Budowa wielowarstwowego arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych z systemem dynamicznej hodowli 3D

Terapia komórkami macierzystymi jest powszechnie opisywana jako obiecująca metoda leczenia wielu chorób. Techniki arkuszy komórkowych zostały opracowane w celu poprawy retencji komórek i przeżywalności w obrębie celów. Podczas budowy arkuszy komórkowych niewystarczające zaopatrzenie w składniki odżywcze pozostaje kluczowym problemem utraty funkcji komórek macierzystych i jest niezadowalającą właściwością komórek macierzystych, która ostatecznie wpłynęłaby na efekty terapeutyczne in vivo.

Naszym celem, aby przygotować dostępny wielowarstwowy arkusz komórek macierzystych, nasz zespół opracował komórkowe rusztowanie o rozmiarach biegunów, osierdzia i arkusza komórkowego. Opierając się na rusztowaniu, wielowarstwowy starter komórek zostanie szybko zbudowany z wodoru bez apeptydu, a system perfuzji dynamicznej jest używany w celu zapewnienia zaopatrzenia komórek macierzystych w składniki odżywcze in vitro. Wyjmij wysuszone rusztowanie DBP i umieść je na środku czarnej podstawy.

Umieść biały pierścień napinający na rusztowaniu DBP i przymocuj go do nośnika tkankowego. Upewnij się, że rusztowanie DBP jest całkowicie zamocowane w nośniku tkankowym. Dodaj 100 mikrolitrów pożywek hodowlanych na rusztowaniu DBP.

Umieść rusztowanie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól mu moczyć się przez 15 minut. Wyjmij komórki z inkubatora, wyjmij pożywki hodowlane z naczynia hodowlanego, delikatnie umyj komórki dwoma mililitrami ciepłego PBS. Usuń cały PBS z naczynia hodowlanego i upewnij się, że nie pozostał żaden płyn.

Dodaj dwa mililitry do 1,25% roztworu trypsyny do naczynia i inkubuj komórki przez trzy minuty. Zatrzymaj działanie trypsyny, dodając dwa mililitry pożywki hodowlanej. Delikatnie umyj komórki z naczynia.

Przenieś zawiesiny komórek do nowej 15-mililitrowej rurki odśrodkowej. Odwiruj komórki pod 220-krotnością grawitacji przez pięć minut i uzyskaj osady komórkowe. Usuń supernatant i zetrzyj osad komórkowy.

Ponownie zawiesić komórki za pomocą trzech mililitrów 10% roztworu sacharozy. Odessaj zawiesinę komórkową o pojemności 10 mikrolitrów, a numer komórki zawartości odczytuje hemocytometr, wyodrębnij trzy miliony komórek i przenieś do nowej 1,5-mililitrowej rurki odśrodkowej. Odwirować komórki w pierwiastku 220 razy kwadratowym przez pięć minut, całkowicie usunąć supernatanty i uzyskać osad komórek.

Przygotuj 20 mikrolitrów 10% roztworu sacharozy. Delikatnie ponownie zawiesić komórki i uzyskać jednolitą zawiesinę. Dodaj 20 mikrolitrów peptydowego hydrożelu na górze zawiesiny, delikatnie wymieszaj peptydowy hydrożel i zawiesinę komórek z T, wyjmij rusztowanie DBP, pozostawiając nośnik tkankowy, a następnie delikatnie odessaj medianę kamienia za pomocą T. Odessać mieszaninę mieszaniny i równomiernie dodać do rusztowania DBP.

Dodaj jeden mililitr edetynianu wapnia na dno nośnika tkankowego. Delikatnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej do naczynia hodowlanego, a następnie wyjdź z arkusza komórek. Umieść komórki w inkubatorze na dwie godziny, pozwól im się wyhodować.

System dynamicznej perfuzji składa się z pojemnika do hodowli perfuzyjnej, rekulacji wymieniającej gaz i szklanej butelki. Zespoły są dynamicznymi systemami perfuzyjnymi, jak pokazano na rysunku. Dodaj dwie hydromililitry mediany hodowli do szklanej butelki.

Włóż arkusz komórek do komory pojemnika do hodowli, dodaj trzy mililitry mediany hodowli do pojemnika, umieść dynamiczne systemy perfuzyjne w inkubatorach i rozpocznij pompowanie. Otwórz pojemnik na kulturę w leżącym bipozytywie. Wyjmij arkusz komórek z pojemnika na kulturę i umieść go w naczyniu hodowlanym.

Użyj jednego kleszczyka, aby unieruchomić nośnik tkanki i użyj kolejnych dwóch kleszczy, aby oddzielić biały pierścień napinający od czarnej podstawy. Na koniec uzyskaj wielowarstwowy arkusz komórek. Rusztowanie DBP jest przezroczyste.

Odsprzedaż SEM pokazuje, że uczelnie przejęte, a komponenty są całkowicie zarezerwowane. Arkusze komórek można uzyskać i przytrzymać za pomocą kleszczy w celu krótkiej konserwacji. Te arkusze komórek można przenieść do cylindrycznej rurki o średnicy 1,5 mililitra.

Jako model, na przykład, zaczynając od wykazania w komórkach BMFC, wysoce dodatniego markera komórek macierzystych CD 9O i CD 29. Po zbudowaniu ogniwa, BMFC opuszczając arkusz ogniw, pozostaje wysoki poziom rozszerzalności CD 90 i CD 29. Skonstruowanie wielowarstwowej struktury komórkowej jest krytycznym krokiem protokołu.

Czas patelni wymaga czterech hydrożeli, gdy wartość pH zmienia się z SA na neutralną, dlatego ważne jest, aby umyć komórkę roztworem sacharozy, aby usunąć jony powierzchniowe. Również stosunek objętościowy zawiesiny komórkowej i pantihydrożelu nie jest dobrym przyjacielem do budowy tymczasowej struktury wielowarstwowej. Po utworzeniu struktury komórek macierzystych 3D zobaczysz, że dynamiczny system perfuzji jest ważny dla stabilizacji wielowarstwowej struktury, a także utrzymania żywotności komórek macierzystych.

Dynamiczna infiltracja mediany hodowli może ułatwić komórkom macierzystym namnażanie się i ekstrapolację kontekstu komórkowego w strukturze wielowarstwowej, a termometry do hodowli dynamicznych powinny być dostosowane do różnych typów komórek macierzystych.