Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego
7 stycznia 2019
Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak to, jak metabolizm energetyczny w tkance siatkówki różni się między próbkami biologicznymi lub po ekspozycji na środki farmakologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona eksplantowaną organotypową tkankę siatkówki do pomiaru szybkości zarówno glikolizy, jak i utlenionej fosforylacji oraz umożliwia ocenę interwencji w czasie rzeczywistym in vitro. Aby skalibrować oprzyrządowanie do testu strumienia zewnątrzkomórkowego, najpierw dodaj jeden mililitr roztworu kalibracyjnego do każdej studzienki 24-dołkowego wkładu czujnika i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze wolnym od CO2 przez noc.
Załaduj dodatki do protokołu stresu mitochondrialnego lub protokołu glikolizy do każdego portu wtryskiwacza na kartridżu czujnika, dostosowując się do zmian objętości w studni. Zakładając początkową objętość studzienki 450 mikrolitrów, typowy test obejmowałby 45 mikrolitrów dodatku do pierwszego portu wtryskiwacza, 49,5 mikrolitrów do drugiego, 54,5 mikrolitrów do trzeciego i 60 mikrolitrów do ostatniego. Podczas pierwszych kilku eksperymentów załaduj pożywkę bazową do portu A, aby ocenić, ile artefaktów ruchu tkanek występuje po wstrzyknięciu portu.
Pozwól załadowanej płytce czujnika inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez CO2 przez co najmniej 60 minut. Rozpocznij izolację świeżej tkanki siatkówki myszy za pomocą świeżo uśpionej myszy. Użyj pary średniej wielkości zakrzywionych kleszczy, aby chwycić tylną gałkę ziemską przy nerwie wzrokowym i delikatnie naciskaj do przodu, aby wysunąć oko.
Za pomocą czystej żyletki utwórz nacięcie między rąbkami w poprzek rogówki, wykonując pojedyncze, celowe przejście ostrza. Za pomocą kleszczyków McPhersona o cienkim kącie ściśniętym tylną gałkę ziemską, aby wyrazić soczewkę i przednie błony gylikowe z nacięcia rogówki. Powtórz manewr szczypania za pomocą kleszczy, aby wyrazić siatkówkę nerwową.
Następnie użyj kleszczy jak łyżki, aby odsunąć siatkówkę od nacięcia rogówki. Umieść siatkówkę bezpośrednio w ciepłym podłożu w trzycentymetrowym naczyniu lub sześciodołkowej płytce klastrowej do hodowli tkankowych. Następnie użyj dwóch par kleszczy McPhersona o cienkim kącie, aby delikatnie wypreparować pozostałe ciało szkliste z siatkówki.
Najlepiej jest to zrobić, chwytając ciało szkliste na obrzeżach miseczki siatkówki i ciągnąc w kierunku środka, z ostatecznym odsunięciem ciała szklistego od środka jako całości. Następnie usuń resztki nabłonka barwnikowego siatkówki z powierzchni fotoreceptora siatkówki. Wytnij końcówkę pipety P1000 za pomocą żyletki, aby utworzyć otwór o średnicy około czterech milimetrów, aby zapobiec niepożądanym urazom delikatnej tkanki siatkówki podczas manewrów przenoszenia.
Następnie za pomocą wyciętej końcówki pipety przenieś izolowaną tkankę siatkówki do świeżego podłoża. Na koniec użyj jednomilimetrowego stempla biopsyjnego wyposażonego w tłok, aby przeciąć stemple siatkówki wokół nerwu wzrokowego. Stemple siatkówki odłóż na bok w czystym podłożu, trzymanym na bloku o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub poduszce grzewczej.
Po zebraniu żądanej liczby stempli użyj uroczej końcówki P1000, aby zassać pojedynczy stempel w 450 mikrolitrach podłoża i przenieś go do 24-dołkowej mikropłytki do przechwytywania oczek na podkładce grzewczej lub bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj cienkich, prostych kleszczy, aby delikatnie manipulować stemplami w środku mikropłytki. Stemple powinny być zorientowane w tym samym kierunku.
Na przykład stroną z komórką zwojową skierowaną do góry. Na każdy eksperyment należy odłożyć trzy do czterech ślepych studzienek z 450 mikrolitrami pożywki bazowej, które służą jako kontrola ujemna. Unikając pęcherzyków powietrza lub nadmiernego ruchu, delikatnie umieść wkładki siatkowe z oczkami w każdym dołku i zabezpiecz wkładki metalowym tłokiem lub naciętą końcówką do pipety P1000.
Chociaż mikrokomora ma odpowiednią głębokość, aby pomieścić typową siatkówkę myszy, czasami wady maszynowe we wkładkach siatkowych powodują, że tkanki stają się nadmiernie ściśnięte podczas wprowadzania ekranu. Jeśli tak się stanie, po prostu zanotuj tę zmiażdżoną tkankę i wyłącz tę próbkę z końcowej analizy. Inkubować płytkę tkankową w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 60 minut.
Zaprogramuj analizator strumienia pozakomórkowego za pomocą poleceń mieszania, ważenia, mierzenia i powtarzania. Na przykład typowy eksperyment z tkanką siatkówki może obejmować następujące elementy. Wymieszaj dwie minuty, odczekaj dwie minuty i odmierz pięć minut.
Powtórz eksperyment z tymi trzema krokami od pięciu do ośmiu razy dla zapisu linii podstawowej i po wstrzyknięciu każdego badanego związku. Naciśnij przycisk uruchamiania programu na analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby włożyć wkład czujnika w celu kalibracji. Pod koniec kalibracji postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby zastąpić płytkę kalibru płytką zawierającą próbki siatkówki, a następnie pozwól programowi działać zgodnie z programem.
Po zakończeniu biegu postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wysunąć płytkę tkankową. Wyświetl wyniki przebiegu i zapisz plik danych. Za pomocą wygiętej igły o rozmiarze 20 i kleszczy usuń wszystkie wkładki siatkowe z dołków, pozostawiając stempel siatkówkowy.
Ostrożnie odessać pożywkę z tkanki i umyć tkankę dwukrotnie 0,5 mililitra zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Po zaessaniu drugiego płukania PBS dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy do każdego płukania i pipetuj w górę iw dół, aby homogenizować tkankę. Na koniec określ ilościowo poziomy wejściowe w oparciu o całkowitą zawartość dwuniciowego DNA, rozcieńczając lizowane próbki jeden do jednego ze 100 mikrolitrami buforu Tris-EDTA i przenosząc 100 mikrolitrów rozcieńczonej próbki na płytkę 96-dołkową.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu detekcyjnego do każdej studzienki i mieszaj przez dwie do pięciu minut. Na koniec określ ilościowo kwiatostan po wzbudzeniu na 480 nanometrach i emisji na 520 nanometrach, porównując z krzywą standardową. Normalizuj surowy strumień zewnątrzkomórkowy, śledząc zawartość DNA w studni.
Na linii podstawowej, w obecności pięciu mili glukozy Müllera i w obecności 10 mili pirogronianu Müllera, nie ma znaczącej różnicy w szybkości wydzielania kwasu, mierzonej szybkością zakwaszenia zewnątrzkomórkowego. Między tkankami siatkówki od zwierząt typu wilgotnego lub myszy nokautujących, które nie mają mechanizmów do zamykania cyklicznych kanałów jonowych bramkowanych nukleotydami w odpowiedzi na bodźce świetlne. Podobne wzorce obserwuje się po dodaniu 20 mili glukozy Müllera i inhibitora glikolitycznego 2DG.
Dane te mogą być matematycznie przekształcone w celu przedstawienia ułamkowych zmian w stosunku do wartości wyjściowej, formatu, który może pozwolić na lepsze porównanie różnych interwencji eksperymentalnych. Bezwzględny wskaźnik zużycia tlenu na początku badania jest również równoważny między kontrolną a zmutowaną tkanką siatkówki. Dodanie 20 mili glukozy muller zwiększa oddychanie mitochondrialne, ale nie obserwuje się zmian między grupami pod względem bezwzględnej kwantyfikacji lub zmiany w stosunku do wartości wyjściowej.
Dodanie jednego mili mullera FCCP, środka rozprzęgającego, w celu wykazania maksymalnej częstości oddechów mitochondrialnych nie zwiększa znacząco OCR powyżej poziomu obserwowanego przy wysokim poziomie glukozy w kontrolnej i zmutowanej tkance siatkówki. Jednak sygnały z obu myszy drastycznie spadają po dodaniu koktajlu RAA. Podsumowując, demonstrujemy technikę ilościowego określania szybkości utlenionej fosforylacji i glikolizy w organotypowych eksplantatach siatkówki myszy.
Dzięki skutecznej izolacji tkanki siatkówki, technika ta zapewnia wiarygodne i godne pochudzenia pomiary. Można ocenić wpływ ekspozycji w czasie rzeczywistym, takich jak czynniki rozprzęgające. Oprócz tej procedury, inne metody, takie jak ilościowy RTPCR i western blotting, można przeprowadzić na nadmiarze tkanki wyizolowanej na etapie sekcji, aby uzyskać równoległe informacje istotne dla badań metabolizmu siatkówki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia technikę rejestracji w czasie rzeczywistym zużycia tlenu oraz tempa zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w tkance siatkówki myszy. Dzięki zastosowaniu analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego metoda ta umożliwia ocenę różnic w metabolizmie energetycznym tkanek siatkówki w różnych warunkach.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Metabolizm komórkowy
- Biologia siatkówki
- Oceny farmakologiczne
Wprowadzenie
- Zrozumienie metabolizmu energetycznego w tkankach siatkówki ma kluczowe znaczenie dla leczenia różnych chorób oczu.
- Obecne metody często nie pozwalają na dokonywanie ocen w czasie rzeczywistym.
- Technika ta wykorzystuje wypreparowaną tkankę organotypową do szczegółowych analiz.
Zastosowane metody
- Pomiar glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej w czasie rzeczywistym
- Wyeksplantowana tkanka siatkówki myszy
- Analizator przepływów zewnątrzkomórkowych
Główne wyniki
- Szybkości zużycia tlenu oraz zakwaszenia zewnątrzkomórkowego są precyzyjnie rejestrowane.
- Ocena funkcji glikolitycznych i mitochondrialnych w tkankach siatkówki.
- Efektywna analiza odpowiedzi tkankowych na środki farmakologiczne.
Wnioski
- Technika ta skutecznie demonstruje, w jaki sposób metabolizm energetyczny może różnić się w tkankach siatkówki.
- Zdolność do przeprowadzania eksperymentów w czasie rzeczywistym zwiększa zrozumienie funkcji i reakcji siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena metabolizmu energetycznego siatkówki ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji celów terapeutycznych w chorobach prowadzących do ślepoty, takich jak retinopatia cukrzycowa. Metoda ta umożliwia ilościowe określanie poziomu fosforylacji oksydacyjnej oraz glikolizy w czasie rzeczywistym w wyizolowanej tkance siatkówki, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego na wczesnym etapie odkrywania leków. Dzięki dostarczeniu ilościowych, powtarzalnych sygnatur metabolicznych, metoda ta zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach nad walidacją celów oraz modulacją szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar OCR i ECAR jako wskaźników aktywności mitochondrialnej i glikolitycznej w tkance siatkówki.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez analizę porównawczą tkanek siatkówki typu dzikiego i tkanek z modelu choroby pod wpływem interwencji farmakologicznej.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję związków w portfolio poprzez identyfikację substancji znacząco zmieniających metabolizm energetyczny siatkówki, co wskazuje na potencjalną skuteczność lub toksyczność.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na przygotowanie zestandaryzowanych, powtarzalnych wycinków tkanki siatkówki w celu uzyskania spójnych pomiarów przepływu zewnątrzkomórkowego w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Wyniki ilościowe: Generuje odczyty OCR i ECAR, które umożliwiają analizę zależności dawka-odpowiedź oraz analizę przebiegu czasowego modulatorów metabolicznych.
- Skalowalność: Umożliwia testowanie wielu czynników w jednym eksperymencie przy użyciu formatu 24-dołkowego, co zwiększa przepustowość kampanii identyfikacji wiodących związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Zapewnia system istotny w kontekście chorób, pozwalający na badanie dysfunkcji metabolicznych w patologiach siatkówki związanych z zaburzeniami energetycznymi.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną, umożliwiając równoległą analizę próbek tkanek w celu profilowania biochemicznego i metabolicznego.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Wspiera kryteria go/no-go poprzez wczesną identyfikację obciążeń metabolicznych w procesie odkrywania leków.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając fenotypowanie metaboliczne jako funkcjonalny odczyt aktywności związku w tkance siatkówki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez łączenie perturbacji genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami w szlakach energetycznych siatkówki.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy preparaty tkankowe o standaryzowanej żywotności i orientacji, co zapewnia wiarygodną analizę przepływu.
- Analityka: Dostarcza wskaźniki OCR i ECAR, które umożliwiają ilościowe porównanie odpowiedzi metabolicznych w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Umożliwia wykorzystanie nadmiarowej tkanki do walidacji ortogonalnej za pomocą qPCR lub Western blot, co wzmacnia wnioski mechanistyczne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do profilowania metabolicznego w różnych modelach chorób siatkówki, ograniczając redundantny rozwój testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w metabolizmie energetycznym siatkówki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji izolacji tkanek, normalizacji do zawartości DNA oraz pomiarom kinetycznym w czasie rzeczywistym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania związków metabolicznie aktywnych, co redukuje ryzyko niepowodzenia na późnych etapach badań.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, wskazując związki o pożądanych profilach modulacji metabolicznej w tkance siatkówki.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w preparatyce i obchodzeniu się z tkanką siatkówki w celu utrzymania żywotności eksplantatów.
- Zależne od dostępu do analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego oraz kompatybilnych kartridży z sensorami.
- Wymaga standaryzacji rozmiaru wycinków tkanki, ich orientacji oraz czasu inkubacji we wszystkich grupach użytkowników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy zastosowaniu różnych modeli siatkówki lub gatunków.
- Ograniczona możliwość rozróżnienia stanów metabolicznych po adaptacji do światła i ciemności, co jest odnotowanym ograniczeniem w badaniach energetyki siatkówki.
