Mikroskopia 4D drożdży

Ta metoda śledzi struktury w komórkach drożdży w trzech wymiarach przez wiele minut, co pozwala nam badać dynamikę wewnątrzkomórkowych organelli i kompartmentów. Obrazowanie 4D zapewnia, że możemy wyciągnąć wiarygodne wnioski na temat dynamiki wewnątrzkomórkowej, szczególnie w przypadku struktur lub markerów, które mogą być przejściowe. Procedurę zademonstruje Natalie Johnson, doktor habilitowany z mojego laboratorium.

Zacznij od wyhodowania przez noc hodowli interesującego szczepu drożdży w pięciu mililitrach niefluorescencyjnej pożywki syntetycznej zdefiniowanej lub NSD, w 15-mililitrowej kolbie z przegrodą z dobrym napowietrzeniem, w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Trzy do czterech godzin przed analizą rozcieńczyć kulturę drożdży w fazie logarytmicznej w świeżej pożywce NSD, tak aby końcowa gęstość optyczna przy 600 nanometrach, czyli OD600, wynosiła od 0,5 do 0,8 w momencie obrazowania. Co najmniej godzinę przed przygotowaniem hodowli odwirować podwielokrotność roztworu Concanavalin A o dwóch miligramach na mililitr przez pięć minut z pełną prędkością, aby osadzać wszelkie cząstki stałe, a następnie dodać 250 mikrolitrów supernatantu do czystego naczynia mikroskopowego ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów.

Po 15 minutach umyj naczynie dwa do trzech razy dwoma mililitrami wody destylowanej na mycie, dodając 250 mikrolitrów kultury drożdży do naczynia pokrytego Concanavalin A po jego wysuszeniu. Odczekaj 10 minut, aby komórki przylgnęły, a następnie delikatnie umyj naczynie jeszcze dwa do trzech razy dwoma mililitrami świeżej pożywki NSD. Następnie przykryj komórki dwoma mililitrami świeżego NSD.

Aby zobrazować komórki drożdży, wybierz soczewkę immersyjną z olejkiem 63X z aperturą numeryczną co najmniej 1,4 w mikroskopie konfokalnym. W tym przypadku zamiast obiektywu 63X można również użyć soczewki obiektywowej 100X. Następnie umieść naczynie na soczewce obiektywu, nakrapianej olejkiem immersyjnym.

Z menu rozwijanego na karcie Tryb akwizycji wybierz xyzt. Na karcie XY sformatuj rozmiar ramki do 256 szerokości i 128 wysokości. Użyj maksymalnej szybkości skanowania, która zwykle wynosi około ośmiu kiloherców.

Włącz dwukierunkowe skanowanie X, jeśli jest dostępne, i ustaw współczynnik powiększenia na dziewięć, co spowoduje rozmiar piksela około 80 nanometrów. Jeśli używany jest obiektyw 100X, odpowiednio dostosuj współczynnik powiększenia, aby zachować rozmiar piksela około 80 nanometrów. Następnie ustaw akumulację linii na cztery lub sześć.

Ustaw otworek na 1,2 jednostki Airy i włącz laser światła białego, jeśli jest dostępny. Następnie ustaw długość fali wzbudzenia i procentową moc lasera dla każdego kanału fluorescencji. Jeśli to możliwe, włącz tryb zliczania fotonów w zakładce konfiguracji, usuwając zaznaczenie maksymalnego czasu integracji.

Dla każdego kanału fluorescencji przypisz detektor o wysokiej czułości, ustaw zakres długości fali emisji i włącz tryb zliczania fotonów, jeśli jest dostępny. Ustaw okno bramkowania czasu na 0,6 do 10 nanosekund dla każdego kanału fluorescencji, aby uniknąć przechwytywania odbitego światła ze szklanej naczynia. Następnie włącz obrazowanie w jasnym polu i wybierz detektor o niskiej czułości do zbierania danych.

Włącz tryb obrazowania na żywo i zwiększ wzmocnienie w kanale jasnego pola, aż komórki będą wyraźnie widoczne. W trybie zliczania fotonów zmień zakres wartości szarości z ręcznego na automatyczny, aby wyświetlić sygnał fluorescencyjny. Ustaw stos Z tak, aby obrazował całą objętość komórek drożdży i określ kierunek obrazowania w taki sposób, aby dół przesuwał się w kierunku szkiełka nakrywkowego.

Ustaw interwał kroku Z na 0.25 do 0.35 mikrometra, aby uzyskać około 20 do 25 sekcji optycznych na stos Z, i włącz Galvo Flow, jeśli jest dostępny. W przypadku typowego filmu ustaw odstęp czasu między stosami Z na dwie sekundy i ustaw czas trwania filmu na pięć do 10 minut. Następnie zapisz film jako plik LIF.

W celu dekonwolucji filmu uruchom odpowiedni program do dekonwolucji, który korzysta z klasycznego algorytmu szacowania maksymalnego prawdopodobieństwa, i otwórz serię danych. Wybierz kreatora dekonwolucji i edytor parametrów, aby potwierdzić, że parametry obrazowania zostały wykryte i poprawnie wyświetlone. Zmień wartość współczynnika załamania światła ośrodka osadzającego na 1,4, aby przybliżyć cytoplazmę drożdży.

Następnie użyj edytora, aby oszacować pozycję szkiełka nakrywkowego. Wybierz opcję Ustaw wszystkie zweryfikowane i kliknij przycisk Akceptuj, a następnie wybierz pozycję Wprowadź kreatora. Kliknij następną strzałkę, aby pominąć etapy wyboru funkcji rozlewu punktowego i wstępnego przetwarzania kadrowania, a następnie przejdź przez kreatora dekonwolucji dla każdego kanału fluorescencji.

Wybierz funkcję obliczeniowego logarytmicznego mapowania pionowego i sprawdź profil intensywności fluorescencji nieprzetworzonych danych. Ustaw ręczny jako tryb szacowania tła, wprowadź wartość tła i kliknij przycisk Akceptuj. Pozostaw maksymalną wartość iteracji na poziomie 40 i wprowadź szacowany stosunek sygnału do szumu.

Następnie wyłącz korekcję wybielacza i kliknij przycisk Deconvolve. Wybierz opcję Zaakceptuj do następnego kanału w oknie wyników dekonwolucji, jeśli szum jest wystarczająco usuwany bez eliminowania prawdziwej fluorescencji z przyciemnionych struktur. Gdy wszystkie kanały fluorescencyjne zostaną zadowalająco zdekonwolucjonizowane, kliknij przycisk Wszystko gotowe i najpierw ułóż kanał czerwony, a następnie kanały zielone, niebieskie i jasne pole, w celu późniejszej edycji w ImageJ.

Następnie zapisz sekwencję obrazu jako ośmiobitowy plik TIF i wybierz jeden plik na kanał i rozciągnięcie kontrastu jako tryb konwersji. Aby uzyskać korekcję wybielania, zaimportuj zdekonwolucjonizowane sekwencje obrazów do ImageJ i kliknij Obraz, Hyperstacks i Stos do Hyperstack, aby przekonwertować obrazy na hyperstack. Wybierz xyzct z menu rozwijanego i wprowadź liczbę kanałów, wycinki stosu Z i ramy czasowe.

Aby skorygować kanały fluorescencji dla wybielania zdjęć, wybierz Obraz, Kolor, Podzielone kanały, a dla kanałów fluorescencyjnych wybierz Wtyczki, EMBLtools, Korekcja wybielania i Dopasowanie wykładnicze. Następnie wybierz opcję Image, Color (Kanały) i Merge Channels (Scalanie kanałów) obrazu, color i scalania (Merge Channels), aby scalić kanały fluorescencji z korekcją jasnego pola i wybielacza w hiperstos w hiperstos z korekcją wybielacza w celu późniejszego generowania i edycji filmu jako ośmiobitowy plik TIF. Aby przekonwertować zestaw danych z korektą dekonwolucyjną i wybielania na montaż skalowany, wybierz Wtyczki, IJ_Plugins i Utwórz serię montażu, a następnie wybierz odpowiedni ośmiobitowy hiperstos.

Kliknij przycisk Otwórz i OK, aby zaakceptować, że wszystkie plasterki zostaną użyte do utworzenia montażu, a następnie ponownie kliknij przycisk OK, aby zaakceptować sugerowaną wartość współczynnika skali. Zapisz oryginalny montaż jako ośmiobitowy plik TIF i wybierz Wtyczki, IJ_Plugins, Seria montażu do Hyperstack i OK, aby utworzyć hiperstos 4D z oryginalnego montażu, który zawiera wszystkie ramy czasowe. Aby wygenerować oryginalny przeciętny wyświetlany film, najpierw wybierz Wtyczki, IJ_Plugins, Project Hyperstack i OK, aby zaakceptować domyślne parametry ZProjection.

Zapisz przeciętny wyświetlany film jako ośmiobitowy plik TIF i sprawdź film, aby zidentyfikować poszczególne struktury, które można śledzić przez cały okres ich etykietowania. Identyfikacja struktury, którą można wiarygodnie śledzić przez cały czas trwania filmu, oraz wyodrębnienie tej struktury do analizy, to najważniejsze kroki procedury. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku użytkownika wtyczki, aby wyizolować interesujące Cię struktury, edytując montaż.

Utwórz hiperstos 4D na podstawie edytowanego montażu dla okresu zawierającego interesujące Cię struktury, a następnie zapisz edytowany hiperstos. Aby określić ilościowo intensywność fluorescencji w czasie dla izolowanej struktury w edytowanym hiperstosie 4D, wybierz Wtyczki, IJ_Plugins i Analizuj edytowany film, wprowadź odstęp czasu między stosami Z i kliknij OK.To utworzyć ostateczny film izolowanej struktury, wybierz Wtyczki, IJ_Plugins i Project Hyperstack, określ wycinki stosu Z, które powinny zostać uwzględnione, wybierz opcję Średnia intensywność jako typ projekcji i kliknij OK.To utworzyć hiperstos 4D z oryginalnymi danymi na edytowanych danych, wybierz wtyczki, IJ_Plugins, Scal dwie hiperstosy i Umieść pierwszy nad drugim. Aby wygenerować film z hiperstosu 4D z oryginalnymi danymi na edytowanych danych, wybierz opcje Wtyczki, IJ_Plugins i Project Hyperstack, określ plasterki stosu Z, które mają zostać uwzględnione, wybierz opcję Średnia intensywność jako typ projekcji i kliknij przycisk OK. W tym przypadku pierwsza klatka projekcji stosu Z surowych danych może być porównana z tymi samymi danymi zdekonwoluowanymi i skorygowanymi o wybielanie.

Te klatki z tego samego filmu z dekonwolucją i korektą wybielacza pokazują dwie cysterny, które były analizowane, które najpierw znakują zielonym markerem białka glikozylacji oporności na wanadan 4 lub Vrg4, a później czerwonym markerem białka transportu genu Secretory 7 lub Sec7. Ten montaż, stworzony z zdekonwolucjonizowanego i skorygowanego wybielaczem hiperstosu, pokazuje wszystkie sekcje optyczne w jednym punkcie czasowym przed i po edycji, aby umożliwić izolację sygnału od jednego z wybranych cystern. Na tym rysunku pokazanych jest kilka klatek z końcowego filmu wyświetlanych stosów Z oryginalnymi projekcjami na górze rysunku i edytowanymi projekcjami na dole.

Kwantyfikacja zielonych i czerwonych sygnałów fluorescencyjnych z wybranych cystern Golgiego ujawnia, że zielony znacznik Vrg4 pojawia się i utrzymuje się przez około 80 sekund, po czym pojawia się czerwony znacznik Sec7 i utrzymuje się przez około 60 sekund, z krótkim zachodzeniem na siebie między dwoma znacznikami. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zidentyfikować struktury, które można jednoznacznie śledzić przez cały okres ich życia. Ten sam rodzaj analizy można przeprowadzić po dokonaniu mutacji lub innego rodzaju specyficznego zaburzenia

Technika ta otworzyła drogę do badania dynamicznego zachowania cystern Golgiego i miejsc wyjścia retikulum endoplazmatycznego przy użyciu drożdży jako systemu modelowego.