Name: Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji i analizy panelu 24 krążących mikroRNA z próbek osocza pacjentów z rakiem jelita grubego. Technika ta umożliwia niezawodną identyfikację biomarkerów przy minimalnej ilości materiału wejściowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Roche S.p.A. i Włoską Agencję Leków (AIFA).

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki pod wysterylizowanym dygestoriami zgodnie z Dobrą Praktyką Laboratoryjną (GLP).
1. Pobieranie i przechowywanie osocza
<ol>
	<li>Zebrać 3 ml próbki krwi obwodowej w probówce K3E EDTA.</li>
	<li>Odwirować probówkę w temperaturze pokojowej o stężeniu 1,880 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Odzyskać osocze sklarowane nad osadem w podwielokrotnościach 450 μl.</li>
	<li>Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia. 
	nuta: Probówkę z krwią obwodową należy przetworzyć w ciągu 2 godzin od pobrania. Podczas pobierania osocza z probówki nie należy naruszać warstwy limfocytów.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja krążących miRNA z próbek osocza (tabela materiałów)
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie wymagane roztwory i rozmroź próbki do etapów ekstrakcji.
	<ol>
		<li>Dodaj 375 μl 2-merkaptoetanolu do 2x roztworu denaturującego i dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Dodaj 21 ml 100% etanolu klasy ACS do roztworu do płukania miRNA I i dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Dodaj 40 ml 100% etanolu klasy ACS do roztworu myjącego 2/3 i dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Pozostawić podwielokrotność osocza do rozmrożenia w temperaturze pokojowej, a następnie rozpocząć etapy ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja organiczna
	<ol>
		<li>Przenieść 400 μl próbki osocza do probówki o pojemności 2 ml wolnej od RNaz.</li>
		<li>Dodać 400 μL 2x roztworu denaturującego, wymieszać przez wirowanie i krótko odwirować.</li>
		<li>Dodać 4 μl 1 nM nakłucia, wymieszać przez wirowanie i krótko odwirować.</li>
		<li>Dodać 800 μl kwaśnego chloroformu fenolowego.</li>
		<li>Wirować przez 60 s i wirować z maksymalną prędkością (≥10 000 x g) przez 15 min.</li>
		<li>Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki. Nie zakłócaj interfazy. Zanotować odzyskaną objętość i wyrzucić probówkę zawierającą fazę niewodną. 
		nuta: 2x roztwór denaturujący jest przechowywany w temperaturze 4 °C i w tej temperaturze może zastygać. Przed użyciem podgrzać roztwór do temperatury 37 °C, mieszając od czasu do czasu przez 10-15 minut. Należy uważać, aby pobrać dolną fazę zawierającą kwaśny fenol-chloroform, a nie bufor wodny, który znajduje się na wierzchu mieszaniny. Podgrzej roztwór elucyjny lub wodę wolną od nukleaz do temperatury 95 °C. Należy uważać, aby podgrzać odpowiednią objętość roztworu (100 μl na próbkę + 10% nadmiaru).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacanie małego RNA
	<ol>
		<li>Dodać 1/3 objętości etanolu 100% do fazy wodnej z kroku 2.2.6 i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Umieść wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej dla każdej próbki.</li>
		<li>Przenieść do 700 μl lizatu z kroku 2.3.1 i etanolu do wkładu filtracyjnego i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s.</li>
		<li>Jeżeli pozostało >700 μl mieszaniny, umieścić filtrat w świeżej probówce i powtórzyć krok 2.3.3; powtarzać, aż cała mieszanina przejdzie przez wkład filtracyjny.</li>
		<li>Zmierzyć całkowitą objętość przepływu.</li>
		<li>Dodaj 2/3 objętości etanolu 100% do filtracji i dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Umieść drugi wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej.</li>
		<li>Przenieść do 700 μl objętości próbki do wkładu i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ.</li>
		<li>Powtarzać krok 2.3.8, aż cała mieszanina przejdzie przez wkład filtra.</li>
		<li>Nałożyć 700 μl roztworu do płukania miRNA 1 do wkładu filtrującego i odwirować wkład filtra z probówką zbiorczą o stężeniu 10 000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływ. Umieść wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.</li>
		<li>Nanieść 500 μl roztworu płuczącego 2/3 do wkładu filtracyjnego i odwirować wkład filtra z probówką zbiorczą o stężeniu 10 000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływ. Umieść wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej.</li>
		<li>Umieścić wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej i powtórzyć krok 2.3.11 z 500 μl roztworu płuczącego 2/3. Wyrzuć przepływ i przenieś wkład filtra do świeżej probówki zbiorczej.</li>
		<li>Odwirować probówki z wkładami filtracyjnymi o sile 10 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Przenieść wkład filtra do świeżej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl podgrzanego (95 °C) roztworu elucyjnego lub wody wolnej od nukleaz.</li>
		<li>Wirować przy 10 000 x g przez 30 s w celu odzyskania miRNA i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: W roztworze płuczącym 2/3 może tworzyć się biały osad. Jest to nadmiar EDTA uwalniany z roztworu. Należy unikać pobierania tych kryształów na etapie pipetowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wykonaj odwrotną transkrypcję i wstępną amplifikację miRNA (Tabela materiałów)
<ol>
	<li>Przeprowadź reakcję poliadenylacji
	<ol>
		<li>Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie, a następnie krótko zwirować i odwirować, aby odwirować zawartość. Dodatkowo rozmrozić 50% PEG 8000, pozwalając mu osiągnąć temperaturę pokojową.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml, uzyskując końcową objętość 3 μl koktajlu reakcyjnego na każdą próbkę. Użyj następujących objętości plus 10% nadmiaru objętości dla każdego odczynnika.</li>
		<li>Dodaj 1,7 μl wody wolnej od RNaz, 0,5 μl 10x buforu poli(A), 0,5 μl 10 mM ATP, a na koniec 0,3 μl 5 U/μL enzymu PolyA.</li>
		<li>Krótko zmieszaj i odwiruj mieszankę koktajlową, aby odwirować zawartość.</li>
		<li>Przenieść 2 μl próbki do każdego dołka płytki reakcyjnej lub probówki reakcyjnej i dodać 3 μl koktajlu reakcyjnego. Krótko zwirować i odwirować, aby odwirować zawartość.</li>
		<li>Umieść płytkę/rurki w termocyklerze i wykonaj następujące czynności.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut (etap poliadenylacji).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut (reakcja zatrzymana), a następnie trzymać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź reakcję podwiązania.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej o następujących objętościach dla każdej próbki i 10% objętości w nadmiarze.</li>
		<li>Dodaj 0,4 μl wody wolnej od RNaz, 3 μl 5x buforu ligazy DNA, 0,6 μL 25x adaptera ligacyjnego, 4,5 μl 50% PEG 8000 i na koniec 1,5 μl ligazy RNA.</li>
		<li>Krótko zwiruj i odwiruj mieszankę koktajli, aby odwirować zawartość.</li>
		<li>Dodać 10 μl mieszaniny do każdej studzienki/probówki reakcyjnej zawierającej produkt przeróbczy z poli(A). Mieszać za pomocą wytrząsarki płytkowej z prędkością 1 900 obr./min przez 1 minutę lub przez krótkie wirowanie i odwirować zawartość.</li>
		<li>Umieścić płytkę/probówki reakcyjne w termocyklerze z następującymi ustawieniami: inkubacja w temperaturze 60 °C przez 60 minut, a następnie zatrzymanie w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: 50% PEG 8000 ma wysoką lepkość. Stosować w temperaturze pokojowej, powoli zasysając i dozując. Po każdym etapie zasysania i dozowania przytrzymaj zatyczkę przez 10 sekund, aby odczynnik mógł płynąć w górę iw dół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj reakcję odwrotnej transkrypcji.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej, z następującymi objętościami dla każdej próbki i 10% objętości w nadmiarze.</li>
		<li>Dodaj 3,3 μl wody wolnej od RNaz, 6 μl 5x buforu RT, 1,2 μl mieszanki dNTP (po 25 mM), 1,5 μl 20x uniwersalnych starterów RT i na koniec 3 μl 10x mieszanki enzymów RT.</li>
		<li>Krótko zmieszaj i odwiruj mieszankę koktajlową, aby odwirować zawartość.</li>
		<li>Dodać 15 μl mieszaniny do każdej studzienki/probówki reakcyjnej zawierającej produkt ligacji. Mieszać za pomocą wytrząsarki płytkowej z prędkością 1 900 obr./min przez 1 minutę lub przez krótkie wirowanie i odwirować zawartość.</li>
		<li>Umieść płytkę/probówki reakcyjne w termocyklerze z następującymi ustawieniami.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 42 °C przez 15 minut (odwrotna transkrypcja).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 85 °C przez 5 minut (zatrzymanie reakcji), a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C. 
		nuta: Produkt RT może być teraz przechowywany w temperaturze -20 °C i pozostaje stabilny przez okres do 2 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź reakcję miR-Amp (Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej o następujących objętościach dla każdej próbki i 10% objętości w nadmiarze.</li>
		<li>Dodaj 17,5 μl wody wolnej od RNaz, 25 μl 2x miR-Amp master mix i 2,5 μl 20x miR-Amp primer mix.</li>
		<li>Krótko zmieszaj i odwiruj mieszankę koktajlową, aby odwirować zawartość.</li>
		<li>Dla każdej próbki przenieść 45 μl mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka nowej płytki reakcyjnej lub probówki reakcyjnej. Dodać 5 μl produktu RT do każdej studzienki lub probówki reakcyjnej. Mieszać za pomocą wytrząsarki płytkowej z prędkością 1 900 obr./min przez 1 minutę lub przez krótkie wirowanie i odwirować zawartość.</li>
		<li>Umieścić płytkę/probówki reakcyjne w termocyklerze i uruchomić zgodnie z ilustracją w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Rozcieńczyć każdą próbkę cDNA w stosunku 1:10 w buforze 0,1x TE.</li>
	<li>Obliczyć liczbę studzienek/kontrprób dla każdej próbki. Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej o następujących objętościach dla każdej próbki, dodając w nadmiarze 10% objętości.</li>
	<li>Dodaj 4 μl wody wolnej od RNaz, 10 μl 2x szybkiej zaawansowanej mieszanki głównej (tabela materiałów), a na koniec 5 μl rozcieńczonego cDNA.</li>
	<li>Wymieszaj przez wirowanie i krótko odwiruj, aby odwirować zawartość.</li>
	<li>Przenieść 19 μl mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka, uszczelnić płytkę i krótko odwirować.</li>
	<li>Wykonaj protokół termiczny (Tabela 2) w systemie RT-PCR.</li>
</ol>

<ol><li>Luo, H. -Y., Xu, R. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li>
<li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li>
<li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li>
<li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li>
<li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer%3A+Analysis+and+verification+of+current+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li>
<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+laboratory%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li>
<li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430(2015).</li>
<li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+%28REMARK%29%3A+explanation+and+elaboration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+%28qRT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li>
<li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li>
<li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li>
<li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443(2014).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

miRNA to małe niekodujące RNA (o długości 18-25 nukleotydów) zdolne do wiązania regionu 3' UTR docelowego informacyjnego RNA i hamowania go i/lub degradacji. Można je zatem uznać za regulatory ekspresji genów na poziomie translacyjnym. W ciągu ostatniej dekady kilka miRNA zostało skorelowanych z inicjacją i rozwojem raka, co czyni je użytecznymi biomarkerami klinicznymi w diagnostyce, prognozowaniu i terapii. Chronione przez RNazy, miRNA są obecne w stabilnej postaci w płynach biologicznych, takich jak krew, osocze, suro...

CRC stanowi trzecią najczęściej diagnozowaną złośliwość i czwartą przyczynę zgonów związanych z rakiem na świecie. Do tej pory bewacyzumab (B), przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) oraz cetuksymab (C) lub panitumumab (P), przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), zostały zatwierdzone do leczenia pierwszego rzutu w skojarzeniu z chemioterapią (CT).
Mutacje w genach K-RAS i N-RAS są jedynymi klinicznie użytecznymi biomarkerami zdolnymi do identyfikacji pacjentów, którzy mają najmniejsze szanse na skorzystanie z tomografii komputerowej opartej na anty-EGFR. Chociaż przeprowadzono kilka badań w celu poszukiwania biomarkerów, które są predykcyjne w odpowiedzi na tomografię komputerową opartą na B, nadal istnieje znaczny brak wiarygodnych i skutecznych leków do stosowania w praktyce klinicznej1.
miRNA to małe RNA (o długości 18-25 nukleotydów), które regulują translację docelowych genów i odgrywają kluczową rolę w licznych procesach fizjopatologicznych, w tym embriogenezie i kancerogenezie. Cząsteczki te są wysoce stabilne w płynach biologicznych, takich jak osocze/surowica, mocz i plwocina, co czyni je solidnymi biomarkerami do wykorzystania w nieinwazyjnym pobieraniu próbek2. Korzystając z panelu miRNA zaangażowanych w szlak angiogenny, naszym celem było zidentyfikowanie nowych krążących biomarkerów zdolnych do przewidywania wyniku klinicznego u pacjentów z przerzutowym CRC (mCRC) leczonych schematem CT opartym na B.
Przeanalizowaliśmy serię 52 pacjentów z mCRC leczonych za pomocą tomografii komputerowej opartej na B w ramach prospektywnego wieloośrodkowego randomizowanego badania III fazy "Włoskie badanie w zaawansowanym raku jelita grubego" (ITACa). Niniejszy protokół został zatwierdzony przez Lokalną Komisję Etyki (Comitato Etico Area Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, nr 674) w dniu 19 września 2007r. Wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę przed pobraniem próbki krwi. Dla każdego pacjenta próbki krwi żylnej pobrano przed leczeniem i podczas pierwszej oceny klinicznej (po 8 tygodniach) w celu oceny wyjściowej ekspresji miRNA i jej modulacji podczas leczenia w odniesieniu do wyniku pacjenta.
Przeszukując literaturę, wybraliśmy 21 miRNA skorelowanych z procesem angiogennym, o których wiadomo, że są wykrywalne w ludzkim osoczu: has-miR-107, has-miR-126-3p, has-miR-145-5p, has-miR-194-5p, has-miR-199a-5p, has-miR-200b-3p, has-miR-20b-5p, has-miR-21-5p p, has-miR-210-3p, has-miR-221-3p, has-miR-24-3p, has-miR-27a-3p, has-miR-29b-3p, has-miR-335-5p, has-miR-424-5p, has-miR-497-5p, has-miR-520d-3p, has-miR-92a-3p, has-miR-17-5p i has-miR-155-5p. Wybraliśmy również has-miR-223-3p i has-mir-484 do normalizacji endogennej3,4,5,6, oraz cel-miR-39 oczyszczony z C. elegans jako impuls do egzogennej normalizacji. Wszystkie normalizacje danych przeprowadzono metodą 2 ̂ ̄(ΔΔCt).
Wykrywanie krążących miRNA stwarza pewne trudności techniczne, ponieważ cząsteczki są obecne na bardzo niskich poziomach w osoczu, a ich wzmocnienie jest chemicznie trudne, biorąc pod uwagę ich krótką sekwencję. Z tych powodów wybraliśmy procedurę, która uwzględnia zarówno ekstrakcję organiczną za pomocą fenolu, jak i metodologię opartą na kolumnie z włókna szklanego. Ekstrakcja miRNA w krążeniu jest gorącym tematem w dziedzinie płynnej biopsji, a my wybraliśmy komercyjny zestaw, który okazał się jednym z najbardziej niezawodnych pod względem ilości i jakości odzyskanych plonów7,8. Wybraliśmy protokół odwrotnej transkrypcji miRNA poprzez dodanie adaptera w 5' i ogona poli(A) do 3' dojrzałego miRNA, aby zwiększyć selektywność i swoistość reakcji.
Biorąc pod uwagę solidność metody, zaprojektowaliśmy niestandardowe płytki z wstępnie narysowanymi sondami do RT-PCR do oceny każdej próbki w dwóch egzemplarzach i przeanalizowaliśmy 2 pacjentów na każdej płytce, jak pokazano na rysunku 1.

<table><tbody><tr><td>Probówki Safe-lock 1,5 ml bez rnazy</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Safe-lock 2 mL bez rnazy</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.344</td><td></td></tr> Bez <tr><td>rnazy 20 &micro; L końcówki</td><td>Starlab</td><td>S1123-1810</td><td></td></tr><tr><td>Bez rnazy 200 i mikro; L końcówki</td><td>Starlab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Bez rnazy 1,000 &mikro; L końcówki</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>mirVana PARIS Zestaw do oczyszczania RNA i białka natywnego</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany zestaw do syntezy cDNA miRNA TaqMan</td><td>Thermo Fisher</td><td>A28007</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol anidronowy klasy ACS</td><td>Odczynniki 414605</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4444558</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Zaawansowane testy miRNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>7500 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>0,2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 i mikro; L pipety laboratoryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td>stołowa</tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stacjonarny blok</td><td></td><td></td><td></td>grzewczy</tr><tr><td>Dygestoria</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>0,2 ml probówki do PCR</td></tr></tbody></table>

wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikrorna u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Rośnie zainteresowanie płynną biopsją w diagnostyce raka, prognozowaniu i monitorowaniu terapeutycznym, co stwarza zapotrzebowanie na wiarygodne i użyteczne biomarkery dla praktyki klinicznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół ekstrakcji, odwrotnej transkrypcji i oceny poziomów ekspresji krążących miRNA z próbek osocza pacjentów z rakiem jelita grubego (CRC). mikroRNA (miRNA) to klasa niekodujących RNA o długości 18-25 nukleotydów, które regulują ekspresję docelowych genów na poziomie translacyjnym i odgrywają ważną rolę, w tym funkcję pro- i antyangiogenną, w fizjopatologii różnych narządów. miRNA są stabilne w płynach biologicznych, takich jak surowica i osocze, co czyni je idealnymi krążącymi biomarkerami do diagnozowania raka, rokowania oraz podejmowania decyzji dotyczących leczenia i monitorowania. Ekstrakcję krążącego miRNA przeprowadzono przy użyciu szybkiej i skutecznej metody, która obejmuje zarówno metodologie organiczne, jak i kolumnowe. W przypadku retrotranskrypcji miRNA zastosowaliśmy wieloetapową procedurę, która uwzględnia poliadenylację w 3' i ligację adaptera w 5' dojrzałych miRNA, a następnie losową wstępną amplifikację miRNA. Wybraliśmy niestandardowy panel 24 miRNA do przetestowania za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i zauważyliśmy sondy miRNA na niestandardowych płytkach macierzy. Przeprowadziliśmy przebiegi na płytkach qRT-PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym. MiRNA do normalizacji wybrano za pomocą oprogramowania GeNorm (v. 3.2). Dane analizowano za pomocą oprogramowania Expression suite (v 1.1) i przeprowadzono analizy statystyczne. Metoda okazała się wiarygodna i solidna pod względem technicznym oraz może być przydatna do oceny poziomów biomarkerów w próbkach płynnych, takich jak osocze i/lub surowica.

Przeanalizowano panel krążących miRNA związanych z angiogenezą w odniesieniu do czasu przeżycia bez progresji choroby (PFS), przeżycia całkowitego (OS) oraz obiektywnego wskaźnika odpowiedzi (ORR) u 52 pacjentów z mCRC leczonych chemioterapią (CT) opartą na B. Ocena takich biomarkerów w próbkach osocza jest utrudniona ze względu na trudności techniczne. Zastosowano uznane metody ekstrakcji miRNA z próbek osocza pacjentów, odwrotnej transkrypcji oraz preamplifikacji. Postępując zgodnie z i...

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań translacyjnych, takie jak związek między krążącymi biomarkerami a rokowaniem pacjenta. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny ekspresji panelu krążących biomarkerów za pomocą łatwej i niezawodnej metodologii przy niewielkiej ilości materiału wejściowego. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię pacjentów z rakiem, ponieważ może ona zidentyfikować krążące biomarkery przydatne w podejmowaniu decyzji i monitorowaniu leczenia pacjentów.Metoda ta może również zapewnić wgląd w analizę krążących biomarkerów. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak analiza ekspresji biomarkerów tkankowych w celu molekularnej charakterystyki choroby. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy ekstrakcji są trudne do nauczenia.Na początek przenieś 400 mikrolitrów próbki osocza do dwumililitrowej probówki wolnej od RNaz. Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu denaturującego do probówki. Dodaj cztery mikrolitry jednonanomolowego kolca.Po wymieszaniu roztworu dodać 800 mikrolitrów kwaśnego fenolu-chloroformu. Wiruj roztwór przez 60 sekund i odwiruj z maksymalną prędkością przez 15 minut. Następnie przenieś lizat zawarty w górnej fazie wodnej do czystej probówki, uważając, aby nie zakłócić interfazy.Zmierzyć objętość odzyskanej fazy wodnej i dodać 1/3 objętości etanolu do lizatu. Następnie umieść wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej. Przenieś do 700 mikrolitrów mieszaniny etanolu i lizatu do wkładu filtra.Odwiruj wkład filtra przez 30 sekund przy 10 000 razy większej grawitacji. Następnie zmierz całkowitą objętość przepływu. Następnie dodaj 2/3 objętości etanolu do filtratu i dobrze wymieszaj.Umieść drugi wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej. Następnie przenieś do 700 mikrolitrów próbki do wkładu i odwiruj przy 10 000 razy grawitacji przez 30 sekund przed odrzuceniem przepływu. Dodaj 700 mikrolitrów roztworu płuczącego mikroRNA do wkładu filtrującego i odwiruj go z probówką zbiorczą o wartości 10 000 razy większej niż grawitacja przez 15 sekund.Wyrzuć przepływ i włóż wkład filtra z powrotem do tej samej rurki. Następnie przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów podgrzanego roztworu elucyjnego do wkładu.Odwiruj wkład filtra przy 10 000 razy grawitacji przez 30 sekund, aby odzyskać mikroRNA. Przygotować koktajl mieszanki reakcji poliadenylacji zgodnie z protokołem tekstowym. Przenieść dwa mikrolitry próbki do każdego dołka płytki reakcyjnej.Następnie dodaj trzy mikrolitry koktajlu reakcyjnego do każdej studzienki. Odwirować i krótko odwirować płytkę, aby odwirować zawartość. Następnie umieść płytkę w termocyklerze i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym.Przygotuj koktajl mieszanki reakcji podwiązania w probówce wirówkowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów koktajlu do każdej studzienki płytki reakcyjnej. Następnie wymieszać zawartość płytki reakcyjnej na wytrząsarce z prędkością 1 900 obr./min przez jedną minutę, po czym następuje krótkie odwirowanie płytki.Następnie umieść płytkę reakcyjną w termocyklerze i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić reakcję odwrotnej transkrypcji, należy przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodać 15 mikrolitrów mieszanki do każdego dołka płytki zawierającej produkt ligacji.Mieszać zawartość płytki na wytrząsarce z prędkością 1 900 obr./min przez jedną minutę, a następnie krótko odwirować płytkę. Następnie umieść płytkę w termocyklerze i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Następnie przygotuj mieszaninę reakcyjną miR-Amp i dodaj 45 mikrolitrów mieszanki do każdej studzienki nowej płytki reakcyjnej.Następnie dodaj pięć mikrolitrów produktu RT do każdej studzienki płytki reakcyjnej. Mieszać płytkę na wytrząsarce z prędkością 1 900 obr./min przez jedną minutę, a następnie krótko odwirować płytkę. Następnie umieść płytkę w termocyklerze i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w tabeli pierwszej protokołu tekstowego.Najpierw rozcieńczyć każdą próbkę cDNA w buforze TE. Następnie przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR w probówce wirówkowej. dodanie 10% objętości w nadmiarze.Przenieś 19 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka płytki. Uszczelnij płytkę i krótko ją odwiruj. Na koniec wykonaj protokół termiczny w systemie RT-PCR, jak opisano w tabeli drugiej protokołu tekstowego.Przeprowadzono seryjne rozcieńczenia kontroli skoków w celu wybrania, które stężenie jest najlepsze do dodania we wszystkich próbkach osocza z tej konkretnej serii przypadków. Dzięki temu protokołowi możliwa była ocena wszystkich biomarkerów u każdego pacjenta, a także pojedynczego biomarkera w całej serii przypadków. W tym protokole przeanalizowano panel krążących miRNA związanych z angiogenezą w odniesieniu do przeżycia wolnego od progresji, całkowitego przeżycia i wskaźnika obiektywnych odpowiedzi u pacjentów z rakiem jelita grubego leczonych schematem chemioterapii.Porównując poziomy ekspresji miRNA między wartością wyjściową a pierwszą oceną kliniczną, zaobserwowano wzrost has-miR-155-5p. Wzrost ten był związany z krótszym PFS i OS. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykonaniu czynności przy użyciu fenolu-chloroformu pod wyciągiem. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak izolacja i analiza krążących białek lub kodowanie RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ocena bardziej wyczerpującego panelu krążących biomarkerów.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się płynną biopsją do zbadania ekspresji krążących biomarkerów u pacjentów z rakiem. Nie zapominaj, że praca z krwią i odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny.

detection-circulating-microrna-custom-panel-patients-with-metastatic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje ekstrakcję krążącego mikroRNA z próbek osocza pacjentów z rakiem jelita grubego za pomocą ekstrakcji organicznej, a następnie wzbogacenia kolumny z włókna szklanego. miRNA są stabilne w płynach biologicznych, takich jak surowica i osocze, co czyni je idealnymi krążącymi biomarkerami do diagnozowania raka, rokowania oraz podejmowania decyzji dotyczących leczenia i monitorowania. Metoda ta pomoże zidentyfikować nowe krążące biomarkery zdolne do przewidywania wyników klinicznych u...

Ekstrakcja krążącego miRNA: metoda izolowania miRNA z próbek osocza poprzez ekstrakcję organiczną i wzbogacanie małego RNA

Ten protokół opisuje możliwość przeprowadzenia profilowania miRNA w egzosomach, uwalnianych w osoczu pacjentów z NSCLC, za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji egzosomów z terapią proteinazą K i RNAza, w celu uniknięcia zanieczyszczenia krążącymi miRNA i oceny ich cech biomarkerów w NSCLC.

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania ekspresji miRNA w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ.

Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.

Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przyjęty w badaniu przesiewowym BioMILD w celu przeprowadzenia testu klasyfikatora sygnatury krążącego mikroRNA do wczesnego wykrywania raka płuc.

Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc

Aby umożliwić bardzo czułe wykrywanie komórek kolonizujących tkanki ludzkiego raka jelita grubego (CRC), pokazujemy protokół efektywnej transdukcji cząsteczek lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX przed ich wstrzyknięciem myszom biorcy, z obserwacją mikroskopową stereofluorescencji.

Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metodę ekstrakcji i analizy panelu 24 krążących mikroRNA z próbek osocza pacjentów z rakiem jelita grubego. Technika ta umożliwia niezawodną identyfikację biomarkerów przy minimalnej ilości materiału wejściowego.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Przeglądaj więcej filmów