Testy komórkowe niekodujących RNA SINEUP, które mogą specyficznie poprawić translację mRNA

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak to, jak pozytywnie moderować aktywność genu, wykorzystując mRNA obecne w komórkach i tkankach. Jak zrekompensować niedobory aktywności i jak osiągnąć wysoką translację z mRNA in vitro i in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy globalnie badać geny docelowe SINEUP w żywych komórkach, obrazując bez fiksacji i pobierania.

Tak więc implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię haploniedium, ponieważ SINEUPy mogą indukować dwukrotny wzrost niedoboru białka, takiego jak frataksyna w przypadkach ataksji Friedricha. Aby rozpocząć, otwórz przeglądarkę Zenbu i kliknij bazę danych projektu Fantom, która Cię interesuje. Przeszukaj gen docelowy i sprawdź miejsce rozpoczęcia transkrypcji lub TSS oraz poziom ekspresji w pożądanych komórkach i tkankach.

Aby określić TSS, zapoznaj się z przykładową analizą białka siódemki choroby Parkinsona lub mRNA PARK7. Sprawdź TSS według regionu piku klatki. Aby określić poziomy ekspresji transkrypcji specyficzne dla komórek i tkanek, wybierz region piku klatki i kliknij powiększ region genomu, aby wybrać.

Sprawdź ekspresję PARK7 w interesującym typie komórki i tkanki, eksplorując listę wyrażeń transkrypcji u dołu strony. Następnie zaprojektuj sekwencje domen wiążących o kilku różnych długościach odpowiadających 40 zasadom przed i 32 zasadom za pierwszą metioniną lub AUG. Przed transfekcją za pomocą SINEUPs, komórki nasienne będące przedmiotem zainteresowania na dwóch 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-d-lizyną, zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o pięcioprocentowej zawartości CO2, aby osiągnąć 70-procentową konfluację. Bardzo ważne jest równomierne rozmieszczenie komórek w studzienkach, w tym celu delikatnie potrząśnij płytką 10 razy w przód iw tył po wysianiu komórek w czystej ławce i powtórz w pięcioprocentowym inkubatorze CO2. Po inkubacji zmień pożywkę na 0,4 ml świeżej pożywki.

Do analizy SINEUP-GFP należy przygotować kilka probówek o pojemności 1,5 ml z 0,1 ml zmieszanego roztworu, z pEGFP-C2, SINEUP-GFP, odczynnikami do transfekcji i OptiMEM w każdej probówce, a następnie inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dodaj 0,1 ml tego zmieszanego roztworu z każdej probówki do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce i oznacz te studzienki SINEUP-GFP jeden, dwa, trzy, cztery i pięć. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym CO2 przez 24 godziny.

Po 24 godzinach umyj komórki 0,5 ml PBS. Dodaj 25 μl trypsyny o zawartości 0,05 % wagowych na objętość i inkubuj w inkubatorze z pięcioprocentowym CO2 przez pięć minut. Dodaj 275 μl pożywki komórkowej na dołek.

Do ekstrakcji białka weź jedną z dwóch płytek i zbierz 225 μl lub trzy czwarte komórek z jednej studzienki i 75 μl lub jedną czwartą komórek do ekstrakcji RNA, każda do oddzielnej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 6000xg przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z probówki znakowanej przez izolację białka.

Dodaj 60 μl roztworu do lizy do komórek i wymieszaj pipetując Dokładnie wymieszaj, obracając z małą prędkością przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować probówkę o mocy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać supernatant białka. Aby określić stężenie białka, najpierw przygotuj od pięciu do sześciu razy rozcieńczenie wzorca białka albuminy surowicy świeżej bydlęcej w ultraczystej wodzie, o stężeniach od 0,2 do 1,5 mg / ml białka.

Aby przygotować działający odczynnik A Dash mix, dodaj 20 ml odczynnika S do jednego ml odczynnika A w probówce o pojemności dwóch mililitrów. Dodaj pięć μl wody jako kontrolę ujemną. A następnie wzorzec BSA lub próbka białka w każdym dołku.

Dodaj 25 μl odczynnika A Dash, a następnie ostrożnie dodaj 200 μl odczynnika B na studzienkę, unikając tworzenia się pęcherzyków. Przykryj płytkę folią aluminiową do inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć do ośmiu minut. Zmierz absorbancję białka przy 750 nm za pomocą spektrofotometru.

Przygotować krzywą wzorcową, wykreślając stężenia białek wzorcowych BSA na osi x i ich odpowiednią absorbancję na osi y. Zastosuj równanie krzywej standardowej, aby obliczyć stężenie białka w próbce. Aby rozpocząć separację białek, dodaj jedną objętość 2x barwnika ładującego do każdej objętości próbki białka.

Podgrzewać w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez pięć minut i natychmiast schłodzić na lodzie przez minutę. Załaduj od 10 do 20 ug próbek białka do 10 procent żelu poliakryloamidowego SDS i rozdziel przy napięciu od 100 do 150 V. Przenieść białko z żelu na membranę nitrocelulozową o grubości 0,5 mikrometra za pomocą półsuchego przyrządu do przenoszenia.

Napełnij buforem transferowym pod napięciem 25 V przez 30 minut. Po przeniesieniu umieść membranę w pojemniku i dodaj roztwór blokujący, aż membrana całkowicie nasiąknie, a następnie inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 30 minut z potrząsaniem. Dodaj odpowiednie przeciwciało do roztworu blokującego i przelej przez membranę.

Hybrydyzować, inkubując błonę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając. Po hybrydyzacji umyj membranę, dodając 1x bufor TBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej i powtórz jeszcze dwa razy. Wykonaj następną hybrydyzację z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym nad membraną, w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wstrząsając.

Następnie umyj membranę, dodając 1x bufor TBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej i powtórz jeszcze dwa razy. Przenieść membranę do pudełka wypełnionego dwoma ml mieszaniny odczynników ECL wzmocnionych HRP. Przykryj pudełko folią aluminiową i inkubuj przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.

Ostrożnie wyjmij membranę z mieszaniny odczynników ECL i naświetl ją za pomocą przyrządu do obrazowania luminescencyjnego. Aby przeanalizować wpływ SINEUP-GFP na komórki za pomocą obrazowania, umyj komórki transektowane pEGFP-C2 i SINEUP-GFP z drugiej 24-dołkowej płytki 0,5 ml PBS na dołek. Aby zabarwić jądro, dodaj 2ug Hoechst-33342 do każdej studzienki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Użyj wysokoprzepustowego cytometru obrazowego mikrostudzienki, aby zmierzyć komórki barwione metodą Hoechst, aby policzyć całkowitą liczbę komórek. Zmierz intensywność zielonej fluorescencji, aby policzyć liczbę komórek GFP dodatnich. Aby przeanalizować, efekt regulacji białka w górę SINEUPs, użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić zintegrowaną intensywność GFP Oblicz ją jako sumę wszystkich intensywności pikseli wyświetlających sygnały w segmentowanych obiektach uzyskanych dla każdego kanału.

Po udanej transfekcji za pomocą SINEUP-GFP, syntetycznego SINEUP zawierającego zarówno optymalną domenę wiążącą, jak i domenę efektorową GFP, translacja mRNA została zwiększona bez zmiany ekspresji mRNA GFP. Protokół półautomatycznej analizy obrazu skrócił czas wykrywania i zwiększył liczbę próbek poddawanych jednocześnie badaniom przesiewowym w porównaniu z konwencjonalną analizą Western blot. Chociaż stwierdzono różnicę w intensywności sygnału, od 2,6-krotności w analizie Western blot do 1,4-krotności w analizie obrazowej, wykryto znacznie wyższe poziomy fluorescencji GFP w porównaniu z kontrolą.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zidentyfikowaniu prawidłowej sekwencji docelowych mRNA, aby zaprojektować prawidłową domenę wiążącą. Geny są często transkrybowane od promotorów i mogą wykorzystywać różne miejsca inicjacji translacji. Przeglądarka Zenbu jest bardzo przydatnym narzędziem do badania takiej wariancji mRNA.

Sugerujemy również zaprojektowanie różnych SINEUPów ze zmiennymi miejscami wiązania. Ogólnie rzecz biorąc, uważamy, że szybkie dostosowanie SINEUP do wielu celów stworzy nową dziedzinę polegającą na pozytywnie regulowanej translacji istniejących RNA, która jest odwrotnością i komplementarnością pola siRNA. Przewidujemy, że w ramach tych funkcji technologia ta będzie miała zasadnicze znaczenie dla produkcji większych ilości białek in vitro, takich jak bioreaktory, a także in vivo w celu naturalnej korekty dawki genów.