Osadzanie biofilmu we wzorze w wysokiej rozdzielczości przy użyciu pDawn-Ag43

Opracowaliśmy metodę zwaną litografią biofilmu, która polega na kierowaniu światła na powierzchnię, a bakterie gromadzą się tam, gdzie jest światło. Metoda ta pozwoli nam odpowiedzieć na kluczowe pytanie w badaniach nad biofilmem, na przykład jak struktury przestrzenne wpływają na funkcje zbiorowiska. Ta metoda ma wiele zalet.

Na przykład działa w bardzo wysokiej rozdzielczości 25 mikrometrów, nie wymaga wstępnego modelowania powierzchni, a także działa wewnątrz zamkniętych urządzeń hydraulicznych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w związek struktura-funkcja naturalnych biofilmów, może być również stosowana w innych dyscyplinach, takich jak inżynieria biofilmu, biomateriały i wielokomórkowa biologia syntetyczna. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ istnieją kluczowe kroki wstępne w celu przygotowania zestawu hodowli optycznej i próbki bakteryjnej przed modelowaniem biofilmu.

Najpierw przekształć plazmid pDawn-Ag43 w interesujący szczep E. coli i umieść go na płytce agarowej LB uzupełnionej spektynomycyną. Zaszczepić pojedynczą kolonię w bulionie LB spektynomycyną w probówce hodowlanej i wyhodować ją do fazy wykładniczej w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. Po zaszczepieniu przygotuj 25% glicerolu z przekształconego szczepu pDawn-Ag43, mieszając jeden mililitr 50% sterylnego glicerolu z jednym mililitrem kultury w krioprobówce.

Przechowuj bulion w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie rozpocznij przygotowanie zestawu optycznego, umieszczając przenośny projektor na dnie inkubatora bakteryjnego z otworem skierowanym bezpośrednio do góry na sufit, gdzie zostanie przymocowana komora do hodowli biofilmu. Podłącz laptopa za pomocą wyświetlacza do projektora wewnątrz inkubatora.

Użyj taśmy, aby przymocować pustą atrapę naczynia hodowlanego do sufitu inkubatora. Wyreguluj ostrość na projektorze, obracając pokrętło ostrości tak, aby płaszczyzna ostrości pokrywała się z dolną powierzchnią naczynia do hodowli biofilmu przymocowanego do sufitu inkubatora. Projektor powinien oświetlić ostry, nierozmyty obraz na dnie naczynia hodowlanego.

Wyjmij fikcyjne naczynie hodowlane po zoptymalizowaniu projekcji. Korzystając z oprogramowania laptopa, skieruj projektor tak, aby oświetlił pełne pole widzenia z maksymalnym niebieskim oświetleniem, prezentując pełny niebieski slajd. Zmierz natężenie oświetlenia projektora za pomocą miernika mocy optycznej, umieszczając głowicę fotodetektora na suficie inkubatora i odczytując natężenie na odpowiednim mierniku mocy skalibrowanym do długości fali światła 460 nanometrów.

Następnie wyreguluj intensywność oświetlenia za pomocą regulowanego filtra o neutralnej gęstości umieszczonego na przysłonie projektora. Obróć filtr, aby wyregulować intensywność oświetlenia mierzoną przez miernik mocy, aż intensywność oświetlenia w środku obszaru emitowanego przez niebieskie światło wskaże 50 mikrowatów na centymetr kwadratowy. Ważne jest, aby upewnić się, że intensywność oświetlenia jest ustawiona na odpowiednim poziomie za pomocą skalibrowanego fotodetektora umieszczonego na suficie inkubatora.

Pozwala to na dokładne dostrojenie intensywności oświetlenia poprzez obracanie filtra o neutralnej gęstości. Teraz narysuj dowolne wzory za pomocą oprogramowania projektora do prezentacji na laptopie i wyświetl te wzory na suficie inkubatora za pomocą projektora. Przed oświetleniem rozprowadź szczep pDawn-Ag43 z wywaru glicerolowego na płytce agarowej LB-plus-spec.

Pozwól koloniom rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zaszczepić kolonię bakterii pDawn-Ag43 z płytki agarowej w bulionie LB-plus-spec i hodować kulturę przez noc do fazy stacjonarnej w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. Następnego dnia rozcieńczyć kulturę w stosunku 1 do 1 000 w bulionie LB ze spektynomycyną.

Pozwól rozcieńczonej kulturze rosnąć w inkubatorze z wytrząsaniem przez sześć godzin przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza do późnej fazy wykładniczej, wczesnej fazy stacjonarnej. Ważne jest, aby rozcieńczyć kulturę przez noc i osiągnąć późną fazę wykładniczą przed oświetleniem. Dzięki temu bakterie są niezawodnie zdrowe i aktywne po indukcji.

Po inkubacji rozcieńczyć kulturę późnej fazy wykładniczej w stosunku 1 do 100 wcześniej przygotowanymi pożywkami M63 uzupełnionymi spektynomycyną o stężeniu 50 mikrogramów na mililitr. Następnie wprowadzić rozcieńczenie do naczynia do hodowli biofilmu. Gdy próbki są już gotowe do oświetlenia, przyklej naczynie hodowlane do sufitu inkubatora, upewniając się, że powierzchnia na dnie naczynia jest przezroczysta, aby projektor mógł ją oświetlić od dołu.

Po nocnym wzroście próbek biofilmu należy wyjąć szalkę hodowlaną z inkubatora. Naczynie będzie miało bakterie biofilmu przyczepione do jego dolnej powierzchni, gdzie zostało oświetlone, a także bakterie planktonowe rozproszone w płynnych mediach powyżej. Wyrzuć komórki planktonu, usuwając płynną pożywkę z naczynia hodowlanego.

Następnie przepłukać próbkę dwa razy PBS, aby usunąć pozostałe komórki planktonu, delikatnie pipetując PBS, a następnie odsysając. Jeśli komórki są znakowane fluorescencyjnie, bezpośrednio zobrazuj próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jak widać tutaj, bakterie pDawn-Ag43 wykorzystano do wytworzenia biofilmów wzorowanych na polistyrenowych płytkach studzienkowych z oświetleniem projektora.

Biofilmy można wizualizować za pomocą barwienia fioletem krystalicznym lub alternatywnie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w przypadku stosowania bakterii fluorescencyjnych. Próbki biofilmu fluorescencyjnego można również obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania obrazów biofilmu w 3D. Modelowanie w wysokiej rozdzielczości jest możliwe dzięki zastosowaniu filmowej fotomaski w celu zapewnienia wzorzystego oświetlenia próbki biofilmu.

Przykłady wzorców na powierzchniach szklanych i PDMS, a także w zamkniętych komorach hodowlanych PDMS, są pokazane tutaj i ilustrują różne typy środowisk, w których można zastosować wzorce pDawn-Ag43. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby najpierw przekształcić pDawn-Ag43 w odmianę będącą przedmiotem zainteresowania, następnie odpowiednio ustawić ostrość i skalibrować projektor, a na koniec postępować zgodnie z wymaganymi krokami hodowli i rozcieńczania wstecznego, aby przygotować bakterie do oświetlenia. Zgodnie z tą metodą można zastosować inne techniki, na przykład długoterminowe monitorowanie biofilmu w różnych warunkach hodowli.

W ten sposób możemy zrozumieć, w jaki sposób struktura biofilmu wpływa na jego funkcję. Technika ta znajdzie szerokie zastosowanie, na przykład w biologii syntetycznej i badaniach materiałowych, do inżynierii biofilmów do różnych zastosowań.