Name: Testy komórkowe niekodujących RNA SINEUP, które mogą specyficznie poprawić translację mRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj metody testowania SINEUP w liniach komórkowych w celu zwiększenia translacji mRNA. Technika ta umożliwia globalny screening genów docelowych i ma zastosowanie w terapii chorób z niedoborem białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Basic Science and Platform Technology Program for Innovative Biological Medicine, no. 17am0301014, przez Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego (AMED), Research Grant od MEXT dla RIKEN Center for Life Science Technologies oraz Research Grant od MEXT dla RIKEN IMS. Dziękujemy członkom PC lab i sieci SINEUP (SISSA, University of Eastern Piemont i RIKEN) za prowokujące do myślenia dyskusje. Dziękujemy dr Matthew Valentine'owi za korektę.

1. Projektowanie BD konstruktów SINEUP dla docelowych mRNA
<ol>
	<li>Sprawdź miejsce początkowe transkrypcji (TSS) i miejsce rozpoczęcia translacji docelowych mRNA w interesujących komórkach. Pozyskanie danych TSS zarówno z projektów ENCODE, jak i FANTOM (analiza ekspresji genów cap, CAGE) (ZENBU: http://fantom.gsc.riken.jp/zenbu/).</li>
	<li>Otwórz przeglądarkę, wyszukaj interesujące Cię geny i sprawdź TSS według szczytów CAGE.</li>
	<li>Zapoznaj się z przykładową analizą specyficznego dla komórek i tkanek TSS białka 7 (PARK7) choroby Parkinsona pokazanego na <silna klasa = "xfig">Rysunek 2.</li>
	<li>Zaprojektuj sekwencje BD o kilku różnych długościach odpowiadających 40 zasadom przed i 32 zasadom za pierwszą metioniną (AUG), w sumie 72 nt.</li>
	<li>Zamówienie niestandardowe zaprojektowanych płyt BD w wektorze wyrażeń SINEUP (patrz Tabela materiałów). 
	nuta: Sprawdź specyficzność sekwencji za pomocą podstawowego lokalnego narzędzia do wyszukiwania wyrównania (BLAST), aby uniknąć efektów niedocelowych26.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa i transfekcja SINEUP
<ol>
	<li>Komórki nasienne będące przedmiotem zainteresowania na płytce 6-dołkowej lub 24-dołkowej przez 24 godziny przed transfekcją SINEUPs. W przypadku ludzkiej linii komórkowej zarodka nerki (HEK293T/17) (zob. tabela materiałów), wysiewa się 0,5 x 106 komórek na basenik na płytce 6-dołkowej lub 1,5 x 10,55 komórek na basenik na 24-dołkowej płytce pokrytej poli-D-lizyną (zob. tabela materiałów). Po 24 godzinach staje się zlewny w 70%.</li>
	<li>Po 24 godzinach zmień pożywkę na 1,5 ml świeżej pożywki w przypadku płytki 6-dołkowej lub 0,4 ml świeżej pożywki w przypadku płytki 24-dołkowej. W przypadku SINEUP-GFP, transfekować 0,6 μg pEGFP-C2 (patrz tabela materiałów) i 3,4 μg SINEUP-GFP w jednym basenie na płytce 6-dołkowej lub 130 ng na płytce 6-dołkowej i 670 ng na płytce 24-dołkowej w jednym basenie na płytce 24-dołkowej odczynnikiem do transfekcji (10 μl w płytce 6-dołkowej i 3 μl w płytce 24-dołkowej), postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów), i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Przemyć komórki 2 ml buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) (37 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4, 2,6 mM KCl i 1,5 mM KH2PO4) w każdym dołku na płytce 6-dołkowej lub 0,5 ml PBS w każdym dołku płytki 24-dołkowej. Tylko w przypadku 24-dołkowej płytki pokrytej poli-D-lizyną dodać 25 μl trypsyny o zawartości 0,05% wagowych na objętość, inkubować w inkubatorze z 5% CO2 przez 5 minut i dodać 275 μl pożywki komórkowej na dołek. W przypadku płytki 6-dołkowej dodać 2 ml PBS do każdej studzienki. Pipetować w górę i w dół, aby zebrać 3/4 komórek (1,5 ml dla płytki 6-dołkowej lub 225 μl dla płytki 24-dołkowej) z 1 dołka w celu ekstrakcji białka (przejdź do protokołu 3 w przypadku ekstrakcji białka) i 1/4 komórek (0,5 ml w przypadku płytki 6-dołkowej lub 75 μl w przypadku płytki 24-dołkowej) do ekstrakcji RNA i odwirować w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (przejdź do kroku 5 do ekstrakcji RNA). 
	UWAGA: Przeanalizuj wpływ SINEUP-GFP w 24-dołkowej płytce pokrytej poli-D-lizyną za pomocą obrazowania. Przejdź do kroku 7 (analiza obrazowa).</li>
</ol>
3. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Ostrożnie odessać 1,5 ml PBS i dodać 140 μl roztworu do lizy (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% (w/v) Triton, 2,5 mM pirofosforanu sodu, 1 mM β-glicerofosforanu, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptyny i 0,005% (w/v) fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF)) (patrz tabela materiałów) dla płytki 6-dołkowej lub 60 μl dla 24 dobrze płytka do granulek komórki.</li>
	<li>Wymieszać pipetując, a następnie dokładnie wymieszać, obracając z małą prędkością przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Sprawdź stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego (patrz tabela materiałów). Przygotuj wszystkie reakcje w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Przygotować 5-6-krotne rozcieńczenie wzorca białkowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w ultraczystej wodzie o stężeniach w zakresie 0,2-1,5 mg/ml białka. Za każdym razem przygotowuj nowe standardy.</li>
		<li>Przygotować odczynnik roboczy A, mieszając 1 ml odczynnika A (alkaliczny roztwór winianu miedzi) z 20 μl odczynnika S (roztwór środka powierzchniowo czynnego).</li>
		<li>Załadować 5 μl wody (kontrola ujemna), wzorca BSA (wzorzec białka i kontrola pozytywna) lub próbki białka do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 25 μl odczynnika A. Ostrożnie dodać 200 μl odczynnika B (odczynnik folinowy) do studzienki, unikając tworzenia się pęcherzyków. Przykryj talerz folią aluminiową i odczekaj 5-10 min.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję białka przy długości fali 750 nm za pomocą spektrofotometru. Absorbancja jest stabilna przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Przygotować krzywą wzorcową, wykreślając standardowe stężenia białka BSA (mg/ml) na osi x i ich odpowiednią absorbancję na osi y. Obliczyć stężenie białka w próbce, stosując równanie krzywej standardowej. 
		nuta: W razie potrzeby wstrzymaj protokół na tym etapie lub przejdź do kroku 4. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki białek należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Separacja białek za pomocą SDS-PAGE i wykrywanie docelowych białek z przeciwciałami (analiza Western-blot)
<ol>
	<li>Dodać jedną objętość 2x barwnika ładującego (0,1 M Tris-HCl (pH 6,8), 4% SDS, 20% glicerolu, 1,42% 2-merkaptenolu i 0,2% błękitu bromofenolowego) do każdej objętości próbki białka z kroku 3.3. Ogrzewać w temperaturze 90 °C przez 5 minut i natychmiast schłodzić na lodzie przez 1 minutę.</li>
	<li>Załadować 10-20 μg próbek białka do 10% żelu poliakrylowego SDS i rozdzielić przy 100-150 V) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieść białko z żelu do membrany nitrocelulozowej 0,45 μm (patrz tabela materiałów) za pomocą półsuchego przyrządu do przenoszenia z buforem transferowym (25 mM Tris, 192 mM glicyny i 20% metanolu) przy 25 V przez 30 min.</li>
	<li>Dodać roztwór blokujący (5% odtłuszczone mleko w proszku w 1x bufor TBST (137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,1% Tween-20)) (patrz Tabela Materiałów) do pojemnika, aż membrana zostanie całkowicie nasiąknięta i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>W przypadku SINEUP-GFP należy zhybrydyzować białko z przeciwciałem anty-GFP (rozcieńczonym w stosunku 1:2000 w roztworze blokującym) (patrz Tabela Materiałów) poprzez inkubację błony przez 30 minut z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej. Jako białko kontroli wewnętrznej, wykryj białko β-aktyny poprzez hybrydyzację z przeciwciałem anty-β-aktyny (rozcieńczonym w stosunku 1:2000 w roztworze blokującym) (patrz tabela materiałów) przez 30 minut z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 1x bufor TBST do pojemnika, aż membrana całkowicie nasiąknie i myj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy (w sumie trzy prania).</li>
	<li>Hybrydyzować białko GFP do rozcieńczonego (1:1000 w roztworze blokującym) przeciwciała anty-królika sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP) i hybrydyzować białko β-aktyny do rozcieńczonego (1:1000 w roztworze blokującym) przeciwciała przeciw myszy sprzężonego z HRP na membranie przez 30 minut z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płukać membranę 1x buforem TBST przez 5 min w temperaturze pokojowej. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy (w sumie trzy prania).</li>
	<li>Wymieszać równą objętość odczynnika 1 i 2 do wykrywania chemiluminescencji wzmocnionej HRP (ECL) (patrz tabela materiałów). Przenieś membranę do 2 ml mieszanki odczynników ECL, przykryj pudełko folią aluminiową i pozostaw do inkubacji przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyjmij membranę z mieszanki odczynników ECL i naświetl ją za pomocą przyrządu do obrazowania luminescencyjnego.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja RNA i leczenie DNazą
<ol>
	<li>Ekstrahuj całkowite RNA zgodnie ze standardowym protokołem ekstrakcji RNA z komórek hodowanych w monowarstwie27 lub alternatywnie użyj dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji RNA (patrz Tabela Materiałów). Aby krótko mówiąc, dodaj dowolny odczynnik do lizy jednofazowej (MLR) izotiocyjanianu guanidyny i fenolu do pobranych komórek w kroku 2.3 (1 ml MLR na ~ 5 milionów komórek)27. 
	nuta: Często zmieniaj rękawice. Używaj odczynników wolnych od RNaz oraz wyrobów plastikowych i szklanych nasączonych dietylowęglanem (DEPC), aby zapobiec degradacji RNA. W razie potrzeby wstrzymaj protokół na tym etapie. Wyekstrahowany RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dodać 0,1 objętości 10x bufora DNazy i 2 U DNazy do oczyszczonego RNA z kroku 5.1 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Ustawić objętość reakcji na 50 μl wodą wolną od nukleaz i delikatnie wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 0,1 objętości ponownie zawieszonego odczynnika do inaktywacji DNazy i dobrze wymieszać (patrz Tabela Materiałów). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 90 s. Przenieść supernatant (RNA wolny od DNA) do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz. Uważaj, aby nie dotknąć osadu, ponieważ może to spowodować przeniesienie DNazy, co jest kłopotliwe dla dalszych etapów.</li>
	<li>Określ ilościowo RNA, mierząc stosunek A260 i A260/A280 (dla czystego RNA zakres wynosi 1,8-2,0) w spektrofotometrze UV.</li>
</ol>
6. Synteza pierwszej nici cDNA i analiza qRT-PCR
<ol>
	<li>Przeprowadzić syntezę pierwszej nici cDNA zgodnie ze standardowym protokołem syntezy cDNA, jak poniżej (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wymieszać 0,75 μM startera oligo dT, 4,3 μM startera losowego, dNTP (po 10 mM każdy) z 200-500 ng całkowitego RNA (z kroków 5-8) w 10 μl całkowitej objętości reakcji. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.</li>
		<li>Wymieszać 1x bufor odwrotnej transkryptazy, 1 U inhibitora RNazy, 10 U odwrotnej transkryptazy i dodać do 10 μl mieszaniny RNA-starter z 6.1.1.</li>
		<li>W razie potrzeby ustawić całkowitą objętość reakcji na 20 μl z wodą wolną od nukleaz. Delikatnie wymieszać i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 30 °C przez 10 minut, następnie w temperaturze 42 °C przez 60 minut, a na koniec w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu inaktywacji enzymu. Ostudzić rurki na lodzie. 
		nuta: Rozmrozić próbki RNA i wszystkie odczynniki na lodzie i przygotować mieszaninę reakcyjną na lodzie. Jeśli docelowe RNA to tylko RNA poliA, należy użyć tylko startera oligo dT (2,5 μM). W razie potrzeby wstrzymaj protokół. Zsyntetyzowane cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić qRT-PCR w trzech próbach technicznych (n=3, odchylenie standardowe Cт > 0,2) oraz w kontrpróbach biologicznych (n ≥ 3) przy użyciu 1 μl 10 ng cDNA, 0,4 μl startera odwrotnego (10 μM), 0,4 μl startera (10 μM), 10 μl roztworu mieszaniny polimerazy DNA, 0,4 μl dwuniciowego barwnika barwiącego DNA, 10 μl wody wolnej od nukleaz (objętość reakcji wynosiła 20 μl) w celu wykrycia produktów PCR w następujących warunkach; Etap utrzymywania (1 cykl) przez 30 s w temperaturze 95 °C, etap cykliczny (40 cykli) przez 5 s w temperaturze 95 °C i przez 30 s w temperaturze 60 °C, etap krzywej topnienia. Przykłady elementarzy dotyczą Gapdh_Fw ludzkiej: TCTCTGCTCCCTCTTC, Gapdh_Rv ludzkie: GCCCAATACGACCAAATCC, EGFP_Fw: GCCCGACAACCACTACCTGAG, EGFP_Rv: CGGCGGTCACGAACTCCAG, SINEUP-GFP_Fw: CTGGTGTGTATTATCTCTTATG i SINEUP-GFP_Rv: CTCCCGAGTCTCTGTAGC. Zobacz tabelę materiałów. Analizuj ilościową ekspresję RNA za pomocą metody 2-∆∆Ct ± SD28.</li>
</ol>
7. Analiza obrazowa SINEUPS za pomocą półautomatycznej metody wykrywania
<ol>
	<li>Umyj komórki 0,5 ml PBS dla jednego dołka na płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 2,0 μg Hoechst 33342 (patrz tabela materiałów) (rozpuszczając się w 500 μl PBS) do każdego dołka na płytce 24-dołkowej i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu wybarwienia jądra.</li>
	<li>Zmierzyć komórki barwione metodą Hoechsta, aby policzyć całkowitą liczbę komórek przy maksimum emisji niebieskiej 461 nm i intensywności zielonej fluorescencji, aby policzyć liczbę komórek GFP dodatnich przy maksimum zielonej emisji 510 nm, używając wysokoprzepustowego cytometru obrazowego mikrostudzienki (patrz tabela materiałów). Analizuj efekt regulacji w górę białek SINEUPs, obliczając zintegrowaną intensywność GFP, która jest sumą wszystkich intensywności pikseli wyświetlających sygnał w segmentowanych obiektach obliczonych dla każdego kanału, przy użyciu oprogramowania do obrazowania29.</li>
	<li>Zbierz komórki, aby sprawdzić ekspresję RNA (powrót do kroków 5 i 6).</li>
</ol>

<ol><li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/309/5740/1564.short">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309 (5740), 1564-1566 (2005).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>Hon, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+human+long+non-coding+RNAs+with+accurate+5%27+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5' ends.</a> Nature. 543 (7644), 199-204 (2017).</li>
<li>Tufarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+antisense+RNA+leading+to+gene+silencing+and+methylation+as+a+novel+cause+of+human+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease.</a> Nature Genetics. 34 (2), 157-165 (2003).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+tumour+suppressor+gene+p15+by+its+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of tumour suppressor gene p15 by its antisense RNA.</a> Nature. 451 (7175), 202-206 (2008).</li>
<li>Carninci, P., Hayashizaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+transcription+beyond+annotated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA transcription beyond annotated genes.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 139-144 (2007).</li>
<li>Chu, Y., Yue, X., Younger, S. T., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+argonaute+proteins+in+gene+silencing+and+activation+by+RNAs+complementary+to+a+non-coding+transcript+at+the+progesterone+receptor+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter.</a> Nucleic Acids Research. 38 (21), 7736-7748 (2010).</li>
<li>Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of microRNA biogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 509-524 (2014).</li>
<li>Takahashi, H., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+genome+transcription%3A+new+possibilities+for+RNA+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Widespread genome transcription: new possibilities for RNA therapies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (2), 294-301 (2014).</li>
<li>Lam, J. K. W., Chow, M. Y. T., Zhang, Y., Leung, S. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4, e252(2015).</li>
<li>Nishina, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2FRNA+heteroduplex+oligonucleotide+for+highly+efficient+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing.</a> Nature communications. 6, 7969(2015).</li>
<li>Carrieri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+antisense+RNA+controls+Uchl1+translation+through+an+embedded+SINEB2+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat.</a> Nature. 491 (7424), 454-457 (2012).</li>
<li>Schein, A., Zucchelli, S., Kauppinen, S., Gustincich, S., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antisense+long+noncoding+RNAs+that+function+as+SINEUPs+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of antisense long noncoding RNAs that function as SINEUPs in human cells.</a> Scientific Reports. 6, 33605(2016).</li>
<li>Zucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SINEUPs+are+modular+antisense+long+non-coding+RNAs+that+increase+synthesis+of+target+proteins+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SINEUPs are modular antisense long non-coding RNAs that increase synthesis of target proteins in cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 174(2015).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+features+of+synthetic+SINEUPs%2C+antisense+lncRNAs+that+specifically+enhance+protein+translation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification of functional features of synthetic SINEUPs, antisense lncRNAs that specifically enhance protein translation.</a> PLOS ONE. 13 (2), e0183229(2018).</li>
<li>Deutschbauer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169 (4), 1915-1925 (2005).</li>
<li>Indrieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+long+non-coding+RNAs+%5BSINEUPs%5D+rescue+defective+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Synthetic long non-coding RNAs [SINEUPs] rescue defective gene expression in vivo.</a> Scientific Reports. 6, 27315(2016).</li>
<li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+mammalian+cell+factories+with+SINEUP+noncoding+RNAs+to+improve+translation+of+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering mammalian cell factories with SINEUP noncoding RNAs to improve translation of secreted proteins.</a> Gene. , (2015).</li>
<li>Sasso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+non-coding+SINEUP+RNA+boosts+semi-stable+production+of+fully+human+monoclonal+antibodies+in+HEK293E+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">A long non-coding SINEUP RNA boosts semi-stable production of fully human monoclonal antibodies in HEK293E cells.</a> MAbs. , 1-8 (2018).</li>
<li>Dang, V. T., Kassahn, K. S., Marcos, A. E., Ragan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+haploinsufficient+genes+and+their+genomic+proximity+to+segmental+duplications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of human haploinsufficient genes and their genomic proximity to segmental duplications.</a> European Journal of Human Genetics. 16 (11), 1350-1357 (2008).</li>
<li>Zucchelli, S., Patrucco, L., Persichetti, F., Gustincich, S., Cotella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Translation+in+Mammalian+Cell+Factories+to+Increase+Protein+Yield%3A+The+Unexpected+Use+of+Long+Non-Coding+SINEUP+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Struct+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Engineering Translation in Mammalian Cell Factories to Increase Protein Yield: The Unexpected Use of Long Non-Coding SINEUP RNAs.</a> Computational and Struct Biotechnology Journal. 14, 404-410 (2016).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes & Development. 24 (15), 1634-1644 (2010).</li>
<li>Watts, J. K., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+disease+genes+in+the+laboratory+and+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Silencing disease genes in the laboratory and the clinic.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 365-379 (2012).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (7), 670-676 (2014).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Liu, X., Harada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+isolation+from+mammalian+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA isolation from mammalian samples.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4.16 (2013).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Severin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+visualization+and+analysis+of+large-scale+sequencing+datasets+using+ZENBU%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Interactive visualization and analysis of large-scale sequencing datasets using ZENBU.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 217-219 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAe%3A+an+effective+method+for+targeted+protein+translation+enhancement+by+artificial+non-coding+RNA+with+SINEB2+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNAe: an effective method for targeted protein translation enhancement by artificial non-coding RNA with SINEB2 repeat.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), e58(2015).</li>
<li>Savić, N., Schwank, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+therapeutic+CRISPR%2FCas9+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing.</a> Translational Research. 168, 15-21 (2016).</li>
<li>Long, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAe+in+a+transgenic+growth+hormone+mouse+model+shows+potential+for+use+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">RNAe in a transgenic growth hormone mouse model shows potential for use in gene therapy.</a> Biotechnology Letters. , (2016).</li>
</ol>

Autor korespondencyjny Piero Carninci jest jednym z założycieli firmy TransSINE Technologies Co. Ltd., która posiada własność intelektualną na podstawie zgłoszonego patentu (EP2691522A4 i JP2017169573A) oraz udzielonego patentu (US9353370B2) na technologię SINEUP.

Opisaliśmy tutaj protokół mający na celu specyficzne zwiększenie produkcji białka docelowego mRNA za pomocą niekodującego RNA zawierającego SINE, zwanego SINEUPs. Jako reprezentatywny przykład, wykazano, że optymalna syntetyczna SINEUP-GFP zwiększa 2,6-krotnie translację mRNA GFP, mierzoną za pomocą analizy Western-blot.
Zaprojektowanie optymalnego BD ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia swoistości i siły działania SINEUP (zakresu regulacji białka w górę). Wcześniej przeprowadziliśmy badanie przesiewowe 17 BD SINEUP-GFP za pomocą analizy Western-blot15 i stwierdziliśmy, że optymalna BD nakłada się na sekwencję AUG-KOZAK mRNA GFP, chociaż może tak nie być w przypadku innych mRNA i powinna być weryfikowana dla każdego przypadku. Inna niezależna grupa również przeprowadziła badanie przesiewowe BD przy użyciu innej metody31. Ponieważ przesiewanie wielu BD może być dość czasochłonne i kłopotliwe, wprowadziliśmy tutaj metodę wykrywania SINEUP o wysokiej przepustowości. Metoda ta mierzy względne zmiany gęstości zintegrowanej GFP w komórkach transfekowanych SINEUP w porównaniu z komórkami transfekowanymi wektorem kontrolnym. Aby zapewnić, że komórki w konkretnym dołku płytki hodowlanej są transfekowane równomiernie, a sygnał GFP nie jest skoncentrowany tylko w określonym obszarze studzienki, bardzo ważne jest równomierne rozmieszczenie komórek w studzienkach w kroku 2.1. W tym celu delikatnie potrząśnij płytką 10 razy w przód iw tył (↑↓) po wysianiu komórek w czystej ławce i powtórz w inkubatorze 5% CO2 przed rozpoczęciem inkubacji.
Kolejnym krytycznym krokiem jest obliczenie stężenia białka w kroku 3.3. Błędne obliczenia w tym przypadku mogą prowadzić do załadowania błędnej ilości białka podczas analizy Western-blot, co w konsekwencji uniemożliwi wykrycie niewielkich zmian w ekspresji białka przez niektóre ze słabych SINEUP lub generuje wyniki fałszywie dodatnie z powodu przeciążenia. Zaleca się za każdym razem świeże przygotowanie krzywej wzorca białka, upewniając się, że w kroku 3.3.3 zmierzono równe ilości wzorców i próbek białka. Opisany tutaj protokół koncentruje się na SINEUP-GFP, ale analiza Western-blot może być stosowana dla dowolnego docelowego mRNA, które Cię interesuje. Czas inkubacji i stężenie przeciwciał powinny być zoptymalizowane dla każdego celu, aby uzyskać najlepszy wynik.
Jedną z unikalnych cech SINEUPS jest to, że poziom ekspresji docelowego mRNA pozostaje niezmieniony. Ważne jest, aby traktować RNA DNazą, aby uniknąć wykrycia transfekowanych SINEUPs i genomowego DNA za pomocą qRT-PCR. SINEUP RNA i docelowa ekspresja mRNA powinny być mierzone za pomocą qRT-PCR, aby potwierdzić powodzenie zarówno transfekcji, jak i aktywności SINEUP. SINEUPs zawierają sekwencję SINE, która występuje obficie zarówno w genomie człowieka, jak i myszy. Aby uniknąć nieswoistego wykrywania sekwencji SINE, nie zaleca się projektowania starterów qRT-PCR do sekwencji SINE.
W tym protokole użyliśmy ludzkich linii komórkowych, ale SINEUPy są skuteczne w wielu liniach komórkowych z kilku różnych gatunków 12,13,14,18,19. Warunki hodowli komórkowej i transfekcji mogą być modyfikowane w zależności od różnych linii komórkowych, o ile utrzymują one wydajność transfekcji wektorów SINEUP. Ponadto można zastosować alternatywne metody ekstrakcji RNA, syntezy cDNA i kontroli stężenia białka, biorąc pod uwagę, że zachowują one wymaganą jakość RNA i białka do analizy qRT-PCR i Western-blot. Podczas gdy użyliśmy specyficznego wysokoprzepustowego cytometru mikrostudziennego, który umożliwił wykrycie fluorescencji GFP w całej studzience, można zastosować inne cytometry o podobnym zakresie wykrywania31. Należy zauważyć, że jeśli rozmieszczenie komórek i transfekcja są równe w całej studzience, nie jest konieczne skanowanie całej studni pod kątem fluorescencji GFP: połowa lub jedna czwarta obszaru studzienki może wystarczyć, aby dostrzec efekt SINEUP w zależności od umiejętności eksperymentalnych.
Ustanowienie wysokoprzepustowego protokołu detekcji SINEUP pozwala na jednoczesne badanie przesiewowe wielu BD ukierunkowanych na dane mRNA w hodowanych komórkach. Jest to o tyle istotne, że przepisy regulujące optymalne targetowanie przez BD są nadal niejasne. Taki multipleksowy system przesiewowy pozwala na testowanie na dużą skalę wielu SINEUP pod kątem różnych genów, co jest przydatne na przykład do celowania w wiele genów zaangażowanych w określony szlak sygnałowy. Co więcej, można go wykorzystać do rozszerzenia poszukiwań skutecznych SINEUP ukierunkowanych na kilka mRNA, projektowania różnych BD SINEUP wokół regionu AUG-Kozak (patrz rysunek 1), kotransfekcji docelowych mRNA o pełnej długości (5ʹ UTR-CDS-3ʹ UTR) połączonych z mRNA GFP w hodowanych komórkach w celu znalezienia optymalnych SINEUPs, a następnie testowania kandydatów na BD przeciwko endogennym mRNA w hodowanych komórkach i zwierzętach modelowych in vivo, od ludzi i myszy po inne gatunki zwierząt i roślin.
Ten protokół przesiewowy jest bardzo szybki. Nie musimy naprawiać i zbierać komórek, wystarczy umieścić żywą płytkę do hodowli komórek w przyrządzie do obrazowania. Proponujemy wykorzystanie tego wysokoprzepustowego protokołu badań przesiewowych do wyboru optymalnych BD SINEUP i oceny potencjalnych kandydatów za pomocą analizy Western-blot. W ten sposób wybrani kandydaci z optymalnymi BD mogą być zastosowani w celu zwiększenia produkcji przeciwciał 18,19,21. Obecnie dziedzina terapii RNA dramatycznie się rozwija. Na przykład terapie siRNA, ASO, mRNA i CRISPR RNA są szeroko stosowane do kontrolowania ekspresji mRNA odpowiednich celów 9,32. W tym kontekście, SINEUPy są w powijakach, ale jak dotąd żaden z badanych SINEUPów nie zmienił ekspresji docelowych mRNA. Ponadto SINEUPy nie edytują docelowego mRNA, a jedynie regulują translację mRNA w górę. Co więcej, choroby związane z utratą funkcji wynikające z haploinsuficjencji mogą być zwalczane przez terapię SINEUP, osiągając 2-krotną indukcję niedoboru białka17,33. Chociaż efekty off-target muszą być dalej badane, SINEUP potencjalnie i specyficznie celują w pojedyncze, ekspresyjne mRNA z sekwencją komplementarną do BD.
Ograniczeniem tego wysokoprzepustowego protokołu jest to, że nie nadaje się on do badań przesiewowych BD SINEUP w modelach mysich in vivo, ponieważ protokół mierzy tylko intensywność zintegrowanej GFP. Ponieważ SINEUPy są naturalnymi antysensownymi lncRNA, które działają potranskrypcyjnie, nie można ich zastosować, gdy w komórkach lub próbkach tkanek brakuje docelowego mRNA.
Niemniej jednak SINEUPs mogą być stosowane w badaniach nad wzmocnieniem funkcji, w celu zwiększenia produkcji przeciwciał oraz jako terapia RNA w celu zwiększenia ekspresji niedoborów białek w zakresie 1,5-3,0-krotnym. Opisane tutaj metody stanowią użyteczny przewodnik do celowania i wykrywania indukowanego przez SINEUP wzmocnienia translacji pożądanego mRNA i zapewniają nowe narzędzie do potranskrypcyjnej regulacji genów.

W erze postgenomicznej, dzięki rozwojowi technologii sekwencjonowania nowej generacji, uzyskano wiele wglądów w regulacyjną rolę genów niekodujących transkryptów antysensownych1,2,3 i narzędzia do edycji genów. Ta kategoria transkryptów, która wcześniej była uważana za "śmieci transkrypcyjne", jest obecnie uznawana za kluczowego gracza regulacji genetycznej. Doniesiono, że transkrypty antysensowne modulują chromatynę oraz kontrolują stabilność i ekspresję ich pokrewnego mRNA4,5. W większości przypadków ten sposób regulacji jest negatywny, a transkrypty antysensowne wyciszają swoje odpowiedniki zmysłowe poprzez interakcje RNA-RNA6,7. Ta cecha naturalnych transkryptów antysensownych została wykorzystana do obniżenia pożądanych genów w postaci syntetycznego małego interferującego RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA) i oligonukleotydów antysensownych (ASO)8,9,10,11, pozostawiając pustkę technologiczną dla ukierunkowanej regulacji genów w górę.
Jedno intrygujące badanie zmieniło perspektywę antysensownego pola RNA, wykazując, że antysensowne długie niekodujące RNA (AS lncRNAs) genów Uchl1 (ubikwityna C-końcowa hydrolaza L1) i Uxt (wszechobecnie wyrażony transkrypt) pozytywnie regulują translację ich pokrewnego mRNA na poziomie posttranskrypcyjnym u myszy12. Koniec 5ʹ tych lncRNA AS nakłada się na kilka zasad w regionie 5ʹ nieulegającym translacji (5ʹ UTR) odpowiadających im transkryptów zmysłowych, a nienakładający się koniec 3ʹ zawiera odwrócone powtórzenie retrotranspozonu należącego do rodziny krótkich przeplatanych elementów jądrowych (SINE). Co ciekawe, odkryliśmy, że główną siłą napędową tej translacyjnej regulacji w górę jest wbudowana liczba powtórzeń SINE i nie ogranicza się ona tylko do mysich powtórzeń SINE. Ludzkie lncRNA AS zawierające powtórzenia Alu również usprawniły translację mRNA o docelowym wyczuciu, wzmacniając ideę nowej klasy regulatorowych antysensownych niekodujących RNA sterowanych SINE, odpowiednio nazwanych SINEUPs13. Ostatnie badania wykazały, że potencjał naturalnych SINEUPs jest zachowany w syntetycznych SINEUPs zaprojektowanych specjalnie do celowania w różne endogenne i egzogenne geny14,15. SINEUP mają dwie ważne cechy: po pierwsze "domenę wiążącą" (BD), która jest na ogół regionem końcowym 5ʹ komplementarnym do sekwencji obejmującej główny kodon start mRNA kodującego białko, a po drugie "domenę efektorową" (ED), ponieważ zawiera odwrócone powtórzenie SINE, co jest warunkiem wstępnym dla funkcji SINEUP14 (Rysunek 1). SINEUPy można dostosować do potrzeb klienta w celu zaprojektowania BD ukierunkowanego na wybrany gen. Można to następnie wykorzystać do analizy funkcji konkretnego genu zaangażowanego w szlak biologiczny, jako lepszą alternatywę dla konwencjonalnej strategii nadekspresji mRNA. Ponadto to wszechstronne narzędzie może być stosowane w celu zwiększenia produkcji przeciwciał oraz jako lek do leczenia chorób haploniewystarczających spowodowanych niewystarczającymi dawkami funkcjonalnych białek16,17,18,19,20,21.
Zalety technologii SINEUP są wielorakie. Nie zmienia ekspresji celu na poziomie transkrypcji. Dłuższe BD zapewniają większą specyficzność SINEUPs, jednocześnie nie wywołując zależnej od dsRNA odpowiedzi na stres15. Indukcja białka jest utrzymywana w normalnym zakresie fizjologicznym komórki, zapobiegając wszelkim szkodliwym skutkom spowodowanym nieprawidłową lub nadmierną ekspresją białka. SINEUPy są kompatybilne z szeroką gamą linii komórkowych hodowanych u myszy, ludzi i chomików, na przykład HEK293T/17, HepG2, HeLa, CHO, MN9D i wielu innych12,13,14,15,18,19. SINEUP mogą skutecznie celować w geny endogenne, geny przejściowo nadmiernie eksprymowane oraz geny znakowane FLAG lub geny fuzyjne lucyferazy, eliminując potrzebę stosowania przeciwciał specyficznych dla genu14,18. Podstawowa analiza SINEUP wymaga rutynowej hodowli komórkowej, transfekcji, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), ilościowych instrumentów i ustawień reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) w czasie rzeczywistym, a wiedzę można zdobyć w krótkim czasie.
Tutaj opisujemy metodę celowania w geny za pomocą syntetycznych SINEUP w celu zwiększenia translacji, co jest efektem przeciwnym do innych technologii, takich jak interferencja RNA9 i ASO gapmers11,22,23. Szeroko stosowaną metodą aktywacji genów sterowanej przez RNA jest grupowana aktywacja oparta na krótkich powtórzeniach palindromicznych (CRISPRa), w której ekspresja genu jest wyzwalana na poziomie transkrypcji24. Ta metoda, choć prosta i szybka, wymaga wielu pojedynczych przewodników RNA (sgRNA) ukierunkowanych na ten sam gen w celu uzyskania wyższej wydajności, zwiększając w ten sposób szanse na wiązanie poza celem25. Ponadto kluczowy enzym systemu CRISPRa, katalitycznie martwe białko 9 związane z CRISPR (dCas9) ma niską specyficzność wiązania, a sgRNA ukierunkowane na dwukierunkowe regiony promotora mogą niespecyficznie regulować w górę pobliskie geny25. I odwrotnie, SINEUPy wiążą się z docelowym mRNA w pojedynczym regionie wiązania o wysokiej specyficzności i nie wpływają na ekspresję pobliskich genów. Omawiamy podstawowe etapy związane z projektowaniem SINEUP, transfekcją, analizą ekspresji białek i RNA. Ponadto prezentujemy półautomatyczny, wysokowydajny system obrazowania do badania wielu SINEUP jednocześnie, co jest przydatne do wykrywania optymalnych SINEUPs.

<table><tbody><tr><td>Synthetic SINEUP</td><td>Cell Guidance Systems Ltd. w Wielkiej Brytanii i K.K.DNAFORM w Japonii</td><td>https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html i https://www.dnaform.jp/en/information/20130320</td><td>Krok 1.5</td></tr><tr><td>HEK293T/17</td><td></td><td>ATCC ATCC CRL-11268</td><td>Krok 2.1</td></tr><tr><td>Falcon Multiwell Plate do hodowli komórkowych Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>6902A01</td><td>Krok 2.1</td></tr><tr><td>Corning BioCoat Poli-D-lizyna Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>08-774-124</td><td>Krok 2.1</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td>Krok 2.2</td></tr><tr><td>pEGFP-C2</td><td>Clontech</td><td>#6083-1</td><td>Krok 2.2</td></tr><tr><td>Bufor do lizy komórek (10x)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#9803S</td><td>Krok 3.1 Jest to wstępnie zmieszany roztwór do lizy komórek.</td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> <td>PMSF</td><td>#8553S</td><td>Krok 3.1 Aby uzupełnić bufor do lizy komórek, dodaj 0,005% (w/v) PMSF do 1x bufora do lizy komórek.</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek DC II</td><td>BIO RAD</td><td></td>#5000112JA <td>Krok 3.3</td></tr><tr><td>10% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 12-dołkowe, 20 i mikro; L</td><td>BIO RAD</td><td>#4561035</td><td>Krok 4.2</td></tr><tr><td>Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm&times; 4 m)</td> <td>Amasham</td><td>10600013</td><td>Krok 4.3, to jest 0,45 &mikro; m membrana nitrocelulozowa.</td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórek</td> <td>beztłuszczowego mleka w proszku</td><td>#9999S</td><td>Krok 4.4 Składnik roztworu blokującego.</td></tr><tr><td>GFP Tag Przeciwciało</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6455</td><td>Krok 4.5 Numer serii: 1495850, RRID: AB_221570</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-&beta;-aktynowe wytwarzane u myszy</td><td>SIGMA</td><td>A5441</td><td>Krok 4.5 Numer serii: 026M4780V, RRID: AB_476744</td></tr><tr><td>Poliklonalne kozie immunoglobuliny przeciw królikom</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>Krok 4.5 Jest to przeciwciało wtórne sprzężone z HRP dla przeciwciała anty GFP. Numer serii: 20017525, RRID:AB_2617138</td></tr><tr><td>Poliklonalne kozie immunoglobuliny przeciw mysim</td><td>Dako</td><td>P0447</td><td>Krok 4.5 Jest to przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP dla przeciwciała anty &beta;-aktyny. Numer serii: 20019698, RRID:AB_2617137</td></tr><tr><td>Odczynniki do wykrywania Western Blotting ECL</td><td>Amersham</td><td>RPN2109</td><td>Krok 4.9</td></tr><tr><td>Przyrząd do szybkiego koncentratora próbek Maxwella (RSC) Promega</td><td></td><td>AS4500</td><td>Krok 5.1 Jest to dostępny na rynku instrument do eksreakcji RNA.</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit</td><td>Promega</td><td>AS1390</td><td>Krok 5.1 Jest to dostępny na rynku zestaw do eksreakcji RNA.</td></tr><tr><td>Zestaw TURBO DNA-free</td><td>ambion</td><td>AM1907</td><td>Krok 5.2 i 5.4 Zestaw zawiera DNazę, bufor DNazy i odczynnik inaktywacyjny.</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy 1. nici cDNA PrimeScrip</td><td>TaKaRa</td><td>6110A</td><td>Krok 6.1 Zestaw zawiera odczynniki do syntezy pierwszej nici cDNA.</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II</td><td>TaKaRa</td><td>RR820A</td><td>Step 6.2</td></tr><tr><td>Hoechst3342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Step 7.2</td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>200-BFFL-S</td><td>Step 7.3 Jest to cytometr obrazowy do mikrostudzienek o wysokiej przepustowości.</td></tr></tbody></table>

testy komórkowe niekodujących rna sineup, które mogą specyficznie poprawić translację mrna

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Ulepszenie białka docelowego ma znaczenie nie tylko dla badania procesów biologicznych, ale także dla zastosowań terapeutycznych i biotechnologicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę selektywnej regulacji ekspresji białek pożądanych genów w hodowanych komórkach za pomocą syntetycznych antysensownych niekodujących RNA znanych jako SINEUPs. Ta pozytywna kontrola ekspresji genów odbywa się na poziomie potranskrypcyjnym i jest wywierana przez odwrócone powtórzenie krótkiego przeplatanego elementu jądrowego (SINE) na końcu 3ʹ SINEUPs, który obejmuje jego domenę efektorową (ED). SINEUP mogą specyficznie wiązać się z dowolnym mRNA kodującym białko poprzez jego domenę wiążącą (BD), region zaprojektowany w celu uzupełnienia sekwencji w regionie 5ʹ nieulegającym translacji (5ʹ UTR) i wokół kodonu start mRNA. Zaprojektowane w ten sposób SINEUPy specyficzne dla celu są transfekowane do hodowanych komórek, a białka i RNA są ekstrahowane do dalszych analiz, zwykle 24-48 godzin po transfekcji. Indukowana przez SINEUP regulacja białka w górę jest wykrywana za pomocą analizy Western-blot, a ekspresja RNA jest mierzona za pomocą ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Zaobserwowaliśmy, że konstrukcja BD ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia optymalnej aktywności SINEUP i że zaleca się testowanie różnych rozmiarów i pozycji BD w odniesieniu do kodonu start docelowego mRNA. Dlatego opisujemy tutaj półautomatyczną, wysokoprzepustową metodę obrazowania opartą na detekcji fluorescencji, którą można zaimplementować do celowania w mRNA połączone z białkiem zielonej fluorescencji (GFP). SINEUP specyficznie wzmacniają translację w normalnym fizjologicznym zakresie komórki, bez zmiany docelowego poziomu transkryptu. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana przeciwko wielu endogennym i egzogennym celom, w szerokiej gamie linii komórkowych ludzi, myszy i owadów wraz z systemami in vivo. Co więcej, donoszono, że SINEUP zwiększają produkcję przeciwciał i działają jako terapia RNA przeciwko genom haploniedostatecznym. Wszechstronny i modułowy charakter SINEUPS sprawia, że są one odpowiednim narzędziem do kontroli translacyjnej specyficznej dla genów.

SINEUP-GFP jest syntetycznym SINEUPem zawierającym zarówno optymalny BD (zakres nakładki -28/+4 na mRNA GFP), jak i ED (odwrócony SINE B2 z AS-Uchl1), który może zwiększać translację mRNA GFP (Rysunek 3A i 3B) bez zmiany ekspresji mRNA GFP (Rysunek 3C i 3D). Aby przeskanować optymalne BD i ED dla SINEUPów, opracowaliśmy protokół półautomatycznej analizy obrazu, który skrócił czas detekcji i zwiększył liczbę próbek analizowanych jednocześnie w porównaniu z konwencjonalną analizą Western-blot15. Jak pokazano na Rysunku 4, ten wysokoprzepustowy system obrazowania wymagał 3 dni (analiza Western-blot trwała 2 tygodnie dla 48 SINEUPów). Po wykazaniu, że SINEUP-GFP zwiększa translację GFP, zmierzyliśmy zintegrowaną intensywność GFP za pomocą cytometru obrazowego. Optymalny BD SINEUP-GFP wywołał 1,4-krotny wzrost ekspresji białka GFP. Chociaż zaobserwowaliśmy kompresję sygnałów z 2,6-krotnego (analiza Western-blot, patrz Rysunek 3A) do 1,4-krotnego (analiza obrazowania, patrz Rysunek 5), różnica ta może wynikać z kalibracji oprogramowania instrumentu obrazującego. Niemniej jednak wykryliśmy znacznie wyższe poziomy fluorescencji GFP w porównaniu z kontrolą (Rysunek 5A i 5B).
<img alt="Schemat mechanizmu SINEUP: domena efektorowa wiąże docelowe mRNA, zwiększając translację CDS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Podstawowa budowa syntetycznych SINEUP-ów. BD = domena wiążąca do docelowego mRNA, ED = domena efektorowa zawierająca odwróconą sekwencję SINE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<img alt="Analiza ekspresji genu PARK7; sekwencja DNA przedstawiona na schemacie lokalizacji genomowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS) ludzkiego białka 7 choroby Parkinsona (PARK7) mRNA w określonych tkankach i komórkach wykryte za pomocą analizy CAGE. (A) Zrzut ekranu przedstawiający wynik wyszukiwania TSS dla człowieka PARK7 mRNA przy użyciu systemu integracji danych omicznych i interaktywnej wizualizacji30Pozioma zielona strzałka na ścieżce genów Entrez hg19 wskazuje genomiczną pozycję referencyjnego człowieka PARK7 mRNA oraz pionowe zielone paski na ścieżkach FANTOM5 CAGE 1 i 2 wskazują sumę TSS (mierzoną jako liczba transkryptytów na milion (tpm)) z 1 829 rodzajów tkanek i komórek.B) Powiększenie zaznaczonego obszaru TSS z panelu A (skala 1/354: od 35,4 kb do 10 bp). Szary obszar w ścieżkach FANTOM5 CAGE faza 1 i 2 wskazuje TSS dla 6 konkretnych komórek spośród wszystkich 1829, które wymieniono na dole rysunku. Liczby (1,369, 4,98, 4,304, 3,509, 3,47 i 3,05) odpowiadające tym wymienionym komórkom wskazują liczbę transkryptów na milion dla każdej konkretnej komórki w zaznaczonych szarym pozycjach TSS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Analiza ekspresji białek i mRNA z wykorzystaniem Western blot i qPCR, indukcja GFP przez SINEUP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Analiza Western-blot potwierdzająca zwiększenie translacji przez SINEUP-GFP. (A) Poziom SINEUP-GFP sprawdzono metodą Western-blot z użyciem przeciwciała anty-GFP. (BWyniki znormalizowano względem intensywności prążka białka β-aktyny.C) mRNA GFP i (DEkspresję RNA SINEUP wykryto za pomocą qRT-PCR. ***p &lt; 0,005, n = 3, dwustronny test t Studenta, słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Takahashi i wsp.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces transfekcji komórek; SINEUPy; schemat; płytka 24-dołkowa; eksperyment detekcji DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Schemat półautomatycznej analizy obrazów SINEUP. Dzień 1: Wysiewanie wybranych komórek na płytkę 24-dołkową. Dzień 2: Transfekcja GFP oraz SINEUP-GFP. Dzień 3: Analiza wpływu SINEUP-ów poprzez pomiar zintegrowanej intensywności GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna i wykres słupkowy analizujący intensywność GFP w płytce 24-dołkowej, efekt SINEUP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wysokoprzepustowa analiza zwiększenia translacji przez SINEUP-GFP. (A) Porównanie fluorescencji GFP pomiędzy komórkami kontrolnymi a komórkami z transfekcją SINEUP-GFP15Skala = 2 mm. (B) Zintegrowaną intensywność GFP znormalizowano do całkowitej liczby komórek policzonych poprzez barwienie jąder Hoechst 3342. ***p &lt; 0,05, n = 3, dwustronny test t-Studenta, słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. FOV: pole widzenia. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Takahashi i in.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

SINEUPs to syntetyczne, antysensowne, niekodujące RNA, które zawierają domenę wiążącą (BD) i domenę efektorową (ED) oraz regulują w górę translację docelowego mRNA. W tym miejscu opisujemy metody wykrywania SINEUP w hodowanych liniach komórkowych, analizę ich aktywności promującej translację za pomocą Western-blot oraz półautomatyczny system obrazowania o wysokiej przepustowości.

Testy komórkowe niekodujących RNA SINEUP, które mogą specyficznie poprawić translację mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak to, jak pozytywnie moderować aktywność genu, wykorzystując mRNA obecne w komórkach i tkankach. Jak zrekompensować niedobory aktywności i jak osiągnąć wysoką translację z mRNA in vitro i in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy globalnie badać geny docelowe SINEUP w żywych komórkach, obrazując bez fiksacji i pobierania.Tak więc implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię haploniedium, ponieważ SINEUPy mogą indukować dwukrotny wzrost niedoboru białka, takiego jak frataksyna w przypadkach ataksji Friedricha. Aby rozpocząć, otwórz przeglądarkę Zenbu i kliknij bazę danych projektu Fantom, która Cię interesuje. Przeszukaj gen docelowy i sprawdź miejsce rozpoczęcia transkrypcji lub TSS oraz poziom ekspresji w pożądanych komórkach i tkankach.Aby określić TSS, zapoznaj się z przykładową analizą białka siódemki choroby Parkinsona lub mRNA PARK7. Sprawdź TSS według regionu piku klatki. Aby określić poziomy ekspresji transkrypcji specyficzne dla komórek i tkanek, wybierz region piku klatki i kliknij powiększ region genomu, aby wybrać.Sprawdź ekspresję PARK7 w interesującym typie komórki i tkanki, eksplorując listę wyrażeń transkrypcji u dołu strony. Następnie zaprojektuj sekwencje domen wiążących o kilku różnych długościach odpowiadających 40 zasadom przed i 32 zasadom za pierwszą metioniną lub AUG. Przed transfekcją za pomocą SINEUPs, komórki nasienne będące przedmiotem zainteresowania na dwóch 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-d-lizyną, zgodnie z opisem w manuskrypcie.Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o pięcioprocentowej zawartości CO2, aby osiągnąć 70-procentową konfluację. Bardzo ważne jest równomierne rozmieszczenie komórek w studzienkach, w tym celu delikatnie potrząśnij płytką 10 razy w przód iw tył po wysianiu komórek w czystej ławce i powtórz w pięcioprocentowym inkubatorze CO2. Po inkubacji zmień pożywkę na 0,4 ml świeżej pożywki.Do analizy SINEUP-GFP należy przygotować kilka probówek o pojemności 1,5 ml z 0,1 ml zmieszanego roztworu, z pEGFP-C2, SINEUP-GFP, odczynnikami do transfekcji i OptiMEM w każdej probówce, a następnie inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dodaj 0,1 ml tego zmieszanego roztworu z każdej probówki do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce i oznacz te studzienki SINEUP-GFP jeden, dwa, trzy, cztery i pięć. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym CO2 przez 24 godziny.Po 24 godzinach umyj komórki 0,5 ml PBS. Dodaj 25 μl trypsyny o zawartości 0,05 % wagowych na objętość i inkubuj w inkubatorze z pięcioprocentowym CO2 przez pięć minut. Dodaj 275 μl pożywki komórkowej na dołek.Do ekstrakcji białka weź jedną z dwóch płytek i zbierz 225 μl lub trzy czwarte komórek z jednej studzienki i 75 μl lub jedną czwartą komórek do ekstrakcji RNA, każda do oddzielnej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 6000xg przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z probówki znakowanej przez izolację białka.Dodaj 60 μl roztworu do lizy do komórek i wymieszaj pipetując Dokładnie wymieszaj, obracając z małą prędkością przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować probówkę o mocy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać supernatant białka. Aby określić stężenie białka, najpierw przygotuj od pięciu do sześciu razy rozcieńczenie wzorca białka albuminy surowicy świeżej bydlęcej w ultraczystej wodzie, o stężeniach od 0,2 do 1,5 mg / ml białka.Aby przygotować działający odczynnik A Dash mix, dodaj 20 ml odczynnika S do jednego ml odczynnika A w probówce o pojemności dwóch mililitrów. Dodaj pięć μl wody jako kontrolę ujemną. A następnie wzorzec BSA lub próbka białka w każdym dołku.Dodaj 25 μl odczynnika A Dash, a następnie ostrożnie dodaj 200 μl odczynnika B na studzienkę, unikając tworzenia się pęcherzyków. Przykryj płytkę folią aluminiową do inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć do ośmiu minut. Zmierz absorbancję białka przy 750 nm za pomocą spektrofotometru.Przygotować krzywą wzorcową, wykreślając stężenia białek wzorcowych BSA na osi x i ich odpowiednią absorbancję na osi y. Zastosuj równanie krzywej standardowej, aby obliczyć stężenie białka w próbce. Aby rozpocząć separację białek, dodaj jedną objętość 2x barwnika ładującego do każdej objętości próbki białka.Podgrzewać w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez pięć minut i natychmiast schłodzić na lodzie przez minutę. Załaduj od 10 do 20 ug próbek białka do 10 procent żelu poliakryloamidowego SDS i rozdziel przy napięciu od 100 do 150 V. Przenieść białko z żelu na membranę nitrocelulozową o grubości 0,5 mikrometra za pomocą półsuchego przyrządu do przenoszenia.Napełnij buforem transferowym pod napięciem 25 V przez 30 minut. Po przeniesieniu umieść membranę w pojemniku i dodaj roztwór blokujący, aż membrana całkowicie nasiąknie, a następnie inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 30 minut z potrząsaniem. Dodaj odpowiednie przeciwciało do roztworu blokującego i przelej przez membranę.Hybrydyzować, inkubując błonę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając. Po hybrydyzacji umyj membranę, dodając 1x bufor TBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej i powtórz jeszcze dwa razy. Wykonaj następną hybrydyzację z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym nad membraną, w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wstrząsając.Następnie umyj membranę, dodając 1x bufor TBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej i powtórz jeszcze dwa razy. Przenieść membranę do pudełka wypełnionego dwoma ml mieszaniny odczynników ECL wzmocnionych HRP. Przykryj pudełko folią aluminiową i inkubuj przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie wyjmij membranę z mieszaniny odczynników ECL i naświetl ją za pomocą przyrządu do obrazowania luminescencyjnego. Aby przeanalizować wpływ SINEUP-GFP na komórki za pomocą obrazowania, umyj komórki transektowane pEGFP-C2 i SINEUP-GFP z drugiej 24-dołkowej płytki 0,5 ml PBS na dołek. Aby zabarwić jądro, dodaj 2ug Hoechst-33342 do każdej studzienki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.Użyj wysokoprzepustowego cytometru obrazowego mikrostudzienki, aby zmierzyć komórki barwione metodą Hoechst, aby policzyć całkowitą liczbę komórek. Zmierz intensywność zielonej fluorescencji, aby policzyć liczbę komórek GFP dodatnich. Aby przeanalizować, efekt regulacji białka w górę SINEUPs, użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić zintegrowaną intensywność GFP Oblicz ją jako sumę wszystkich intensywności pikseli wyświetlających sygnały w segmentowanych obiektach uzyskanych dla każdego kanału.Po udanej transfekcji za pomocą SINEUP-GFP, syntetycznego SINEUP zawierającego zarówno optymalną domenę wiążącą, jak i domenę efektorową GFP, translacja mRNA została zwiększona bez zmiany ekspresji mRNA GFP. Protokół półautomatycznej analizy obrazu skrócił czas wykrywania i zwiększył liczbę próbek poddawanych jednocześnie badaniom przesiewowym w porównaniu z konwencjonalną analizą Western blot. Chociaż stwierdzono różnicę w intensywności sygnału, od 2,6-krotności w analizie Western blot do 1,4-krotności w analizie obrazowej, wykryto znacznie wyższe poziomy fluorescencji GFP w porównaniu z kontrolą.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zidentyfikowaniu prawidłowej sekwencji docelowych mRNA, aby zaprojektować prawidłową domenę wiążącą. Geny są często transkrybowane od promotorów i mogą wykorzystywać różne miejsca inicjacji translacji. Przeglądarka Zenbu jest bardzo przydatnym narzędziem do badania takiej wariancji mRNA.Sugerujemy również zaprojektowanie różnych SINEUPów ze zmiennymi miejscami wiązania. Ogólnie rzecz biorąc, uważamy, że szybkie dostosowanie SINEUP do wielu celów stworzy nową dziedzinę polegającą na pozytywnie regulowanej translacji istniejących RNA, która jest odwrotnością i komplementarnością pola siRNA. Przewidujemy, że w ramach tych funkcji technologia ta będzie miała zasadnicze znaczenie dla produkcji większych ilości białek in vitro, takich jak bioreaktory, a także in vivo w celu naturalnej korekty dawki genów.

cell-based-assays-sineup-non-coding-rnas-that-can-specifically

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę esiRNA w badaniu wysokoprzepustowym w celu identyfikacji genów zaangażowanych w podział komórki. Przedstawiamy sposób przygotowania i przeprowadzenia przesiewu esiRNA, a także metodę analizy i walidacji uzyskanych wyników.

MISSION esiRNA do przesiewania RNAi w komórkach ssaków

Ten film demonstruje test in vivo na bakteriach w celu zbadania interakcji białek wiążących RNA (RBP) z RNA. Komórki bakteryjne są przekształcane za pomocą dwóch konstruktów plazmidowych - plazmidu miejsca wiązania kodującego mRNA zawierającego fluorescencyjny gen reporterowy za miejscem wiązania RBP - podczas gdy plazmid RBP ulega ekspresji białek RBP pod kontrolą induktora. Po wzroście produkcji RBP za pośrednictwem induktora, RBP wiążą się z mRNA, powodując translacyjną represję reportera...

Test represji genu reporterowego w celu zbadania regulacji translacyjnej genu docelowego

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Prezentujemy protokół do badania regulacji translacji mRNA w komórkach zakażonych wirusem poxvirus za pomocą testu reporterowego in vitro transkrybowanego RNA lucyferazy. Test może być stosowany do badania regulacji translacji przez cis elementy mRNA, w tym region 5'-nieulegający translacji (UTR) i 3'-UTR. Za pomocą tej metody można również badać różne tryby inicjacji tłumaczenia.

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Poznaj metody testowania SINEUP w liniach komórkowych w celu zwiększenia translacji mRNA. Technika ta umożliwia globalny screening genów docelowych i ma zastosowanie w terapii chorób z niedoborem białek.

Testy komórkowe niekodujących RNA SINEUP, które mogą specyficznie poprawić translację mRNA

Przeglądaj więcej filmów