje krótkie odwirowanie płytki.

Następnie umieść płytkę reakcyjną w termocyklerze i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić reakcję odwrotnej transkrypcji, należy przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodać 15 mikrolitrów mieszanki do każdego dołka płytki zawierającej produkt ligacji.

Mieszać zawartość płytki na wytrząsarce z prędkością 1 900 obr./min przez jedną minutę, a następnie krótko odwirować płytkę. Następnie umieść płytkę w termocyklerze i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Następnie przygotuj mieszaninę reakcyjną miR-Amp i dodaj 45 mikrolitrów mieszanki do każdej studzienki nowej płytki reakcyjnej.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów produktu RT do każdej studzienki płytki reakcyjnej. Mieszać płytkę na wytrząsarce z prędkością 1 900 obr./min przez jedną minutę, a następnie krótko odwirować płytkę. Następnie umieść płytkę w termocyklerze i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w tabeli pierwszej protokołu tekstowego.

Najpierw rozcieńczyć każdą próbkę cDNA w buforze TE. Następnie przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR w probówce wirówkowej. dodanie 10% objętości w nadmiarze.

Przenieś 19 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka płytki. Uszczelnij płytkę i krótko ją odwiruj. Na koniec wykonaj protokół termiczny w systemie RT-PCR, jak opisano w tabeli drugiej protokołu tekstowego.

Przeprowadzono seryjne rozcieńczenia kontroli skoków w celu wybrania, które stężenie jest najlepsze do dodania we wszystkich próbkach osocza z tej konkretnej serii przypadków. Dzięki temu protokołowi możliwa była ocena wszystkich biomarkerów u każdego pacjenta, a także pojedynczego biomarkera w całej serii przypadków. W tym protokole przeanalizowano panel krążących miRNA związanych z angiogenezą w odniesieniu do przeżycia wolnego od progresji, całkowitego przeżycia i wskaźnika obiektywnych odpowiedzi u pacjentów z rakiem jelita grubego leczonych schematem chemioterapii.

Porównując poziomy ekspresji miRNA między wartością wyjściową a pierwszą oceną kliniczną, zaobserwowano wzrost has-miR-155-5p. Wzrost ten był związany z krótszym PFS i OS. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykonaniu czynności przy użyciu fenolu-chloroformu pod wyciągiem. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak izolacja i analiza krążących białek lub kodowanie RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ocena bardziej wyczerpującego panelu krążących biomarkerów.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się płynną biopsją do zbadania ekspresji krążących biomarkerów u pacjentów z rakiem. Nie zapominaj, że praca z krwią i odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny.