Name: Mikroskopia 4D drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Poznaj wielokolorową mikroskopię konfokalną 4D do analizy dynamiki organelli w komórkach drożdży. Ta metoda umożliwia śledzenie fluorescencyjnie znakowanych struktur w czasie, wspierając badania biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH R01 GM104010. Dziękujemy za pomoc w mikroskopii fluorescencyjnej dla Vytasa Bindokasa i Christine Labno w Integrated Microscopy Core Facility, który jest wspierany przez finansowany przez NIH grant P30 CA014599 Cancer Center Support Grant.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Spraw, aby niefluorescencyjne podłoże minimalnie NSD2. Oczekuje się, że brak ryboflawiny zmniejszy wewnątrzkomórkową zieloną fluorescencję tła i związaną z nią fototoksyczność.</li>
	<li>Hodować szczep drożdży przez noc w temperaturze ~23 °C do fazy logarytmicznej w 5 ml NSD w kolbie z przegrodą o pojemności 50 ml z dobrym napowietrzeniem. Około 3-4 godziny przed analizą rozcieńczyć kulturę drożdży w świeżym NSD, tak aby końcowy OD600 wynosił 0,5-0,8 w momencie obrazowania.</li>
	<li>Przygotować roztwór 2 mg/ml konkanawaliny A (ConA). W razie potrzeby zamrozić porcje tego roztworu w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wirować roztwór ConA przez 5 minut z pełną prędkością w mikrowirówce, aby usunąć cząstki stałe, które mogą zakłócać obrazowanie. Następnie dodać 250 μl supernatantu do czystego naczynia mikroskopowego z dnem o średnicy 35 mm. Po 15 minutach przemyć 2-3 razy 2 mldH2O i pozostawić do wyschnięcia.</li>
	<li>Dodaj 250 μl kultury drożdży do naczynia pokrytego ConA, odczekaj 10 minut, aby komórki się przylgnęły, i delikatnie przemyj 2-3 razy 2 ml NSD. Przykryj komórki 2 ml świeżego NSD.</li>
</ol>
2. Obrazowanie
<ol>
	<li>Użyj soczewki zanurzeniowej z olejkiem 63x lub 100x. Wystarczy przysłona numeryczna (NA) 1,40, ale można również użyć obiektywu o wyższej NA.</li>
	<li>Sformatuj rozmiar ramki na 256 x 128 (szerokość x wysokość). Jeśli potrzebny jest większy rozmiar ramy, zwiększenie szerokości nie zmniejszy prędkości skanowania, o ile mikroskop konfokalny jest wyposażony w skaner rezonansowy.</li>
	<li>Dostosuj współczynnik powiększenia, aby rozmiar piksela wynosił ~80 nm.</li>
	<li>Użyj maksymalnej szybkości skanowania, która zwykle wynosi 8 kHz. Włącz dwukierunkowe skanowanie X, jeśli jest dostępne, a eksperymenty kontrolne potwierdzają, że skany z dwóch kierunków są w rejestrze.</li>
	<li>Ustaw akumulację linii na 4 lub 6. Pamiętaj, aby używać akumulacji (sumowania) zamiast uśredniania.</li>
	<li>Ustaw otworek na 1,2 jednostki Airy. Empirycznie, podczas obrazowania żywych komórek drożdży, to ustawienie przechwytuje więcej fotonów niż standardowy wybór jednostki 1.0 Airy, nie powodując przy tym znaczącej utraty rozdzielczości.</li>
	<li>Dla każdego kanału fluorescencji ustaw długość fali wzbudzenia, przypisz detektor o wysokiej czułości, ustaw zakres długości fali emisji i włącz tryb zliczania fotonów, jeśli jest dostępny. Wybór długości fali będzie zależał od fluoroforów. Na przykład wzbudzić fluorescencję GFP przy 485 nm i zebrać od 495-550 nm oraz wzbudzić fluorescencję mScarlet przy 555 nm i zebrać od 562-625 nm.</li>
	<li>Ustaw intensywność każdego lasera tak, aby była jak najniższa. To ustawienie musi być określone empirycznie. Odpowiednia intensywność spowoduje uchwycenie hałaśliwej, ale możliwej do zinterpretowania sekwencji obrazu, przy czym sygnał fluorescencji wybieli się nie więcej niż 50% pod koniec 5-minutowego filmu. W zastosowanym tutaj mikroskopie konfokalnym (patrz tabela materiałów) intensywność ta odpowiada ustawieniu mocy lasera rzędu 5%.</li>
	<li>Użyj filtrów wycinających lub bramkowania czasowego, aby uniknąć przechwytywania odbitego światła z szkiełka nakrywkowego. Jeśli bramkowanie czasowe jest dostępne, ustaw okno bramkowania na 0,6-10,0 ns.</li>
	<li>Włącz obrazowanie w jasnym polu i użyj detektora o niskiej czułości do zbierania danych. Ustaw wzmocnienie na poziomie, który sprawi, że komórki będą wyraźnie widoczne. Nie należy używać różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), ponieważ pryzmat będzie zakłócał przechwytywanie wiarygodnych danych fluorescencyjnych.</li>
	<li>Ustaw interwał kroku Z na 0,25-0,35 μm. Wyobraź sobie całą objętość komórek drożdży, zbierając około 20-25 sekcji optycznych na stos Z. Określ kierunkowość obrazowania w taki sposób, aby "w dół" przesuwał się w kierunku szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>W przypadku typowego filmu ustaw odstęp czasu między stosami Z na 2 s i ustaw czas trwania filmu na 5 do 10 minut. W zależności od badanego przedziału zmniejsz interwał, aby uzyskać krótsze filmy o stosunkowo szybkiej dynamice, lub zwiększ interwał, aby uzyskać dłuższe filmy o stosunkowo niskiej dynamice.</li>
	<li>Zapisz film jako plik LIF z obrazami w jasnym polu w ostatnim kanale. Na tym etapie nie ma potrzeby stosowania większych głębi bitowych, a potok przetwarzania jest skonfigurowany do akceptowania 8-bitowych danych TIFF.</li>
</ol>
3. Dekonwolucja
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie do dekonwolucji (patrz tabela materiałów), używając klasycznego algorytmu szacowania maksymalnego prawdopodobieństwa.</li>
	<li>Otwórz zestaw danych wygenerowany w kroku 2.13. Wybierz "Kreator dekonwolucji". Sprawdź wartości wyświetlane w "Kreatorze parametrów". Parametry obrazowania powinny być wykryte i poprawnie wyświetlone. W sekcji "Współczynniki załamania światła" zmień wartość "Embedding med." na 1.40, aby przybliżyć cytoplazmę drożdży. W sekcji "szkiełko nakrywkowe" wybierz "Uruchom edytor" i "Oszacuj pozycję" oraz "OK", aby ustawić pozycję szkiełka nakrywkowego. Wybierz "Ustaw wszystkie zweryfikowane" i "Akceptuj".</li>
	<li>Postępuj zgodnie z "Kreatorem dekonwolucji" dla każdego kanału fluorescencji. Wybierz "Ręczny" jako tryb szacowania tła. Sprawdź profil intensywności fluorescencji surowych danych, aby określić szacowaną wartość tła, która zwykle wynosi około 0,1.</li>
	<li>W menu ustawień dekonwolucji wprowadź wartość "Maksymalne iteracje" 40 i wyłącz korekcję wybielacza. Wprowadź szacowaną wartość SNR, która zwykle wynosi około 5,0. Kliknij "Deconvolve".</li>
	<li>W razie potrzeby wróć do oryginalnego pliku danych, dostosuj wartości tła i SNR, a następnie powtórz dekonwolucję, aż szum zostanie wystarczająco usunięty, nie eliminując prawdziwej fluorescencji ze słabych struktur.</li>
	<li>Scal kanały jasnego pola i zdekonwolucji fluorescencji. W kolejnych krokach edycji filmu w ImageJ ułóż kanały w taki sposób, aby czerwony był pierwszy, zielony (jeśli jest) jest następny, niebieski (jeśli jest) jest następny, a jasne pole jest ostatnie. Zapisz sekwencję obrazów jako 8-bitowy plik TIFF.</li>
</ol>
4. Korekcja wybielacza i generowanie filmów
<ol>
	<li>Zaimportuj zdekonwoluowaną sekwencję obrazów do ImageJ i przekonwertuj ją na hyperstack, wybierając pozycję Obraz > Hyperstacks > Stack do Hyperstack. Wybierz "xyzct" z menu rozwijanego i wypełnij liczbę kanałów, wycinki stosu Z i ramy czasowe (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).</li>
	<li>Wybierz opcję Obraz > Kolor > Podziel kanały.</li>
	<li>Popraw kanały fluorescencji do fotowybielania za pomocą wtyczki ImageJ dostępnej w http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Po pobraniu i zainstalowaniu tej wtyczki wybierz Wtyczki > EMBLtools > Bleach Correction. Wybierz opcję "Dopasowanie wykładnicze".</li>
	<li>Aby scalić kanały fluorescencji z korekcją jasnego pola i wybielacza w hiperstos, wybierz opcje Obraz > Kolor > Scal kanały. Zapisz wynikowy hyperstack jako 8-bitowy plik TIFF.</li>
	<li><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58618/ImageJ.zip" target="_blank">Zainstaluj niestandardowe wtyczki ImageJ dostarczone z tym protokołem.</a> Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie, aby wyświetlić, edytować i określić ilościowo sekwencję obrazów oraz utworzyć końcowy film z wyświetlanymi stosami Z.</li>
</ol>

<ol><li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li>
<li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li>
<li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li>
<li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Golgi+apparatus%3A+insights+and+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li>
<li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li>
<li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232(2015).</li>
<li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting%2C+disruption%2C+replacement%2C+and+allele+rescue%3A+integrative+DNA+transformation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li>
<li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li>
<li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li>
<li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787(2017).</li>
<li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).</li>
<li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin%2C+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li>
<li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li>
<li>Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy.+3rd+edn%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li>
<li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obrazowanie konfokalne 4D organelli drożdży wymaga starannego dostrojenia wielu parametrów. Głównym problemem jest fotowybielanie i fototoksyczność. Typowy film 4D polega na zebraniu tysięcy sekcji optycznych, dlatego oświetlenie lasera musi być utrzymywane na jak najniższym poziomie. Tandemowe fluorescencyjne znaczniki białkowe mogą być używane do wzmacniania sygnału bez zwiększania ekspresji znakowanego białka16,17. Maksymalizacja prędkości skanowania pomaga og...

Przedziały systemu endomembranowego są w ciągłym ruchu, a ich pełna charakterystyka wymaga obrazowania żywych komórek. Opisano tutaj protokół, który wykorzystuje mikroskopię konfokalną 4D (time-lapse 3D) do wizualizacji fluorescencyjnie znakowanych przedziałów w pączkujących drożdżach. Metoda została opracowana w celu śledzenia dynamiki kompaktów wydzielniczych w Pichia pastoris i Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Protokół ten skupia się na S. cerevisiae, który ma nieułożony Golgi, w którym poszczególne cisternae są optycznie rozdzielalne4. Niezwykła organizacja Golgiego u S. cerevisiae umożliwiła zademonstrowanie za pomocą mikroskopii 4D, że Golgi cisterna początkowo znakuje się rezydentnymi wczesnymi białkami Golgiego, a następnie traci te białka, nabywając rezydentne późne białka Golgiego3,5. Przejście to można zwizualizować, tworząc szczep, w którym wczesne białko Golgiego Vrg4 jest znakowane GFP, podczas gdy późne białko Golgiego Sec7 jest znakowane monomerycznym czerwonym białkiem fluorescencyjnym. Gdy śledzone są poszczególne cisternae, dojrzewanie obserwuje się jako konwersję z zielonego na czerwony3. Ten rodzaj analizy może dostarczyć cennych informacji na temat lokalizacji białek i tożsamości kompartmentów. Na przykład, dwa białka z nieznacznie przesuniętymi czasami czasami mogą wydawać się oznaczać różne przedziały na obrazach statycznych, ale można je zobaczyć w filmach 4D, aby oznaczyć ten sam przedział w różnych punktach czasowych6,7. W ten sposób mikroskopia 4D ujawnia zjawiska, które w innym przypadku nie byłyby oczywiste.
Pouczająca mikroskopia 4D komór drożdżowych może być wykonana za pomocą odpowiednich procedur i sprzętu2. O ile to możliwe, znakowanie białek fluorescencyjnych odbywa się za pomocą wymiany genów8, aby uniknąć artefaktów nadekspresji. Ponieważ struktury wewnątrzkomórkowe są często bardzo dynamiczne, obrazowanie 4D jest potrzebne, aby zapewnić niezawodne śledzenie struktury w czasie. Opisany tutaj protokół wykorzystuje laserowy skaningowy mikroskop konfokalny wyposażony w detektory o wysokiej czułości. Za pomocą tego urządzenia cała objętość komórek S. cerevisiae może być obrazowana za pomocą mikroskopii konfokalnej mniej więcej co 1-3 s, przy czym typowe są odstępy 2 s. Dane można zbierać przez okres do 5-15 minut, w zależności od gęstości znakowania fluoroforów i ich właściwości fotofizycznych. Główną przeszkodą jest zminimalizowanie fotowybielania. W tym celu intensywność lasera jest utrzymywana na jak najniższym poziomie, prędkość skanowania konfokalnego jest maksymalizowana, a parametry optyczne są skonfigurowane tak, aby obrazować na granicy Nyquista, aby uchwycić odpowiednie informacje przy jednoczesnym uniknięciu nadmiernej ekspozycji na światło. Oczekuje się również, że te ustawienia złagodzą fototoksyczność, czynnik, który jest często pomijany podczas obrazowania żywych komórek9,10,11. Uzyskane zaszumione dane są przetwarzane za pomocą algorytmów korekcji wybielacza i dekonwolucji, aby ułatwić ilościowe określenie intensywności fluorescencji.
Nawet przy wysokiej jakości filmach 4D, analiza jest trudna, ponieważ komory drożdżowe są zazwyczaj liczne, niejednorodne i mobilne. Ze względu na wewnętrzne ograniczenia mikroskopii konfokalnej i nieoptymalne ustawienia wymagane do długotrwałego obrazowania 4D, struktury fluorescencyjne, które znajdują się blisko siebie, są trudne do rozdzielenia. Problem ten można obejść, skupiając się na niewielkiej liczbie struktur fluorescencyjnych, które pozostają optycznie rozdzielalne przez cały okres znakowania, przy założeniu, że struktury te są reprezentatywne dla całej populacji znakowanych przedziałów. Przedziały fluorescencyjne, które można niezawodnie śledzić, są identyfikowane poprzez oglądanie filmów z wyświetlanymi stosami Z i tworzenie serii montaży, w których sekcje optyczne dla każdego punktu czasowego są wyświetlane na ekranie komputera. Ta analiza wykorzystuje niestandardowe wtyczki ImageJ12, które pozwalają na śledzenie pojedynczej struktury w izolacji.
Ostatnie prace dotyczące metod dotyczyły zastosowania białek fluorescencyjnych w drożdżach13, a także teorii i praktyki konfokalnego obrazowania 4D komórek drożdży2. Protokół ten koncentruje się na kluczowych praktycznych aspektach eksperymentu z obrazowaniem 4D. Zawiera on pewne ulepszenia wcześniej opisanych procedur, a także zaktualizowane wersje kodu wtyczki ImageJ i dokumentacji. Pokazany przykład koncentruje się na dynamice Golgiego, ale ten protokół jest równie odpowiedni do obrazowania innych przedziałów drożdży.

<table><tbody><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem 35 mm nr 1.5</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Naczynia do obrazowania</td></tr><tr><td>Concanavalin A w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Vector Laboratories</td> Mikroskop konfokalny <td>CB-1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pakiet aplikacji Leica X&nbsp;</td><td>Oprogramowanie mikroskopowe Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Huygens Essential, wersja 17.04</td><td>Oprogramowanie do dekonwolucji</td><td>obrazowania</td><td></td></tr> objętościowego <tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów</td></tr></tbody></table>

mikroskopia 4d drożdży

4D Microscopy of Yeast

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie, jak tworzą się i przekształcają przedziały błony w żywych komórkach pączkujących drożdży. Wiele przedziałów wewnątrzkomórkowych u drożdży jest dynamicznych, a pełne zrozumienie ich właściwości wymaga obrazowania poklatkowego. Wielokolorowa konfokalna mikroskopia fluorescencyjna 4D to potężna metoda śledzenia zachowania i składu przedziału wewnątrzkomórkowego w skali czasowej 5-15 minut. Rygorystyczna analiza dynamiki przedziałów wymaga uchwycenia tysięcy sekcji optycznych. Aby osiągnąć ten cel, fotowybielanie i fototoksyczność są minimalizowane poprzez szybkie skanowanie przy bardzo niskiej mocy lasera, a wymiary pikseli i interwały kroku Z są ustawione na największe wartości, które są kompatybilne z próbkowaniem obrazu w pełnej rozdzielczości. Wynikowe zestawy danych 4D są zaszumione, ale można je wygładzić za pomocą dekonwolucji. Nawet w przypadku danych wysokiej jakości faza analizy jest trudna, ponieważ struktury wewnątrzkomórkowe są często liczne, niejednorodne i mobilne. Aby sprostać tej potrzebie, napisano niestandardowe wtyczki ImageJ, które tablicują dane 4D na ekranie komputera, identyfikują interesujące struktury, edytują dane w celu wyizolowania poszczególnych struktur, określają ilościowo przebiegi czasu fluorescencji i tworzą filmy z projektowanych stosów Z. Filmy 4D są szczególnie przydatne do odróżniania stabilnych przedziałów od przejściowych, które przewracają się w wyniku dojrzewania. Takie filmy mogą być również wykorzystywane do charakteryzowania zdarzeń, takich jak fuzja przedziałowa, oraz do testowania skutków określonych mutacji lub innych perturbacji.

Przykład przedstawiony w niniejszym opracowaniu dokumentuje i kwantyfikuje dojrzewanie dwóch cystern aparatu Golgiego w drożdżach, wizualizowane za pomocą dwukolorowej konfokalnej mikroskopii 4D3. Komórka drożdży zawiera od 10 do 15 cystern aparatu Golgiego, z których każda dojrzewa w ciągu około 2-4 min. Dojrzewanie można wizualizować poprzez znakowanie wczesnego markera Golgiego Vrg4 białkiem GFP oraz późnego markera Golgiego Sec7 czerwonym białkiem fluorescencyj...

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Ta metoda śledzi struktury w komórkach drożdży w trzech wymiarach przez wiele minut, co pozwala nam badać dynamikę wewnątrzkomórkowych organelli i kompartmentów. Obrazowanie 4D zapewnia, że możemy wyciągnąć wiarygodne wnioski na temat dynamiki wewnątrzkomórkowej, szczególnie w przypadku struktur lub markerów, które mogą być przejściowe. Procedurę zademonstruje Natalie Johnson, doktor habilitowany z mojego laboratorium.Zacznij od wyhodowania przez noc hodowli interesującego szczepu drożdży w pięciu mililitrach niefluorescencyjnej pożywki syntetycznej zdefiniowanej lub NSD, w 15-mililitrowej kolbie z przegrodą z dobrym napowietrzeniem, w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Trzy do czterech godzin przed analizą rozcieńczyć kulturę drożdży w fazie logarytmicznej w świeżej pożywce NSD, tak aby końcowa gęstość optyczna przy 600 nanometrach, czyli OD600, wynosiła od 0,5 do 0,8 w momencie obrazowania. Co najmniej godzinę przed przygotowaniem hodowli odwirować podwielokrotność roztworu Concanavalin A o dwóch miligramach na mililitr przez pięć minut z pełną prędkością, aby osadzać wszelkie cząstki stałe, a następnie dodać 250 mikrolitrów supernatantu do czystego naczynia mikroskopowego ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów.Po 15 minutach umyj naczynie dwa do trzech razy dwoma mililitrami wody destylowanej na mycie, dodając 250 mikrolitrów kultury drożdży do naczynia pokrytego Concanavalin A po jego wysuszeniu. Odczekaj 10 minut, aby komórki przylgnęły, a następnie delikatnie umyj naczynie jeszcze dwa do trzech razy dwoma mililitrami świeżej pożywki NSD. Następnie przykryj komórki dwoma mililitrami świeżego NSD.Aby zobrazować komórki drożdży, wybierz soczewkę immersyjną z olejkiem 63X z aperturą numeryczną co najmniej 1,4 w mikroskopie konfokalnym. W tym przypadku zamiast obiektywu 63X można również użyć soczewki obiektywowej 100X. Następnie umieść naczynie na soczewce obiektywu, nakrapianej olejkiem immersyjnym.Z menu rozwijanego na karcie Tryb akwizycji wybierz xyzt. Na karcie XY sformatuj rozmiar ramki do 256 szerokości i 128 wysokości. Użyj maksymalnej szybkości skanowania, która zwykle wynosi około ośmiu kiloherców.Włącz dwukierunkowe skanowanie X, jeśli jest dostępne, i ustaw współczynnik powiększenia na dziewięć, co spowoduje rozmiar piksela około 80 nanometrów. Jeśli używany jest obiektyw 100X, odpowiednio dostosuj współczynnik powiększenia, aby zachować rozmiar piksela około 80 nanometrów. Następnie ustaw akumulację linii na cztery lub sześć.Ustaw otworek na 1,2 jednostki Airy i włącz laser światła białego, jeśli jest dostępny. Następnie ustaw długość fali wzbudzenia i procentową moc lasera dla każdego kanału fluorescencji. Jeśli to możliwe, włącz tryb zliczania fotonów w zakładce konfiguracji, usuwając zaznaczenie maksymalnego czasu integracji.Dla każdego kanału fluorescencji przypisz detektor o wysokiej czułości, ustaw zakres długości fali emisji i włącz tryb zliczania fotonów, jeśli jest dostępny. Ustaw okno bramkowania czasu na 0,6 do 10 nanosekund dla każdego kanału fluorescencji, aby uniknąć przechwytywania odbitego światła ze szklanej naczynia. Następnie włącz obrazowanie w jasnym polu i wybierz detektor o niskiej czułości do zbierania danych.Włącz tryb obrazowania na żywo i zwiększ wzmocnienie w kanale jasnego pola, aż komórki będą wyraźnie widoczne. W trybie zliczania fotonów zmień zakres wartości szarości z ręcznego na automatyczny, aby wyświetlić sygnał fluorescencyjny. Ustaw stos Z tak, aby obrazował całą objętość komórek drożdży i określ kierunek obrazowania w taki sposób, aby dół przesuwał się w kierunku szkiełka nakrywkowego.Ustaw interwał kroku Z na 0.25 do 0.35 mikrometra, aby uzyskać około 20 do 25 sekcji optycznych na stos Z, i włącz Galvo Flow, jeśli jest dostępny. W przypadku typowego filmu ustaw odstęp czasu między stosami Z na dwie sekundy i ustaw czas trwania filmu na pięć do 10 minut. Następnie zapisz film jako plik LIF.W celu dekonwolucji filmu uruchom odpowiedni program do dekonwolucji, który korzysta z klasycznego algorytmu szacowania maksymalnego prawdopodobieństwa, i otwórz serię danych. Wybierz kreatora dekonwolucji i edytor parametrów, aby potwierdzić, że parametry obrazowania zostały wykryte i poprawnie wyświetlone. Zmień wartość współczynnika załamania światła ośrodka osadzającego na 1,4, aby przybliżyć cytoplazmę drożdży.Następnie użyj edytora, aby oszacować pozycję szkiełka nakrywkowego. Wybierz opcję Ustaw wszystkie zweryfikowane i kliknij przycisk Akceptuj, a następnie wybierz pozycję Wprowadź kreatora. Kliknij następną strzałkę, aby pominąć etapy wyboru funkcji rozlewu punktowego i wstępnego przetwarzania kadrowania, a następnie przejdź przez kreatora dekonwolucji dla każdego kanału fluorescencji.Wybierz funkcję obliczeniowego logarytmicznego mapowania pionowego i sprawdź profil intensywności fluorescencji nieprzetworzonych danych. Ustaw ręczny jako tryb szacowania tła, wprowadź wartość tła i kliknij przycisk Akceptuj. Pozostaw maksymalną wartość iteracji na poziomie 40 i wprowadź szacowany stosunek sygnału do szumu.Następnie wyłącz korekcję wybielacza i kliknij przycisk Deconvolve. Wybierz opcję Zaakceptuj do następnego kanału w oknie wyników dekonwolucji, jeśli szum jest wystarczająco usuwany bez eliminowania prawdziwej fluorescencji z przyciemnionych struktur. Gdy wszystkie kanały fluorescencyjne zostaną zadowalająco zdekonwolucjonizowane, kliknij przycisk Wszystko gotowe i najpierw ułóż kanał czerwony, a następnie kanały zielone, niebieskie i jasne pole, w celu późniejszej edycji w ImageJ.Następnie zapisz sekwencję obrazu jako ośmiobitowy plik TIF i wybierz jeden plik na kanał i rozciągnięcie kontrastu jako tryb konwersji. Aby uzyskać korekcję wybielania, zaimportuj zdekonwolucjonizowane sekwencje obrazów do ImageJ i kliknij Obraz, Hyperstacks i Stos do Hyperstack, aby przekonwertować obrazy na hyperstack. Wybierz xyzct z menu rozwijanego i wprowadź liczbę kanałów, wycinki stosu Z i ramy czasowe.Aby skorygować kanały fluorescencji dla wybielania zdjęć, wybierz Obraz, Kolor, Podzielone kanały, a dla kanałów fluorescencyjnych wybierz Wtyczki, EMBLtools, Korekcja wybielania i Dopasowanie wykładnicze. Następnie wybierz opcję Image, Color (Kanały) i Merge Channels (Scalanie kanałów) obrazu, color i scalania (Merge Channels), aby scalić kanały fluorescencji z korekcją jasnego pola i wybielacza w hiperstos w hiperstos z korekcją wybielacza w celu późniejszego generowania i edycji filmu jako ośmiobitowy plik TIF. Aby przekonwertować zestaw danych z korektą dekonwolucyjną i wybielania na montaż skalowany, wybierz Wtyczki, IJ_Plugins i Utwórz serię montażu, a następnie wybierz odpowiedni ośmiobitowy hiperstos.Kliknij przycisk Otwórz i OK, aby zaakceptować, że wszystkie plasterki zostaną użyte do utworzenia montażu, a następnie ponownie kliknij przycisk OK, aby zaakceptować sugerowaną wartość współczynnika skali. Zapisz oryginalny montaż jako ośmiobitowy plik TIF i wybierz Wtyczki, IJ_Plugins, Seria montażu do Hyperstack i OK, aby utworzyć hiperstos 4D z oryginalnego montażu, który zawiera wszystkie ramy czasowe. Aby wygenerować oryginalny przeciętny wyświetlany film, najpierw wybierz Wtyczki, IJ_Plugins, Project Hyperstack i OK, aby zaakceptować domyślne parametry ZProjection.Zapisz przeciętny wyświetlany film jako ośmiobitowy plik TIF i sprawdź film, aby zidentyfikować poszczególne struktury, które można śledzić przez cały okres ich etykietowania. Identyfikacja struktury, którą można wiarygodnie śledzić przez cały czas trwania filmu, oraz wyodrębnienie tej struktury do analizy, to najważniejsze kroki procedury. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku użytkownika wtyczki, aby wyizolować interesujące Cię struktury, edytując montaż.Utwórz hiperstos 4D na podstawie edytowanego montażu dla okresu zawierającego interesujące Cię struktury, a następnie zapisz edytowany hiperstos. Aby określić ilościowo intensywność fluorescencji w czasie dla izolowanej struktury w edytowanym hiperstosie 4D, wybierz Wtyczki, IJ_Plugins i Analizuj edytowany film, wprowadź odstęp czasu między stosami Z i kliknij OK.To utworzyć ostateczny film izolowanej struktury, wybierz Wtyczki, IJ_Plugins i Project Hyperstack, określ wycinki stosu Z, które powinny zostać uwzględnione, wybierz opcję Średnia intensywność jako typ projekcji i kliknij OK.To utworzyć hiperstos 4D z oryginalnymi danymi na edytowanych danych, wybierz wtyczki, IJ_Plugins, Scal dwie hiperstosy i Umieść pierwszy nad drugim. Aby wygenerować film z hiperstosu 4D z oryginalnymi danymi na edytowanych danych, wybierz opcje Wtyczki, IJ_Plugins i Project Hyperstack, określ plasterki stosu Z, które mają zostać uwzględnione, wybierz opcję Średnia intensywność jako typ projekcji i kliknij przycisk OK. W tym przypadku pierwsza klatka projekcji stosu Z surowych danych może być porównana z tymi samymi danymi zdekonwoluowanymi i skorygowanymi o wybielanie.Te klatki z tego samego filmu z dekonwolucją i korektą wybielacza pokazują dwie cysterny, które były analizowane, które najpierw znakują zielonym markerem białka glikozylacji oporności na wanadan 4 lub Vrg4, a później czerwonym markerem białka transportu genu Secretory 7 lub Sec7. Ten montaż, stworzony z zdekonwolucjonizowanego i skorygowanego wybielaczem hiperstosu, pokazuje wszystkie sekcje optyczne w jednym punkcie czasowym przed i po edycji, aby umożliwić izolację sygnału od jednego z wybranych cystern. Na tym rysunku pokazanych jest kilka klatek z końcowego filmu wyświetlanych stosów Z oryginalnymi projekcjami na górze rysunku i edytowanymi projekcjami na dole.Kwantyfikacja zielonych i czerwonych sygnałów fluorescencyjnych z wybranych cystern Golgiego ujawnia, że zielony znacznik Vrg4 pojawia się i utrzymuje się przez około 80 sekund, po czym pojawia się czerwony znacznik Sec7 i utrzymuje się przez około 60 sekund, z krótkim zachodzeniem na siebie między dwoma znacznikami. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zidentyfikować struktury, które można jednoznacznie śledzić przez cały okres ich życia. Ten sam rodzaj analizy można przeprowadzić po dokonaniu mutacji lub innego rodzaju specyficznego zaburzenia erekcji.Technika ta otworzyła drogę do badania dynamicznego zachowania cystern Golgiego i miejsc wyjścia retikulum endoplazmatycznego przy użyciu drożdży jako systemu modelowego.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Metoda zatapiania kolonii drożdży umożliwiająca wykonywanie przekrojów do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Protokół ten pozwala na określenie rozmieszczenia komórek zsporulowanych i komórek pseudohifowych w obrębie kolonii, stanowiąc nowe narzędzie do zrozumienia organizacji typów komórek w obrębie społeczności grzybowej.

Metoda zatapiania kolonii drożdży

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Przedstawiamy protokół zamrażania i kriosekcji społeczności drożdży w celu obserwacji wewnętrznych wzorców komórek fluorescencyjnych.  Metoda opiera się na wiązaniu metanolu i osadzaniu OCT w celu zachowania przestrzennego rozmieszczenia komórek bez inaktywacji białek fluorescencyjnych w społeczności.

Kriosekcja zbiorowisk drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj wielokolorową mikroskopię konfokalną 4D do analizy dynamiki organelli w komórkach drożdży. Ta metoda umożliwia śledzenie fluorescencyjnie znakowanych struktur w czasie, wspierając badania biologii komórki.

Mikroskopia 4D drożdży

Przeglądaj więcej filmów