Name: Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj technikę pomiaru metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Metoda umożliwia ocenę glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Alexandrowi Kolesnikovowi i dr Vladimirowi Kefalovowi za dostarczenie myszy Gnat1-/- za pomocne opinie i porady oraz za przeczytanie manuskryptu.
Ta praca była wspierana przez NIH EY025269 (RR), Centrum Badań nad Cukrzycą na Uniwersytecie Waszyngtońskim - NIH DK020579 (JRM i RR), Nagrodę Rozwoju Kariery od Research to Prevent Blindness (RR), Fundację Horncrest (RR), Nagrodę za Rozwój Kariery od JDRF (JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) i DK114233 (JRM).

Protokoły były zgodne z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt i zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Waszyngtoński.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Trzymaj zwierzęta w standardowych pomieszczeniach z cyklem światła od 12 godzin do 12 godzin światła. Rozpocznij eksperymenty o standardowych porach, aby uniknąć efektów okołodobowych, zwykle rano, wkrótce po włączeniu światła.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę bazową, rozpuszczając 8,4 mg sproszkowanej pożywki w podwójnie destylowanymH2O(ddH2O) i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl lub NaOH, do końcowej objętości 1 l. Filtrować wysterylizować ten roztwór za pomocą filtra do hodowli tkankowych 0,22 μm.
	<ol>
		<li>Dodać 1 M glukozy i 100 mM pirogronianu sodu do pożywki, aby uzyskać końcowe stężenia 5 mM glukozy i 1 mM pirogronianu.</li>
		<li>Umieścić 50 ml podwielokrotności podłoża bazowego w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór do lizy do oznaczania ilościowego tkanek na końcu analizy topnika, dodając tris zasadę do 10 mM, eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego do 0,2% (v/v) i EDTA do 1 mM, wszystko w ddH2O. Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników i dostosować pH do 8,0.</li>
	<li>Do protokołu stresu mitochondrialnego przygotuj 11 μM zapasu oligomycyny, inhibitora syntazy ATP, rozpuszczonego w pożywce zasadowej, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM w studzience. Przygotować 11 μM zapas cyjanku karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP), środka rozprzęgającego, rozpuszczonego w pożywce zasadowej w celu osiągnięcia końcowego stężenia 1 μM w studzience. Przygotować koktajl inhibitorów łańcucha transportu elektronów, rotenonu i antymycyny A (RAA), dodając rotenon do 11 μM i antymycynę A do 22 μM, rozpuszczony w pożywce zasadowej w celu osiągnięcia końcowego stężenia 1 μM rotenonu i 2 μM antymycyny A w studzience.</li>
	<li>Do protokołu glikolizy należy przygotować zapas 220 mM glukozy rozpuszczonej w pożywce podstawowej, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mM w studzience. Przygotuj również 1,1 M zapas 2-deoksyglukozy (2-DG), kompetycyjnego inhibitora glukozy i antagonisty glikolitycznego, rozpuszczając go w pożywce zasadowej. Ma to na celu osiągnięcie końcowego stężenia 100 mM 2-DG w odwiercie.</li>
</ol>
3. Kalibracja przyrządu
<ol>
	<li>Aby skalibrować oprzyrządowanie do testu strumienia zewnątrzkomórkowego, dodać 1 ml roztworu kalibracyjnego do każdego dołka wkładu czujnika (łącznie 24 dołki) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO2 przez noc (lub co najmniej 8 godzin).</li>
	<li>Załaduj dodatki do protokołu stresu mitochondrialnego lub protokołu glikolizy do każdego portu wtryskiwacza, od A do D, na kartridżu czujnika, dostosowując się do zmian objętości w studzience. 
	nuta: Na przykład typowy test obejmowałby 45 μl dodatku do pierwszego portu iniektora, 49,5 μl do drugiego, 54,5 μl do trzeciego i 60 μl do ostatniego, przy założeniu początkowej objętości studzienki wynoszącej 450 μl.</li>
	<li>Podczas pierwszych kilku eksperymentów załaduj pożywkę bazową do portu A, aby ocenić, ile ruchu/artefaktu tkanki następuje po wstrzyknięciu portu.</li>
	<li>Pozostawić załadowaną płytkę czujnika do inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze innym niż CO2 2 przez co najmniej 60 minut.</li>
</ol>
4. Izolacja świeżej tkanki siatkówki myszy
Uwaga: Ten krok jest zaadaptowany z techniki Dr. Barry'ego Winklera15.
<ol>
	<li>Po podaniu głębokiego znieczulenia przy użyciu standardowego koktajlu ketaminy/ksylazyny, należy poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Użyj pary średniej wielkości zakrzywionych kleszczyków, aby chwycić tylną gałkę ziemską przy nerwie wzrokowym i delikatnie wywieraj nacisk do przodu, aby podeprzeć oko (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Za pomocą czystej żyletki utwórz nacięcie między rąbkami w poprzek rogówki, wykonując pojedyncze, celowe przejście ostrza.</li>
		<li>Za pomocą cienkich, kątowych kleszczyków w stylu McPhersona ściśnij tylną gałkę ziemską, aby wyrazić soczewkę i przednie błony szkliste z nacięcia rogówki. Wyrzuć te tkanki.</li>
		<li>Powtórz manewr szczypania za pomocą kleszczy, aby wyrazić siatkówkę nerwową.</li>
		<li>Używając kleszczy jak łyżki do podnoszenia siatkówki, a nie do chwytania tkanki, przenieś siatkówkę z dala od nacięcia rogówki i umieść bezpośrednio w ciepłym podłożu w 3-centymetrowym naczyniu lub 6-dołkowej płytce klastrowej do hodowli tkankowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj dwóch par cienkich, ustawionych pod kątem kleszczy w stylu McPhersona, aby delikatnie wypreparować pozostałe ciało szkliste z siatkówki. Najlepiej zrobić to, chwytając ciało szkliste na obrzeżach miseczki siatkówki i ciągnąc w kierunku środka, z ostatecznym odłączeniem ciała szklistego od środka jako całości. Za pomocą kleszczy usuń resztki nabłonka barwnikowego siatkówki z powierzchni fotoreceptora siatkówki.
	<ol>
		<li>Wytnij końcówkę pipety P1000 za pomocą żyletki, aby utworzyć otwór o średnicy ~4 mm, aby zapobiec nadmiernemu urazowi delikatnej tkanki siatkówki podczas manewrów przenoszenia.</li>
		<li>Przenieś izolowaną tkankę siatkówki do świeżego podłoża za pomocą wyciętej końcówki pipety P1000.</li>
		<li>Wytnij 1 mm nakłucia siatkówki wokół nerwu wzrokowego za pomocą 1 mm stempla biopsyjnego wyposażonego w tłok do usuwania tkanki w przypadku, gdy utknie ona w otworze (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1B). Stemple siatkówkowe odłożyć na bok w czystym podłożu umieszczonym na bloku o temperaturze 37 °C lub poduszce grzewczej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Protokół testu
<ol>
	<li>Przenieś pojedyncze stemple na 24-dołkową mikropłytkę wychwytującą wysepki za pomocą naciętej końcówki P1000, zasysając 450 μl pożywki wraz z tkanką.</li>
	<li>Użyj cienkich, prostych kleszczyków, aby delikatnie manipulować stemplami w środku mikropłytki. Stemple powinny być ustawione w tym samym kierunku (np. stroną komórki zwojowej do góry).
	<ol>
		<li>Umieścić płytkę wychwytującą na poduszce grzewczej lub bloku grzewczym ustawionym na 37 °C, wykonując czynności powtórzone dla pozostałych próbek. 
		nuta: Dla każdego eksperymentu należy odłożyć na bok 3-4 ślepe studzienki z 450 μl pożywki zasadowej, które mają służyć jako kontrola ujemna. W pozostałych 20-21 dołkach należy przetestować każdą kontrpróbę biologiczną w trzech egzemplarzach. W związku z tym każda 24-dołkowa płytka pozwoli na zapis z 6-7 różnych zwierząt lub warunków leczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unikając pęcherzyków powietrza, delikatnie umieść wkładki siatki wychwytującej wysepki w każdej studzience za pomocą kleszczy i zabezpiecz wkładki metalowym tłokiem lub naciętą końcówką pipety P1000 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	nuta: Na tym etapie należy unikać nadmiernego ruchu tkanki, aby utrzymać pozycję stempla siatkówki w środku mikrokomory próbki. Pęcherzyki powietrza poważnie zniekształcają odczyty OCR. Chociaż mikrokomora ma odpowiednią głębokość, aby pomieścić typową siatkówkę myszy (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1C), czasami wady obróbki w wkładkach siatkowych mogą powodować nadmierne ściskanie tkanek podczas wprowadzania ekranu. Jeśli tak się stanie, po prostu zanotuj zmiażdżoną tkankę i wyłącz tę próbkę z końcowej analizy.</li>
	<li>Inkubować płytkę tkankową w inkubatorze wolnym od CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 60 minut.</li>
	<li>Zaprogramuj analizator strumienia zewnątrzkomórkowego za pomocą poleceń Mix, Wait, Measure i Repeat. Na przykład typowy eksperyment z tkanką siatkówki może obejmować następujące elementy: Mieszanie 2 minuty, Odczekanie 2 minuty i Pomiar 5 minut. Powtórz eksperyment z tymi trzema krokami od 5 do 8 razy (cykle) dla zapisu linii podstawowej i po wstrzyknięciu każdego badanego związku podczas biegu.</li>
	<li>Naciśnij przycisk START programu na analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby włożyć wkład czujnika w celu kalibracji.</li>
	<li>Po zakończeniu kalibracji postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wymienić płytkę kalibru na płytkę zawierającą próbki siatkówki.</li>
	<li>Zezwól programowi na działanie zgodnie z programem. Po zakończeniu biegu postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wysunąć płytkę tkankową. Wyświetl wyniki przebiegu i zapisz plik danych.</li>
	<li>Za pomocą wygiętej igły o rozmiarze 20 i kleszczy usuń wszystkie wkładki siatkowe z dołków, pozostawiając stempel siatkówkowy.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę z tkanki i przemyć ją dwukrotnie 0,5 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po umyciu odessać PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu do lizy do każdej studzienki i pipetować w górę iw dół, aby homogenizować tkankę.</li>
	<li>Ilościowe określanie poziomów wejściowych na podstawie całkowitego dwuniciowego DNA (dsDNA) lub całkowitej zawartości białka. 
	nuta: Poniższe informacje są oparte na dostępnym na rynku teście dsDNA.</li>
	<li>Rozcieńczone próbki poddane lizie w stosunku 1:1 przez dodanie 100 μl buforu Tris-EDTA (TE) i przeniesienie 100 μl rozcieńczonej próbki na płytkę 96-dołkową.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl buforu detekcyjnego do każdej studzienki. Po mieszaniu przez 2-5 minut, określić ilościowo fluorescencję po wzbudzeniu przy 480 nm i emisji przy 520 nm, porównując z krzywą wzorcową.</li>
		<li>Normalizuj surowy strumień zewnątrzkomórkowy, śledząc zawartość DNA w studzience. 
		nuta: W przedstawionych tutaj wynikach próbki są znormalizowane do 50 ng dsDNA - typowej ilości w 1 mm stemplu siatkówkowym. W związku z tym przedstawione tu wartości bezwzględne można porównać z badaniami prezentującymi dane "na uderzenie siatkówki". Normalizuj śledzenie do wzorca wewnętrznego, takiego jak linia wyjściowa, przebieg przy stężeniu glukozy 5 mM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+and+brain%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function%3A+high+cost+of+Na%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li>
<li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863(2017).</li>
<li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li>
<li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622(2017).</li>
<li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+lactate%2C+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biology%22%5BJournal%5D)">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113(2017).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li>
<li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proton+and+electron+leaks%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

OCR i ECAR są łatwo mierzone w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą bioanalizatora przy użyciu opisanych technik. Ta metoda odbiega od metod innych grup w kilku krytycznych krokach. Tkanki siatkówki są izolowane przez duże nacięcie rogówki bez wyłuszczenia gałki ziemskiej, jak to pierwotnie opisał Winkler15. Ta metoda izolacji siatkówki pozwala na szybkie przeniesienie z żywego oka do płytki wychwytującej tkankę (często w ciągu 5 minut). Tkanki są utrzymywane w temperaturze 37 °C przez cały p...

Siatkówka jest jedną z najbardziej energochłonnych tkanek w ośrodkowym układzie nerwowym1. Podobnie jak większość tkanek, wytwarza adenozynotrójfosforan (ATP) poprzez glikolizę w cytozolu lub poprzez fosforylację oksydacyjną w mitochondriach. Przewaga energetyczna fosforylacji oksydacyjnej nad glikolizą w wytwarzaniu ATP z jednej cząsteczki glukozy jest oczywista: 36 cząsteczek ATP generowanych z pierwszej w porównaniu z 2 cząsteczkami ATP generowanymi z drugiej. W związku z tym neurony siatkówki polegają przede wszystkim na oddychaniu mitochondrialnym w celu dostarczania energii, co znajduje odzwierciedlenie w ich wysokiej gęstości mitochondriów2. Jednak siatkówka również w dużym stopniu opiera się na maszynerii glikolitycznej, nawet gdy tlenu jest pod dostatkiem. Ten proces glikolizy tlenowej został pierwotnie opisany w komórkach nowotworowych przez Otto Warburga3, który kiedyś zauważył, że siatkówka jest jedyną tkanką postmitotyczną zdolną do tej formy metabolizmu4. Od czasu tych początkowych obserwacji opisano wiele tkanek postmitotycznych jako zaangażowane w różne stopnie glikolizy oprócz fosforylacji oksydacyjnej, aby spełnić wymagania ATP.
Fototransdukcja, wizualny recykling pigmentu, biosynteza zewnętrznych segmentów fotoreceptorów i aktywność synaptyczna to procesy wymagające energii w fotoreceptorach, dominującej podklasie neuronów w siatkówce. Jednak konieczność aktywnego transportu jonów wbrew ich gradientom elektrycznym i stężeniom jest zdecydowanie najbardziej energochłonnym procesem w neuronach1. Fotoreceptory są neuronami osobliwymi w tym sensie, że ulegają depolaryzacji przy braku stymulacji (tj. w ciemności), podczas gdy bodziec świetlny wyzwala zamknięcie kanału, a następnie hiperpolaryzację. Dlatego w ciemności siatkówka zużywa duże ilości ATP, aby utrzymać swoją depolaryzację lub "ciemny prąd", jak to się powszechnie nazywa. Z adaptacyjnego punktu widzenia, głównym wyzwaniem w dostarczaniu tak ogromnych ilości ATP jest potrzeba utrzymania przez organizmy jasności wizualnej przez oś optyczną. Odwrócona architektura siatkówki obserwowana u współczesnych stworzeń jest dominującym rozwiązaniem, ponieważ utrzymuje gęstą sieć naczyń włosowatych zaopatrującą fotoreceptory z dala od ścieżki światła. Ale ten cud naturalnej bioinżynierii stawia siatkówkę nad przepaścią pod względem rezerwy metabolicznej. Nawet drobne uszkodzenia siatkówki mogą potencjalnie zakłócić delikatną równowagę między podażą energii a popytem, a dysfunkcja wzroku lub ślepota mogą szybko nastąpić.
Biorąc pod uwagę unikalne wymagania energetyczne siatkówki nerwowej, w połączeniu z jej ścisłym ograniczeniem dopływu naczyń krwionośnych, dokładny pomiar zużycia ATP w siatkówce i jego zmian podczas choroby może mieć głębokie implikacje w zrozumieniu i leczeniu stanów powodujących ślepotę, takich jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i retinopatia cukrzycowa. Tradycyjnie, pomiary te wymagają kosztownego, specjalnie zaprojektowanego sprzętu, a większość badań pochodzi z kilku laboratoriów całkowicie poświęconych pomiarom aktywności metabolicznej2,5,6,7,8. Techniki obejmują indywidualne testy dla określonych metabolitów, badania znaczników z wykorzystaniem prekursorów znakowanych radioaktywnie, rejestrację zużycia tlenu za pomocą elektrod Clarka oraz profilowanie metabolomiczne9.
Dzięki postępom w technologii wysokoprzepustowej i zwiększonej dostępności komercyjnych urządzeń, techniki rejestrowania metabolizmu siatkówki są coraz bardziej dostępne i przystępne cenowo. Opisana tutaj metoda mierzy zarówno fosforylację oksydacyjną, jak i glikolizę w siatkówce przy użyciu eksplantowanej tkanki i dostępnego na rynku analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego9,10,11,12. Ten analizator oddzielnie rejestruje wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR), służąc jako pośrednie wskaźniki odpowiednio fosforylacji oksydacyjnej i glikolizy13. Pomiary te są wykonywane za pomocą sondy zanurzonej w mikrokomorze utworzonej nad tkanką będącą przedmiotem zainteresowania. Ta adaptacja wcześniej opublikowanych metod wykorzystuje płytkę przechwytującą pierwotnie zaprojektowaną dla wysp trzustkowych Langerhansa do rejestrowania aktywności metabolicznej w małych, okrągłych odcinkach siatkówki myszy. W trakcie jednego zapisu do tkanki można dostarczyć wiele ekspozycji farmakologicznych, ponieważ system zawiera 4 porty iniekcyjne dla każdej studzienki próbki. Korzystając z tego systemu z oddzielnymi protokołami zoptymalizowanymi pod kątem zapisów ECAR i OCR, reakcje siatkówk typu dzikiego można porównać z siatkówkami pozbawionymi transducyny (Gnat1-/-), co jest przyczyną wrodzonej stacjonarnej ślepoty nocnej u ludzi14.

<table><tbody><tr><td>Seahorse XF24 Zewnątrzkomórkowy analizator strumienia</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 Wychwytywanie wysepek FluxPak (zawiera: mikropłytkę do wychwytywania wychwytywania, wkład czujnika i roztwór kalibru)</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>101174-100</td><td>Zawiera mikropłytkę do wychwytywania wychwytywania wysepek, wkład czujnika i roztwór kalibru</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media (podłoże w proszku)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>RPMI 1640 Pożywka z L-glutaminą i bez glukozy lub wodorowęglanu sodu</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M D-Glukoza filtrowana, do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Corning</td><td>25000CI</td><td>100 mM pirogronian sodu</td></tr><tr><td>Antimycin-A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>Składnik protokołu stresu mitochondrialnego</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>Składnik protokołu stresu mitochondrialnego</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R8875</td><td>Składnik protokołu stresu mitochondrialnego</td></tr><tr><td>2-deoksyglukoza</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D6134</td><td>Składnik protokołu glikolizy</td></tr><tr><td>Stemple do biopsji skóry 1 mm z</td><td>tłokiem Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td>Narzędzie do eksplantacji tkanki siatkówki</td></tr><tr><td>Dumont Mini-kleszcze Proste</td><td>narzędzia do nauki</td><td>11200-10</td><td>Narzędzie do eksplantacji tkanki siatkówki</td></tr><tr><td>Dumont Medical # 5/45 Kleszcze - kątowe 45 stopni</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11253-25</td><td>Narzędzie do eksplantacji tkanki siatkówki</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #7 - zakrzywione</td><td>narzędzia do</td> nauki o roślinach <td>11271-30</td><td>Narzędzie do eksplantacji tkanki siatkówki</td></tr><tr><td>Quant-iT Zestaw do oznaczania DNA Picogreen Fisher</td><td>Scientific</td><td>P7589</td><td>Test normalizacji obciążenia</td></tr><tr><td>Baza Trizma (zasada Tris)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>Składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>Triton X-100 (eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>Składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>0,5M EDTA pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td>Składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>myszy C57BL/6J&nbsp;</td><td>Laboratoria Jacksona</td><td>&nbsp; Szczep 000664</td><td>zwierząt</td></tr><tr><td>Gnat1-/- i Gnat1+/+&nbsp;</td><td>dr Władimir Kefałow; Szkoła Medyczna Uniwersytetu Waszyngtońskiego</td><td>Zwierzęta</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Widzenie o wysokiej ostrości jest procesem energochłonnym, a siatkówka rozwinęła kilka unikalnych adaptacji, aby precyzyjnie sprostać takim wymaganiom, zachowując jednocześnie przejrzystość osi widzenia. Zaburzenia tej delikatnej równowagi powodują choroby powodujące oślepienie, takie jak retinopatia cukrzycowa. Dlatego zrozumienie zmian metabolizmu energetycznego w siatkówce podczas choroby jest niezbędne do opracowania racjonalnych terapii różnych przyczyn utraty wzroku. Niedawne pojawienie się komercyjnie dostępnych analizatorów strumienia zewnątrzkomórkowego sprawiło, że badanie metabolizmu energii siatkówki stało się bardziej dostępne. Protokół ten opisuje zastosowanie takiego analizatora do pomiaru wkładu w dostarczanie energii siatkówki przez jego dwie główne ramiona - fosforylację oksydacyjną i glikolizę - poprzez ilościowe określenie zmian wskaźników zużycia tlenu (OCR) i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) jako wskaźników zastępczych dla tych szlaków. Technika ta jest łatwo stosowana w eksplantowanej tkance siatkówki, ułatwiając ocenę odpowiedzi na wiele środków farmakologicznych w jednym eksperymencie. Sygnatury metaboliczne w siatkówkach zwierząt pozbawionych sygnalizacji fotoreceptorów pręcikowych porównuje się z kontrolami typu dzikiego przy użyciu tej metody. Głównym ograniczeniem w tej technice jest brak zdolności do rozróżnienia między wykorzystaniem energii przystosowanym do światła i przystosowanym do ciemności, co jest ważnym czynnikiem fizjologicznym w tkance siatkówki.

Wykorzystując opisane techniki (podsumowane na Rysunku 1), porównano eksplanty siatkówki 8-tygodniowych myszy typu dzikiego (WT) z myszami z nokautem genu transducyny (Gnat1-/-) w tym samym wieku i o tym samym tle genetycznym. Ponieważ zwierzęta Gnat1-/- nie posiadają mechanizmów zamykania kanałów jonowych sterowanych cyklicznymi nukleotydami w odpowiedzi na bodźce świetlne, ich fotoreceptory pręcikowe pozostaj...

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak to, jak metabolizm energetyczny w tkance siatkówki różni się między próbkami biologicznymi lub po ekspozycji na środki farmakologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona eksplantowaną organotypową tkankę siatkówki do pomiaru szybkości zarówno glikolizy, jak i utlenionej fosforylacji oraz umożliwia ocenę interwencji w czasie rzeczywistym in vitro. Aby skalibrować oprzyrządowanie do testu strumienia zewnątrzkomórkowego, najpierw dodaj jeden mililitr roztworu kalibracyjnego do każdej studzienki 24-dołkowego wkładu czujnika i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze wolnym od CO2 przez noc.Załaduj dodatki do protokołu stresu mitochondrialnego lub protokołu glikolizy do każdego portu wtryskiwacza na kartridżu czujnika, dostosowując się do zmian objętości w studni. Zakładając początkową objętość studzienki 450 mikrolitrów, typowy test obejmowałby 45 mikrolitrów dodatku do pierwszego portu wtryskiwacza, 49,5 mikrolitrów do drugiego, 54,5 mikrolitrów do trzeciego i 60 mikrolitrów do ostatniego. Podczas pierwszych kilku eksperymentów załaduj pożywkę bazową do portu A, aby ocenić, ile artef

measurement-energy-metabolism-explanted-retinal-tissue-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół zapewnia biochemiczne podejście do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) pierwotnych komórek białaczkowych za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Ocena profilu metabolicznego tych komórek pomaga scharakteryzować ich zapotrzebowanie, co prowadzi do spersonalizowanej terapii.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego: metoda pomiaru profilu metabolicznego komórek

Ten film demonstruje metodę analizy metabolizmu energetycznego w aktywowanych ludzkich komórkach NK za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Różne inhibitory kompleksów łańcucha transportu elektronów wpływają na syntezę ATP, która jest mierzona za pomocą wskaźnika zużycia tlenu lub OCR, dostarczając wglądu w metabolizm komórkowy i bioenergetykę.

Monitorowanie metabolizmu energetycznego w ludzkich komórkach NK w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Tutaj opisano szczegółowy protokół do przeprowadzania testu stresu mitochondrialnego i testu szybkości glikolitycznej w próbkach tkanki siatkówki ex vivo przy użyciu komercyjnego bioanalizatora.

Oznaczanie oddychania mitochondrialnego i glikolizy w próbkach tkanki siatkówki ex vivo

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Protokół ten opisuje opłacalny sposób przeprowadzenia testu stresowego glikolizy w celu ilościowego przeprogramowania metabolizmu w pierwotnym mikrogleju myszy. Po izolacji i stymulacji zapalnej mierzy się tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) przy użyciu świeżo przygotowanych, pH-skorygowanych odczynników, a następnie następuje normalizacja białek, umożliwiająca dokładną i powtarzalną ocenę zmian glikolitycznych.

Badanie glikolizy w mikrogleju pierwotnym za pomocą testu strumienia zewnętrznego

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół ilościowego określania tempa zużycia tlenu i szybkości zakwaszania zewnątrzkomórkowego komor dorosłych danio danio (ex vivo ), aby scharakteryzować ich zdolności metaboliczne oksydacyjne i glikolologiczne.

Ocena aktywności metabolycznej całych regenerujących się komor danio pręgowanego ex vivo za pomocą testu strumienia zewnętrznego

Poznaj technikę pomiaru metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Metoda umożliwia ocenę glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej w czasie rzeczywistym.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Przeglądaj więcej filmów