Name: Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę tablicy szachownicy wspomaganą drukarką atramentową do testowania synergii przeciwdrobnoustrojowej oraz klasyczną metodę zabijania czasu. Technika ta umożliwia szybkie przesiewanie kombinacji leków przeciwko bakteriom opornym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Thea Brennan-Krohn była wspierana przez grant szkoleniowy Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development w zakresie pediatrycznych chorób zakaźnych (T32HD055148), grant szkoleniowy National Institute of Allergy and Infectious Diseases (T32AI007061), stypendium Biura Rozwoju Wydziału Faculty Leadership Fellowship oraz nagrodę Rozwoju Kariery Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (1K08AI132716). J.E.K. był wspierany przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody o numerze R33 AI119114. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae%3A+Biology%2C+epidemiology%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).</li>
<li>Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">The future of antibiotics.</a> Critical Care. 18 (3), (2014).</li>
<li>Spellberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemic+of+antibiotic-resistant+infections%3A+a+call+to+action+for+the+medical+community+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+infectious+diseases+an+official+publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).</li>
<li>Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+antibiotic+synergy+for+polymyxin+B-resistant+carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).</li>
<li>Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+dual+carbapenem+combinations+against+carbapenemase-producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+antagonism%2C+and+what+the+chequerboard+puts+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).</li>
<li>Zusman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+and+meta-analysis+of+in+vitro+synergy+of+polymyxins+and+carbapenems%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).</li>
<li>Clock, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+doripenem+alone+and+in+multi-agent+combinations+against+extensively+drug-resistant+Acinetobacter+baumannii+and+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).</li>
<li>Hirsch, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antimicrobial+combinations+for+Klebsiella+pneumoniae+carbapenemase-producing+K.+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).</li>
<li>Tängdén, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+double-+and+triple-antibiotic+combinations+for+VIM-+and+NDM-producing+klebsiella+pneumoniae+by+in+vitro+time-kill+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).</li>
<li>Tascini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activity+of+colistin+plus+rifampin+against+colistin-resistant+kpc-producing+klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).</li>
<li>Paul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+for+carbapenem-resistant+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).</li>
<li>Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+for+treating+carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).</li>
<li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verification+of+an+automated%2C+digital+dispensing+platform+for+at-will+broth+microdilution-based+antimicrobial+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).</li>
<li>Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+Synergistic+Activity+of+Antimicrobial+Combinations+Against+Carbapenem-Resistant+Enterobacteriaceae+Using+Inkjet+Printer-Based+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology.</a> J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).</li>
<li>Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Activity+of+Colistin-Containing+Combinations+against+Colistin-Resistant+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li>
<li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colistin%3A+The+Revival+of+Polymyxins+for+the+Management+of+Multidrug-Resistant+Gram-Negative+Bacterial+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).</li>
<li>Nation, R. L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colistin+in+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Colistin in the 21st century.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).</li>
<li>Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colistin+resistance+in+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).</li>
<li>Bratu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae+in+Brooklyn%2C+NY%3A+Molecular+epidemiology+and+in+vitro+activity+of+polymyxin+B+and+other+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).</li>
<li>Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+polymyxin+B+plus+imipenem%2C+meropenem%2C+or+tigecycline+against+KPC-2-producing+Enterobacteriaceae+with+high+MICs+for+these+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).</li>
<li>MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+methodology+and+implementation+of+a+semiautomated+serial+dilution+microtechnique+for+antimicrobial+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing.</a> Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).</li>
<li>Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poisoned+well%3A+Enhancing+the+predictive+value+of+antimicrobial+susceptibility+testing+in+the+era+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).</li>
<li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+does+2+plus+2+equal+5%3F+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Performance+Standards+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing.+28th+ed.+CLSI+supplement+M100%22">Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Dilution+Antimicrobial+Susceptibility+Tests+for+Bacteria+That+Grow+Aerobically%3B+Approved+Standard+-+Tenth+Edition.+CLSI+document+M07-A10%22">Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10</a>. , (2015).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22M07%3A+Methods+for+Dilution+Antimicrobial+Susceptibility+Tests+for+Bacteria+That+Grow+Aerobically%2C+11th+Edition%22">M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+determining+bactericidal+activity+of+antimicrobial+agents%3B+approved+guideline+M26-A%22">Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A</a>. 19 (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7(1999).</li>
<li>Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+drop+plate+technique+for+bacterial+enumeration+by+parametric+and+nonparametric+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+research+forum%22%5BJournal%5D)">Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests.</a> Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+6x6+drop+plate+method+for+simultaneous+colony+counting+and+MPN+enumeration+of+Campylobacter+jejuni%2C+Listeria+monocytogenes%2C+and+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli.</a> Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).</li>
<li>Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Inoculum+and+Activity+in+AmpC-+and+Extended-Spectrum+%28ESBL%29-Producing+Escherichia+coli+and+Klebsiella+pneumoniae+Clinical+Isolates+Tested+by+Using+NCCLS+ESBL+Methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).</li>
<li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inoculum+Effect+in+the+Era+of+Multidrug+Resistance%3A+Minor+Differences+in+Inoculum+Have+Dramatic+Effect+on+Minimal+Inhibitory+Concentration+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li>
<li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+Testing%3A+Broth+Microdilution+Checkerboard+and+Broth+Macrodilution+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Procedures+Handbook%2C+Fourth+Edition%22%5BJournal%5D)">Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.16.1-5.16.23 (2016).</li>
<li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Kill+Assay+for+Determining+Synergy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Procedures+Handbook%2C+Fourth+Edition%22%5BJournal%5D)">Time-Kill Assay for Determining Synergy.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).</li>
<li>Hindler, J. A., Humphries, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colistin+MIC+variability+by+method+for+contemporary+clinical+isolates+of+multidrug-resistant+gram-negative+bacilli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).</li>
<li>Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+add+or+not+to+add+Polysorbate+80%3A+Impact+on+colistin+MICs+for+clinical+strains+of+Enterobacteriaceae+and+Pseudomonas+aeruginosa+and+quality+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810(2014).</li>
<li>Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+testing+quality+control+studies+with+fosfomycin+tromethamine%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+microbiology+%26+infectious+diseases+official+publication+of+the+European+Society+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine.</a> European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).</li>
<li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+Bactericidal+Concentration+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Procedures+Handbook%2C+Fourth+Edition.+5.14.1.11%22%5BJournal%5D)">Minimum Bactericidal Concentration Testing.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , 5.14.1.11 (2016).</li>
<li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+polymyxin+B+in+combination+with+various+antibiotics+against+extensively+drug-resistant+Enterobacter+cloacae+with+decreased+susceptibility+to+polymyxin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).</li>
<li>Bulman, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymyxin+combinations+combat+Escherichia+coli+harboring+mcr-1+and+blaNDM-5%3A+Preparation+for+a+postantibiotic+Era%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era.</a> mBio. 8 (4), (2017).</li>
</ol>

Dozownik cyfrowy D300 i związane z nim materiały eksploatacyjne zostały dostarczone przez firmę Tecan (Morrisville, Karolina Północna). Tecan nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu/interpretacji danych, przygotowywaniu manuskryptu ani podejmowaniu decyzji o publikacji.

Obie opisane tutaj metody dostarczają informacji na temat aktywności środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w połączeniu w porównaniu z ich indywidualną aktywnością. Zautomatyzowana, wspomagana drukarką atramentową metoda dozowania cyfrowego jest adaptacją metody opisanej w Podręczniku procedur mikrobiologii klinicznej33, podczas gdy metoda zabijania czasu jest bardziej zbliżona do odpowiedniego protokołu z tego samego odniesienia34.
W metodzie szachownicy obliczenia mające na celu określenie niezbędnej objętości materiału przeciwdrobnoustrojowego do dodania do każdej studzienki, a także dozowanie tych objętości są zautomatyzowane, eliminując w ten sposób niektóre z głównych potencjalnych źródeł błędów napotkanych w ręcznym układzie szachownicy. Nadal jednak ważne jest, aby badacz ustalił, czy pierwotne zapasy są wytwarzane przy zamierzonym stężeniu i czy docelowe stężenia końcowe są prawidłowo wprowadzane do oprogramowania D300. Dodawanie zawiesiny przeciwdrobnoustrojowej do studzienek w płytce 384-dołkowej może być na początku trudne i wymaga ostrożności, aby końcówki pipet dostały się do odpowiednich studzienek i aby ciecz nie rozpryskiwała się po krawędziach studzienek. Zautomatyzowana maszyna do obsługi cieczy może być używana zamiast ręcznej pipety wielokanałowej, aby zwiększyć szybkość i dokładność, z jaką zawiesina bakteryjna jest dodawana do studzienek. Jak opisano w protokole, D300 wymaga dodania środka powierzchniowo czynnego, polisorbatu 20 (P-20), w celu prawidłowego obchodzenia się z cieczą. Zauważono, że inny środek powierzchniowo czynny, polisorbat 80, w stężeniu 0,002%, obniża wartości MIC kolistyny dla organizmów z MIC kolistyny wynoszącymi <2 μg/ml w standardowych testach mikrorozcieńczenia bulionu. 35,36 Nasze laboratorium wykazało wcześniej, że P-20 w stężeniach do 0,0015% nie miał wpływu na wyniki MIC wspomagane D300 w porównaniu z referencyjnym BMD14. W przedstawionym tutaj przykładzie testu maksymalne stężenie P-20 wynosi 0,0014%.
Jednym z problemów, które napotkaliśmy przy niektórych testach w szachownicę, była duża liczba pominiętych studzienek. Zdarzało się to w nieproporcjonalnie częstym przypadku niektórych antybiotyków. W szczególności, w badaniu przesiewowym kombinacji przeciwko kolekcji opornych na karbapenemy Enterobacteriaceae, stwierdziliśmy, że podczas gdy 49 z 521 badań (9,4%) było bezużytecznych z powodu wielu pominiętych studzienek, 2 z 12 testowanych antybiotyków (fosfomycyna i cefepim) stanowiły 46 z tych badań (94%). Takie zwiększone wskaźniki mogą być bardziej prawdopodobne w przypadku leków, które są szczególnie podatne na efekt inokulum 31,32,37. Warto zauważyć, że CLSI nie zaleca testowania fosfomycyny w rozcieńczeniu bulionu25 ze względu na obawy o wiarygodność wyników tą metodą, co może wyjaśniać niewiarygodne wyniki obserwowane w przypadku tego leku. Niektóre modyfikacje mogą być wprowadzone do automatycznej metody szachownicy zgodnie z preferencjami badacza. Środki przeciwdrobnoustrojowe mogą być dozowane do płytek już zawierających zawiesinę bakteryjną, a nie do pustych studzienek, jeśli jest to preferowane ze względu na przebieg pracy w laboratorium. Podczas gdy zastosowano tutaj płytki 384-dołkowe, metoda może być również przeprowadzana w testach płytkowych 96-dołkowych z odpowiednią modyfikacją objętości dołka. Zastosowanie formatu płytki 96-dołkowej może pomóc w zmniejszeniu liczby pominiętych dołków w przypadku antybiotyków, które są szczególnie wrażliwe na niewielkie zmiany w inokulum. Przy obliczaniu FICI mogą wystąpić sytuacje, w których wartość MIC jest poza skalą (tj. wyższa niż badana), w tym sytuacje, w których badany lek nie wykazuje indywidualnej aktywności w stosunku do badanego typu organizmu. W takich przypadkach FIC można obliczyć na podstawie założenia, że wartość MIC jest o jedno rozcieńczenie wyższa niż najwyższe badane stężenie. Jest to najbardziej konserwatywna strategia, ponieważ zakłada maksymalną możliwą wartość FIC dla każdego rozcieńczenia, w którym zaobserwowano zahamowanie podczas badania synergii. Na przykład, jeśli rzeczywisty MIC byłby zamiast tego dwoma podwojeniami rozcieńczeń powyżej najwyższego badanego stężenia, to odpowiadające im FIC byłyby dwa razy niższe niż konserwatywne przypisania i tak dalej.
Aby dokładnie ocenić działanie bakteriobójcze leków w teście zabijania w czasie, konieczne jest, aby hodowle znajdowały się we wzroście w fazie logarytmicznej, szczególnie gdy testowane są aktywne antybiotyki w ścianie komórkowej28. W przypadku szybko rosnących bakterii użytych w tym przykładzie (K. pneumoniae) 3 godziny inkubacji z wytrząsaniem były odpowiednie, aby osiągnąć tę fazę wzrostu, ale dla różnych organizmów może być konieczne różne czasy. Ogólnie rzecz biorąc, kultura powinna być widocznie, ale nie mocno mętna. Odpowiednią ilość czasu można określić, konstruując krzywą wzrostu z liczbą kolonii pobieraną w kolejnych punktach czasowych (np. co 30 minut przez 4-6 godzin)38. Ważne jest również zamierzone inokulum wyjściowe w badaniu zabijającym czas. Docelowe stężenie inokulum wyjściowego wynosi około 5 x 105 do 1 x 106 jtk/ml. Opisane tutaj rozcieńczenie (100 μl zawiesiny 1,0 McFarlanda w 10 ml pożywki) generuje to inokulum dla Klebsiella pneumoniae i innych gatunków Enterobacteriaceae , na których je testowaliśmy. Jeśli gęstość wyjściowej inokuli w eksperymencie z użyciem różnych organizmów jest znacznie wyższa lub niższa, może być potrzebne inne rozcieńczenie. (Odpowiednie rozcieńczenie wymagane dla danego gatunku można określić, wykonując liczenie na płytce 0,5 lub 1,0 zawiesiny McFarlanda w celu określenia, ile organizmów reprezentuje to zmętnienie, a następnie obliczając ilość, o jaką początkowa zawiesina musi zostać rozcieńczona, aby osiągnąć odpowiednie stężenie końcowe). Jeżeli, po przeglądzie liczby bakterii z badania synergii, okaże się, że inokulum wyjściowe którejkolwiek z probówek zawierających antybiotyk było znacznie niższe niż inokulum wyjściowe grupy kontrolnej wzrostu, może to wskazywać albo na przeniesienie antybiotyku, albo na bardzo szybkie zabicie bakterii w krótkim czasie między dodaniem bakterii do probówki zawierającej antybiotyk a usunięciem podwielokrotności do posiewu. Jeśli rzeczywista liczba kolonii w nierozcieńczonym spadku w serii jest mniejsza niż liczba kolonii w kolejnych rozcieńczeniach, sugeruje to efekt przeniesienia antybiotyku. Opisano różne opcje zapobiegania temu efektowi, w tym rozprowadzenie pojedynczej podwielokrotności na całej płytce38 lub odwirowanie próbki, usunięcie supernatantu i ponowne zawieszenie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przed posiewem39. W każdym punkcie czasowym metody zabijania czasu ważne jest również, aby badacz skutecznie, ale dokładnie usunął podwielokrotność z każdej probówki hodowlanej i przeprowadził seryjne rozcieńczenia. Opóźnienia podczas tego procesu, szczególnie we wczesnych punktach czasowych, które występują w krótkich odstępach czasu, mogą prowadzić do długich okresów, podczas których kultury nie są inkubowane i wstrząsane, podczas gdy nieostrożne dozowanie i seryjne rozcieńczanie mogą prowadzić do niedokładnego liczenia płytek. W porównaniu z metodą liczenia płytek rozprowadzających, w której 100 μl każdego rozcieńczenia rozprowadza się na całej płytce agarowej, opisana metoda płytek wkroplowych jest znacznie szybsza, wymaga znacznie mniejszej liczby płytek agarowych i pozwala na szybsze liczenie, ponieważ maksymalna policzalna liczba kolonii dla każdej kropli wynosi 30, podczas gdy z płytki rozsiewającej można zwykle policzyć do 300 kolonii. Jednak metoda płytki rozsiewającej jest również opcją, jeśli badacze czują się bardziej komfortowo z tą techniką. Jeśli krople rozlają się na siebie po rezygnacji z pipety wielokanałowej, można zamiast tego wykonać indywidualne nałożenie bardziej rozstawionych kropli za pomocą pipety jednokanałowej. Z naszego doświadczenia wynika, że płyty chłodzące w temperaturze 4 °C przed dozowaniem kropli wydawały się zmniejszać nadmierne rozprowadzanie.
Jednym z ograniczeń opisanych tutaj technik jest to, że wyniki dwóch typów testów synergii (szachownica i zabijanie czasu) nie zawsze są zgodne, a ponieważ większość opublikowanych artykułów dotyczących synergii wykorzystuje jedną lub drugą metodę, a nie obie razem, może być trudno wiedzieć, jak zintegrować dane z tych dwóch typów testów. Ponieważ opracowana przez nas zautomatyzowana metoda szachownicy jest prosta i wysokoprzepustowa, wykorzystaliśmy ją jako rodzaj ekranu do testowania kombinacji w stosunku do większej liczby izolatów i określenia, które kombinacje stężeń są synergiczne. Następnie przeprowadziliśmy mniejszą liczbę badań zabijających czas, wybierając kombinacje i stężenia, które były skuteczne w układzie szachownicy. Warto zauważyć, że ponieważ test szachownicy jest zwykle wykonywany na skali rozcieńczania mikrobulionu, podczas gdy test zabijania w czasie wykorzystuje większe objętości (podobnie jak rozcieńczanie makrobulionu), stwierdziliśmy, że FIC czasami różniły się między tymi dwiema metodami, przy czym wyższe stężenia są zwykle wymagane w teście zabijania w czasie, aby wykazać aktywność. Zjawisko to zostało zaobserwowane wcześniej, gdy porównano wyniki testu MIC rozcieńczania makrobulionu i mikrobulionu dla pałeczek Gram-ujemnych26 i gdy większe inokulum (stosowane w badaniach zabijania w czasie) porównano ze standardowym inokulum stosowanym w rozcieńczaniu mikrobulionu i testach szachownicy32. Szczególnym ograniczeniem szachownicy jest nieodłączna zmienność w badaniu MIC rozcieńczenia mikrobulionu22. Podczas gdy odcięcia FICI dla synergii matematycznie odpowiadają za tę zmienność6 , taka zmienność nieuchronnie budzi obawy o niezawodność i spójność wyników tablicy szachownicowej.
Ze względu na ograniczenia nieodłącznie związane ze wszystkimi metodami badań synergii in vitro (w tym hodowla bakterii w sztucznej pożywce wzrostowej, statyczne stężenia antybiotyków i ograniczony przebieg w czasie), wyniki uzyskane tymi metodami muszą zostać potwierdzone i poddane dalszej ocenie przy użyciu technik uzupełniających. Metody te obejmują badania farmakokinetyczne/farmakodynamiczne (PK/PD) in vitro (np. model zakażenia pustymi włóknami40), modele zwierzęce i ostatecznie badania farmakokinetyki/PD u ludzi i ich skuteczności. Opisana tutaj zautomatyzowana metoda szyku szachownicy, dostarczając szybką metodę przesiewania kombinacji pod kątem potencjalnej synergicznej aktywności, pozwala na bardziej ukierunkowane wykorzystanie tych technik. Dalsza automatyzacja wszystkich tych metod, a także bardziej systematyczne badanie związku między parametrami in vitro a wynikami klinicznymi, będą miały istotne znaczenie dla zwiększenia skali wykorzystania testów synergicznych i zwiększenia ich zastosowania klinicznego.

Rozprzestrzenianie się patogenów bakteryjnych opornych na wiele leków (MDR), szczególnie bakterii Gram-ujemnych MDR, takich jak oporne na karbapenemy Enterobacteriaceae (CRE), pozostawiło klinicystom coraz bardziej ograniczone możliwości skutecznej terapii przeciwinfekcyjnej1, problem zaostrzony przez powolne tempo odkrywania nowych leków przeciwbakteryjnych2,3. Synergia przeciwdrobnoustrojowa, w której dwa leki stosowane w połączeniu wywierają efekt większy niż addytywny, daje możliwość uratowania istniejących antybiotyków do stosowania w leczeniu bakterii MDR, nawet jeśli bakterie te są oporne na jeden lub oba antybiotyki indywidualnie. Techniki opisane w tym artykule zapewniają dwie uzupełniające się metody testowania synergii in vitro, które, gdy są stosowane razem, pozwalają badaczom na skuteczne badanie przesiewowe interesujących kombinacji środków przeciwdrobnoustrojowych pod kątem dowodów na synergiczne działanie (metoda zautomatyzowanej szachownicy), a następnie na dalszą ocenę kinetyki hamowania i zabijania wykazanej przez obiecujące kombinacje zidentyfikowane na etapie badań przesiewowych (ręczna metoda zabijania w czasie).
Jedną z najczęściej stosowanych metod testowania synergii in vitro jest test szachownicy, modyfikacja testu minimalnego stężenia hamującego (MIC), w którym aktywność hamująca dwóch różnych antybiotyków przeciwko izolatowi bakteryjnemu jest testowana w zakresie kombinacji stężeń4,5. Jeśli oba leki wywierają większą aktywność niż addytywna, gdy są stosowane razem, połączenie jest uważane za synergiczne6. Jednak ręczne skonfigurowanie tablicy szachownicy wiąże się z szeregiem obliczeń oraz etapów rozcieńczania i pipetowania, które są pracochłonne i podatne na błędy ludzkie. Ograniczenia te spowodowały ograniczenie stosowania testów synergicznych przede wszystkim do retrospektywnej oceny niewielkiej liczby kombinacji antybiotyków i izolatów bakteryjnych, a wyniki nie zawsze były spójne między badaniami7,8,9,10,11. Co więcej, złożoność testów synergicznych przyczyniła się do ich niedostępności w klinicznym laboratorium mikrobiologicznym oraz do faktycznego braku danych z badań synergii in vitro z badań klinicznych terapii skojarzonej12,13.
Aby zwiększyć wydajność i przepustowość metody szachownicy, skorzystaliśmy z techniki automatycznego testowania MIC, wcześniej opracowanej w naszym laboratorium, która wykorzystuje technologię druku atramentowego do precyzyjnego i konsekwentnego dozowania małych objętości roztworu podstawowego antybiotyku do studzienek na płytce do mikromiareczkowania14. Platforma eliminuje konieczność wykonywania skomplikowanych obliczeń i wykonywania wielu etapów pipetowania. Powiązane oprogramowanie oblicza i dozuje odpowiednie ilości antybiotyków, aby stworzyć dwuwymiarową szachownicę, jeśli użytkownik po prostu wprowadzi żądany zakres stężeń i stężenie roztworu podstawowego antybiotyków. Początkowo przetestowaliśmy tę metodę na kolekcji izolatów CRE15, a następnie skupiliśmy się na testowaniu kombinacji zawierających kolistynę pod kątem aktywności przeciwko izolatom opornym na kolistynę16. Kolistyna jest lekiem ostatniej szansy, zwykle zarezerwowanym do stosowania w leczeniu patogenów Gram-ujemnych MDR17,18, a oporność na kolistynę sprawia, że bakterie MDR są już prawie odporne na pan19, co czyni je idealnymi kandydatami do opracowania nowych strategii terapeutycznych przy użyciu leków, na które są indywidualnie niewrażliwe. Odkryliśmy, że połączenie kolistyny i inhibitora syntezy białek, antybiotyku minocykliny, miało bardzo wysoki wskaźnik synergii, nawet przeciwko szczepom, które były oporne na każdy z tych leków z osobna, prawdopodobnie dlatego, że kolistyna wywiera subhamujący efekt przepuszczalności nawet na bakterie oporne na kolistynę. Wybraliśmy tę kombinację, aby użyć jej jako przykładu w tym artykule. Warto zauważyć, że testy synergiczne mogą być również wykorzystywane do oceny zwiększonej skuteczności dwóch leków, które są skuteczne indywidualnie.
Zautomatyzowana metoda szyku szachownicy umożliwia szybkie i wysokoprzepustowe testowanie synergii. Jednak metoda tablicy szachownicy ma ograniczenia. Jako zmodyfikowany test MIC dostarcza danych tylko na temat hamowania wzrostu bakterii, a nie na temat zabijania, i nie dostarcza danych na temat działania antybiotyków w czasie. Z kolei ręczne wykonywanie testów synergii zabijania czasu jest bardziej pracochłonne, ale dostarcza informacji zarówno na temat hamowania, jak i zabijania w ciągu 24 godzin kursu czasowego20,21. Zastosowaliśmy analizę zabijania czasu na mniejszej liczbie izolatów, aby potwierdzić nasze wyniki w szachownicę i określić, czy zidentyfikowane przez nas synergiczne kombinacje były również bakteriobójcze.
Zarówno metody synergii szachownicy, jak i time-kill dostarczają cennych informacji na temat aktywności kombinacji leków i są szczególnie przydatne w ocenie potencjalnych nowych opcji terapeutycznych dla wysoce odpornych patogenów bakteryjnych. Metody te mają również nieodłączne ograniczenia. Standardowa metoda MIC rozcieńczania mikrobulionu ma znany oczekiwany zakres błędu wynoszący 1 dwukrotne rozcieńczenie22, który zwiększa się, gdy dwa leki są testowane razem w układzie szachownicy. Standardowa definicja synergii, która uznaje połączenie za synergiczne tylko wtedy, gdy leki są aktywne razem na poziomie jednej czwartej swoich odpowiednich wartości MICs6, uwzględnia tę oczekiwaną zmienność, ale taką zmienność (która jest uważana za wynikającą z połączenia fluktuacji biologicznych i technicznych23) nieuchronnie prowadzi do niepewności co do wiarygodności wyników synergii. Obecnym ograniczeniem jest również brak ustalonych standardów kontroli jakości dla testów synergii. Być może najbardziej znaczącym ograniczeniem wszystkich metod testowania synergii jest brak ustalonych korelacji między wynikami in vitro a wynikami klinicznymi, gdy w leczeniu pacjentów stosuje się kombinacje24. Prostsze i szybsze metody testowania synergii, takie jak opisana tutaj zautomatyzowana metoda szachownicy, mogą ułatwić integrację testów synergii in vitro z badaniami klinicznymi lub innymi ocenami wyników pacjentów w celu lepszego scharakteryzowania związku między efektami in vitro i in vivo w przyszłości.
Zautomatyzowana metoda szachownicy, którą tutaj prezentujemy, oferuje opcję wysokoprzepustowego przesiewania różnych kombinacji i pozwala na szybką ocenę nietypowych kombinacji "wysokiego ryzyka i wysokiej nagrody" bez większego inwestowania czasu i zasobów. Metoda zabijania czasu, którą następnie demonstrujemy, może dostarczyć dodatkowych informacji na temat synergicznego działania kombinacji i może pomóc w scharakteryzowaniu jej działania bakteriobójczego i kinetyki przeciwbakteryjnej.

<table><tbody><tr><td>Escherichia coli szczep ATCC 25922</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td>QC szczep</td></tr><tr><td>0,5 ml mikroprobówki wirówkowe</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>1 L 0,22 i mikro; m filtr butelkowy</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>597-4520</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm probówki hodowlane z okrągłym dnem ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisherbrand</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Phenix</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>15 x 100 mm lub 15 x 150 mm Płytki agarowe Mueller Hinton</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01620 lub R04050</td><td></td></tr><tr><td>Zamknięcia ze stali nierdzewnej 25 mm do kultury szkła 25 x 150 mm probówki</td><td>Bellco</td><td>2005-02512</td><td></td></tr><tr><td>25 x 150 mm probówki hodowlane z okrągłym dnem ze szkła borokrzemianowego</td><td>Bellco</td><td>2011-25150</td><td></td></tr><tr><td>348-dołkowe sterylne przezroczyste, płaskodenne, nieobrobione mikropłytki z pokrywkami</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781186</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Phenix</td><td>SS-PH50</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylne zbiorniki na odczynniki</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka polipropylenowa z 2 ml dołkami</td><td>Fisherbrand</td><td>12-566-612</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe sterylne, przezroczyste, okrągłodenne, nieobrobione mikropłytki z pokrywkami</td><td>Evergreen</td><td>222-8032-01R</td><td></td></tr><tr><td>Regulowany kationowo bulion Mueller Hinton</td><td>BD Diagnostyka</td><td>212322</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kolistyny</td><td>Oprogramowanie sterujące Alfa Aesar</td><td>J60915</td><td></td></tr><tr><td>D300e</td><td>HP/Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DensiCHEK Plus McFarland czytnik</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>21250</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz kalkulacyjny Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra long SHARP 10 i micro; L Precyzyjne końcówki barierowe</td><td>Denville Scientific</td><td>P1096-FR</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik cyfrowy HP D300</td><td>HP/Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kasety HP D300 T8+</td><td>HP/Tecan</td><td>30097370</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek minocykliny</td><td>Chem-Impex</td><td>14302</td><td></td></tr><tr><td>Picus 12-kanałowy 10-300 i mikro; Pipeta L</td><td>Sartorius</td><td>735461</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP-337</td><td>Nazwa handlowa: Tween 20</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Xplorer 12-kanałowy 50-1200 &micro; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000328</td><td></td></tr></tbody></table>

testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

Ponieważ wskaźniki patogenów wielolekoopornych (MDR) wciąż rosną, wyprzedzając rozwój nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, coraz częściej konieczne stają się nowatorskie podejścia do leczenia bakterii MDR. Jednym z takich podejść jest terapia skojarzona, w której dwa lub więcej antybiotyków stosuje się razem w leczeniu infekcji, przeciwko której jeden lub oba leki mogą być nieskuteczne samodzielnie. Kiedy dwa leki w połączeniu wywierają efekt większy niż addytywny, uważa się je za synergiczne. Badanie działania synergistycznego in vitro jest ważnym pierwszym krokiem w ocenie możliwej skuteczności kombinacji leków. Opracowano dwie główne metody testowania synergii in vitro: szachownicę i badanie zabijania czasu. W tym artykule przedstawiamy zautomatyzowaną metodę szachownicy, która wykorzystuje technologię druku atramentowego w celu zwiększenia wydajności i dokładności tej techniki, a także standardową metodę synergii ręcznego zabijania czasu. Zautomatyzowana tablica szachownicy może służyć jako wysokoprzepustowy test przesiewowy, podczas gdy ręczne badanie zabijania czasu dostarcza dodatkowych, uzupełniających danych na temat synergistycznego działania i zabijania.
Tablica szachownicy jest modyfikacją standardowych testów minimalnego stężenia hamującego (MIC), w których bakterie są inkubowane z antybiotykami w różnych kombinacjach stężeń i oceniane pod kątem zahamowania wzrostu po całonocnej inkubacji. Ręczne wykonanie tablicy szachownicy wymaga pracochłonnej i podatnej na błędy serii obliczeń i rozcieńczeń. W przedstawionej tutaj metodzie zautomatyzowanej obliczanie i dozowanie wymaganych objętości roztworu podstawowego antybiotyku jest zautomatyzowane dzięki zastosowaniu technologii drukarki atramentowej. W teście synergii zabijania w czasie bakterie są inkubowane z antybiotykami będącymi przedmiotem zainteresowania, zarówno razem, jak i pojedynczo, a następnie pobierane są próbki w odstępach czasu w ciągu 24 godzin w celu hodowli ilościowej. Wyniki mogą określić, czy kombinacja jest synergistyczna i czy jest bakteriobójcza, a także dostarczyć danych na temat hamowania i zabijania bakterii w czasie.

Rysunek 1A przedstawia siatkę z eksperymentu synergii metodą szachownicy, w którym minocyklina w stężeniach 0-32 μg/mL była łączona z kolistyną w stężeniach 0-16 μg/mL i testowana przeciwko szczepowi E. coli FDA-CDC 0494. Wartości reprezentują odczyty spektrofotometryczne przy gęstości optycznej 600 nm (OD600). Dołki z wartościami OD600 poniżej 0,07 (co odpowiada brakowi wzrostu w ocenie wizualnej) są zaznaczone na czerwono, natomiast dołki z wartościami OD600 od 0,07 (co odpowiada wzrostowi w ocenie wizualnej) są zaznaczone na zielono. Dla każdego leku minimalne stężenie hamujące (MIC; pogrubione) to najniższe stężenie leku, które hamuje wzrost bakterii. Dla minocykliny wynosi ono 32 μg/mL, a dla kolistyny 8 μg/mL. Kolorowanie jest zachowane na Rysunku 1B, ale wartości w dołkach, w których wzrost jest zahamowany, zostały zastąpione wartościami indeksu frakcyjnego stężenia hamującego (FICI). Są one wyznaczane w następujący sposób: w każdym dołku indeks frakcyjnego stężenia hamującego (FIC) każdego leku oblicza się poprzez podzielenie stężenia antybiotyku w tym dołku przez MIC danego leku, a FICI oblicza się poprzez zsumowanie obu wartości FIC. Dołki z wartością FICI wynoszącą 0,5, co uznaje się za próg synergii, są oznaczone przerywaną obramowaniem, a dołek z najniższą wartością FICI (0,094) został pogrubiony. Ponieważ minimalna wartość FICI mieści się w zakresie synergistycznym, kombinację uznaje się za synergistyczną.
Rysunek 2A oraz Rysunek 2B przedstawiają siatki analogiczne do tych na Rysunku 1A i Rysunku 1B, jednak w tym przypadku kombinacja nie wykazuje synergizmu przeciwko badanemu izolatowi (K. pneumoniae izolat BIDMC 4), ponieważ minimalny FICI, przy którym następuje zahamowanie wzrostu, wynosi 1, co jest wartością &gt;0,5.
Rysunek 3 przedstawia odczyty gęstości optycznej z siatki synergizmu typu checkerboard, w której wystąpiło kilka pominiętych dołków (Enterobacter cloacae complex, izolat BIDMC 27). Pominięte dołki to takie, w których wzrost bakterii został zahamowany pomimo wystąpienia wzrostu bakterii w sąsiednich dołkach z wyższymi stężeniami antybiotyku. Zjawisko to, znane również z rutynowych oznaczeń MIC, wynika prawdopodobnie ze zmienności biologicznej charakterystyk wzrostu bakterii między poszczególnymi dołkami oraz z wrażliwości niektórych antybiotyków na niewielkie różnice w ilości inokulum bakteryjnego23,31,32. W przypadku wystąpienia więcej niż jednego pominiętego dołka w układzie checkerboard, wyniki odrzucaliśmy i powtarzaliśmy badanie.
Rysunek 4 przedstawia przykłady wyników synergii w testach czasu zabijania (time-kill) dla trzech kombinacji przetestowanych przeciwko izolatowi K. pneumoniae BIDMC 32. Liczbę kolonii przedstawiono w skali logarytmicznej na osi y, a czas w godzinach na osi x. Różnica między początkowym inokulum w probówce zawierającej kombinację leków a stężeniem bakterii w tej probówce po 24 h jest zilustrowana czerwonym słupkiem i liczbą, natomiast różnica między stężeniem bakterii po 24 h w probówce z kombinacją a probówce zawierającej pojedynczy, najaktywniejszy lek jest zilustrowana niebieskim słupkiem i liczbą. Rysunek 4A przedstawia wyniki dla kombinacji kolistyny i minocykliny; kombinacja ta wykazała działanie synergistyczne (różnica między stężeniami bakterii poddanych działaniu kombinacji a najaktywniejszego leku pojedynczo ≥2 log10 CFU/mL po 24 h) oraz bakteriobójcze (spadek od początkowego inokulum do stężenia po 24 h ≥3 log10 CFU/mL). Rysunek 4B przedstawia wyniki dla kombinacji kolistyny i klindamycyny – kombinacji, która była synergistyczna, ale nie bakteriobójcza. Kombinacja ta zahamowała wzrost bakterii, czego nie osiągnął żaden z leków podany pojedynczo, jednak nie zabiła ich. Rysunek 4C przedstawia wyniki dla kombinacji kolistyny i erytromycyny, która nie była ani bakteriobójcza, ani synergistyczna.
<img alt="Schemat testu synergiu antybiotyków metodą szachownicy; analiza wzrostu dla stężeń minocykliny i kolistyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wyniki układu szachownicy wykazujące synergię (minocyklina + kolistyna przetestowane przeciwko szczepowi E. coli FDA-CDC 0494). (A) Odczyt spektrofotometryczny i interpretacja wzrostu w układzie szachownicy. Wartości w komórkach to odczyty gęstości optycznej przy 600 nm (OD600). Komórki z wartościami OD600 poniżej 0,07 (odpowiadające brakowi wzrostu w ocenie wizualnej) są zaznaczone na czerwono, natomiast komórki z wartościami OD600 wynoszącymi 0,07 (odpowiadające wzrostowi w ocenie wizualnej) są zaznaczone na zielono. (B) Obliczanie wskaźnika frakcyjnej stężenia hamującego (FICI). Zachowano cieniowanie wskazujące wzrost lub brak wzrostu. Wartości dla kolistyny i minocykliny wzdłuż osi x i y odpowiednio reprezentują teraz frakcyjne stężenie hamujące (FIC), czyli stosunek stężenia leku w danej kolumnie lub wierszu do minimalnego stężenia hamującego (MIC) tego leku stosowanego pojedynczo. Wartość w każdej komórce to FICI, czyli suma FIC obu leków w danej studzience. Duża ramka z przerywaną linią obejmuje studzienki z FICI równym 0,5. Komórka z grubą ramką wskazuje studzienkę z najniższym FICI, w której wzrost jest zahamowany, czyli minimalny FICI. Ponieważ minimalny FICI wynosi 0,5, kombinacja jest uznana za synergistyczną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mapa ciepła synergii minocykliny i kolistyny, wpływ stężenia leku na wzrost bakterii, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wyniki metody szachownicy (checkerboard) dla kombinacji, która nie wykazuje synergii (minocyklina + kolistyna przetestowane przeciwko izolatowi K. pneumoniae BIDMC 4). (A) Wartości gęstości optycznej przy 600 nm i interpretacja wzrostu wyników szachownicy, zgodnie z opisem dla Ryciny 1A. (B) Obliczenie indeksu frakcyjnego stężenia hamującego (FICI), zgodnie z opisem dla Ryciny 1A. Ponieważ minimalne FICI jest &gt;0,5, kombinacja nie jest uznawana za synergistyczną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mapa ciepła skuteczności antybiotyków; stężenia minocykliny i kolistyny; wyniki wzrostu bakterii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wyniki metody szachownicy (checkerboard array), które są nieinterpretowalne z powodu pominiętych dołków (test minocykliny + kolistyny przeciwko izolatowi BIDMC 27 kompleksu Enterobacter cloacae). Wartości gęstości optycznej przy 600 nm oraz interpretacja wzrostu w wynikach metody szachownicy, opisane dla Ryciny 1A. Przedstawiono kilka pominiętych dołków, w których wzrost bakterii jest hamowany mimo obecności wzrostu w sąsiednich dołkach z wyższymi stężeniami antybiotyku. Wyniki są nieinterpretowalne i eksperyment musi zostać powtórzony. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy inhibicji wzrostu bakterii, CFU/mL w funkcji czasu, pokazujące wpływ antybiotyków, wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wyniki analizy czasu zabijania (time-kill) dla trzech kombinacji przetestowanych przeciwko izolatowi K. pneumoniae BIDMC 32. Liczba kolonii jest przedstawiona w skali logarytmicznej na osi y, a czas w godzinach na osi x. Różnica między stężeniem bakterii w kombinacji po 24 h a początkowym inokulum w probówce jest zilustrowana czerwonym słupkiem i liczbą. Jeśli spadek od początkowego inokulum do stężenia po 24 h wynosi ≥3 log10 CFU/mL, kombinację uznaje się za bakteriobójczą. Różnica między stężeniem bakterii po 24 h w probówce zawierającej kombinację a probówce zawierającej sam najaktywniejszy pojedynczy środek jest zilustrowana niebieskim słupkiem i liczbą; jeśli redukcja wynosi ≥2 log10 CFU/mL, kombinację uznaje się za synergistyczną. (A) Kolistyna (CST) + minocyklina (MIN), kombinacja synergistyczna i bakteriobójcza. (B) Kolistyna + klindamycyna (CLI), kombinacja synergistyczna, ale niebakteriobójcza. (C) Kolistyna + erytromycyna (ERY), kombinacja niesynergistyczna i niebakteriobójcza. Wyniki te zostały pierwotnie opublikowane jako część badania nad aktywnością synergistyczną kombinacji zawierających kolistynę przeciwko opornym na kolistynę bakteriom z rodziny Enterobacteriaceae, w którym wykazaliśmy, że kolistyna wykazuje synergizm z szeregiem antybiotyków, które są aktywne indywidualnie jedynie (np. klindamycyna) lub głównie (np. erytromycyna) przeciwko bakteriom Gram-dodatnim16. (Należy zauważyć, że erytromycyna wykazywała synergizm w metodzie szachownicy względem pokazanego szczepu, ale nie w analizie czasu zabijania, dlatego została tutaj wybrana jako przykład kombinacji niesynergistycznej). Postawiliśmy hipotezę, że kolistyna, o której wiadomo, iż działa poprzez permeabilizację zewnętrznej błony bakterii Gram-ujemnych, wywiera subinhibicyjny efekt permeabilizujący na oporne na kolistynę bakterie Gram-ujemne, umożliwiając wnikanie leków takich jak klindamycyna, które normalnie nie mogą przedostać się do komórki Gram-ujemnej. Panel (A) tej ryciny został zmodyfikowany z Brennan-Krohn, Pironti, and Kirby 201816, copyright © American Society for Microbiology, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Testy synergii przeciwdrobnoustrojowej są używane do oceny efektu dwóch lub więcej antybiotyków stosowanych w połączeniu i zazwyczaj są wykonywane za pomocą jednej z dwóch metod: szachownicy lub testu zabijania czasu. W tym miejscu przedstawiamy zautomatyzowaną, wspomaganą drukarką atramentową technikę synergii tablicy szachownicowej oraz klasyczne badanie synergii zabijania czasu.

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Ręczne testowanie synergii z tablicą szachownicową jest metodą pracochłonną i podatną na błędy. W przeciwieństwie do tego, nasza zautomatyzowana metoda szachownicy oparta na drukarce atramentowej znacznie poprawia szybkość, dokładność i przepustowość. Zautomatyzowana metoda szachownicy umożliwia badanie przesiewowe dużej liczby leków pod kątem synergicznych kombinacji, podczas gdy metoda zabijania w czasie może potwierdzić i dalej badać aktywność tych kombinacji.Odkrycia nowych antybiotyków nie nadążają za rozprzestrzenianiem się oporności, ale badanie synergicznych kombinacji daje możliwość uratowania istniejących leków w leczeniu opornych bakterii. Chociaż demonstrujemy tę technikę w przypadku środków przeciwbakteryjnych, może być ona również stosowana z innymi klasami środków przeciwdrobnoustrojowych, a nawet do różnych rodzajów testów skojarzonych leków lub związków. W tym filmie pokazujemy zautomatyzowaną metodę szachownicy i ręczną metodę zabijania czasu.Sugerujemy najpierw przeprowadzenie badań z tablicą szachownicową w celu zidentyfikowania obiecujących kombinacji, a następnie dalsze ich badanie za pomocą badań zabijających czas. Na początek należy przygotować przeciwbakteryjne roztwory podstawowe kolistyny i minocykliny, a następnie przeprowadzić kontrolę jakości roztworów podstawowych zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie dodaj około jednego mililitra 0,9% chlorku sodu z solą fizjologiczną do szklanych probówek hodowlanych o wymiarach 12 milimetrów na 75 milimetrów.Wybierz jedną lub dwie kolonie z nocnego talerza bakterii i umieść je w probówkach hodowlanych. Delikatnie wymieszaj probówki, aby zawiesić bakterie w roztworze. Sprawdź stężenie bakterii za pomocą czytnika McFarland.Dostosuj stężenie, dodając więcej soli fizjologicznej lub więcej bakterii, aby uzyskać odczyt zmętnienia 0,5 McFarlanda. Następnie rozcieńczyć bakterie od jednego do 300, dodając 100 mikrolitrów zawiesiny do 30 mililitrów bulionu Muellera-Hintona z dostosowaniem kationów w 50-mililitrowej stożkowej probówce, aby osiągnąć końcową gęstość komórek pięć razy 10 do piątej jednostki tworzącej kolonie na mililitr. Teraz przygotuj środki przeciwdrobnoustrojowe do drukowania, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym.Zapisz protokół, a następnie kliknij przycisk Uruchom w lewym górnym rogu, a następnie przycisk Start. Załaduj 384-dołkową płytkę do uchwytu płytki i naciśnij Załadowano pod monitem Load Plate 1 Synergy. Następnie umieść kasetę T8+w gnieździe kasety i naciśnij przycisk Załadowano pod monitem Załaduj kasetę T8+.Po wyświetleniu monitu dodaj podstawowy roztwór antybiotyku do wskazanych zbiorników na kasecie. Po dodaniu każdego roztworu naciśnij przycisk Napełniony. Gdy dozownik D300 doda do każdej studzienki materiał z antybiotykiem w odpowiednich ilościach i pojawi się okno Run Completed (Przebieg zakończony), kliknij przycisk Zamknij, wyjmij płytkę i wyłącz D300.Następnie należy wlać wcześniej przygotowaną zawiesinę bakteryjną do sterylnego zbiornika odczynnika. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 50 mikrolitrów zawiesiny do wszystkich studzienek w układzie szachownicy. Następnie dodaj 50 mikrolitrów bulionu Muellera-Hintona bez bakterii z dodatkiem kationów do pustej studzienki.Będzie to studnia kontroli negatywnej, która potwierdzi sterylność pożywki. Inkubować w inkubatorze z powietrzem otoczenia o temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin. Aby przeanalizować test, postępuj zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym.Do testu synergii zabijania czasu ponownie przygotuj podstawowe roztwory przeciwdrobnoustrojowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie należy sporządzić zawiesinę badanego organizmu w stężeniu 0,5 McFarlanda w sterylnej soli fizjologicznej. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny 0,5 McFarland do pięciu mililitrów CAMHB w szklanej probówce hodowlanej z okrągłym dnem o wymiarach 25 na 150 milimetrów z zamknięciem ze stali nierdzewnej i delikatnie wymieszaj.Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, wyizoluj kroplę rozcieńczonej zawiesiny na płytkę z agarem z krwią i inkubuj płytkę w temperaturze 35 stopni Celsjusza w otaczającym powietrzu, aby potwierdzić czystość inokulum. Załóż zamknięcie na probówkę i inkubuj ją w stojaku na probówki na wytrząsarce w temperaturze 35 stopni Celsjusza w otaczającym powietrzu przez co najmniej 3 godziny, aż do osiągnięcia wzrostu w fazie logarytmicznej. Podczas inkubacji początkowej kultury dodaj 10 mililitrów bulionu Muellera-Hintona z dostosowaniem kationów do pięciu autoklawowanych szklanych probówek hodowlanych.W przypadku badania synergii zabijającej w czasie, co najmniej jeden lek powinien mieć stężenie, które nie wpływa indywidualnie na krzywą wzrostu. Można to ustalić, oceniając wpływ stężeń poszczególnych leków przed badaniem synergii. Do pierwszej probówki dodaj 10 mikrolitrów kolozyny o zawartości jednego miligrama na mililitr, aby uzyskać końcowe stężenie kolistyny wynoszące jeden mikrogram na mililitr, ponieważ jest to stężenie nieskuteczne w przypadku szczepu użytego w tym przykładzie.Do drugiej probówki dodaj 10 mikrolitrów bulionu minocykliny o grubości jednego miligrama na mililitr, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. To stężenie jest również nieskuteczne w stosunku do szczepu używanego w tym przykładzie. Do trzeciej probówki dodaj 10 mikrolitrów bulionu minocykliny o miligramie na mililitr i 10 mikrolitrów bulionu kolistyny o miligramie na mililitr.Jest to taka sama ilość kolistyny i minocykliny, jaka jest stosowana w probówkach pierwszej i drugiej. W czwartej i piątej probówce nie dodawaj antybiotyków. Będą to odpowiednio probówki kontroli wzrostu i kontroli ujemnej.Następnie przygotuj 96 głębokich płytek polipropylenowych z dwumililitrowymi studzienkami do seryjnych rozcieńczeń, dodając 900 mikrolitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej do rzędów od B do H kolumn od pierwszego do czwartego za pomocą pipety wielokanałowej. Gdy kultura jest w logarytmicznej fazie wzrostu, wyjmij probówkę hodowlaną z wytrząsarki i delikatnie ją przemieszaj. Przenieś jeden mililitr zawiesiny do szklanej probówki hodowlanej o wymiarach 12 na 75 milimetrów i sprawdź gęstość za pomocą czytnika McFarland.Jeśli gęstość jest mniejsza niż 1,0 McFarlanda, włóż probówkę z powrotem do wytrząsarki i inkubuj dłużej. Jeśli jest większa niż 1,0 McFarlanda, dodaj do probówki bulion Muellera-Hintona z dostosowaniem kationowym, delikatnie przemieszaj i ponownie próbkuj, aż zawiesina osiągnie poziom 1,0 McFarlanda. Ważne jest, aby kultura znajdowała się w logarytmicznej fazie wzrostu podczas przygotowywania początkowego inokulum.Możesz skonstruować krzywą wzrostu, aby określić, kiedy organizm osiąga tę fazę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów zawieszenia 1.0 McFarland do rurek od pierwszej do czwartej i delikatnie je wymieszaj. Natychmiast po wymieszaniu i po jednej, dwóch, czterech, sześciu i 24 godzinach należy wyjąć 150-mikrolitrową porcję z każdej probówki hodowlanej, przechylając probówkę tak, aby tylko sterylna końcówka pipety weszła do probówki, a nie do niesterylnego trzonu pipety podczas pobierania podwielokrotności.Dodać podwielokrotności odpowiednio do kolejnych studzienek w pierwszym rzędzie wcześniej przygotowanej płytki głębinowej 96. Umieść probówki z powrotem na stojaku na probówki na wytrząsarce w inkubatorze powietrza otoczenia o temperaturze 35 stopni Celsjusza natychmiast po usunięciu podwielokrotności w każdym punkcie czasowym. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń 100 mikrolitrów z rzędu A płytki i dodaj ją do rzędu B, zawierającego 900 mikrolitrów soli fizjologicznej, tworząc rozcieńczenie od 1 do 10.Pipetuj roztwór w górę i w dół cztery do pięciu razy, aby wymieszać, a następnie wyrzuć końcówki. Najpierw oznacz płytki agarowe Muellera-Hintona warunkami antybiotykowymi i rozcieńczeniem, które mają być platerowane. Następnie rozcieńczone próbki należy pokryć płytką w celu zliczenia kolonii metodą płytki kroplowej, używając wielokanałowej pipety z bardzo długimi końcówkami.Wyjmij 10 mikrolitrów z każdej studzienki w pierwszej kolumnie i ostrożnie dozuj z rzędu na odpowiednio oznakowaną płytkę. Kontynuuj, aż wszystkie rzędy zostaną wylane na talerze. Ponadto w 24-godzinnym punkcie czasowym umieścić 10-mikrolitrową kroplę pobraną bezpośrednio z probówki kontroli ujemnej w miejscu do tego przeznaczonym w celu zbadania sterylności.Następnie odwróć wszystkie płytki i inkubuj je przez noc w temperaturze 35 stopni Celsjusza w otaczającym powietrzu. Następnie policz liczbę kolonii na każdym obszarze i oblicz gęstość komórek. Oznacz kolonie markerem permanentnym z cienką końcówką na odwrocie płytki, aby uniknąć podwójnego liczenia lub brakujących kolonii.Dla każdej serii rozcieńczeń należy zidentyfikować krople zawierające od trzech do 30 kolonii. Policz kolonie w tych kroplach i zapisz liczbę wraz ze współczynnikiem rozcieńczenia. Pokazana tutaj jest siatka z eksperymentu synergicznego z tablicą szachownicową, w którym minocyklina w stężeniach od zera do 32 mikrogramów na mililitr została połączona z kolistyną w stężeniach od zera do 16 mikrogramów na mililitr i przetestowana przeciwko szczepowi E. coli.Studzienki o wartościach OD600 poniżej 07 reprezentują brak wzrostu i są zacieniowane na czerwono, podczas gdy studzienki o wartościach OD600 powyżej lub równej 07 reprezentują wzrost i są zacieniowane na zielono. Dla każdego leku minimalne stężenie hamujące to najniższe stężenie leku, które hamuje wzrost bakterii. W przypadku minocykliny jest to 32 mikrogramy na mililitr, a w przypadku kolistyny osiem mikrogramów na mililitr.Zacienienie jest tutaj zachowane, ale wartości w studzienkach, w których wzrost jest zahamowany, są zastępowane wartościami indeksu frakcji o stężeniu hamującym lub FIC. W każdym dołku wskaźnik FIC każdego leku oblicza się, dzieląc stężenie antybiotyku w tym dołku przez minimalne stężenie hamujące leku. Studnie o indeksie FIC mniejszym lub równym 0,5, który jest uważany za punkt odcięcia dla synergii, są oznaczone przerywaną linią, a studnia o najniższym wskaźniku FIC jest pogrubiona.Ponieważ minimalna wartość FIC mieści się w zakresie synergii, połączenie jest uważane za synergiczne. Przykład przypadku, który nie wykazuje synergii, jest pokazany tutaj, ponieważ minimalny wskaźnik, przy którym wzrost jest zahamowany, to jeden, który jest większy niż 0,5. Wreszcie, w tym przykładzie, wystąpiło kilka pominiętych studzienek, co oznacza wzrost bakterii, który jest zahamowany, pomimo obecności wzrostu bakterii w sąsiednich studzienkach o wyższych stężeniach antybiotyku.Jeśli w tablicy szachownicy wystąpił więcej niż jeden pominięty studzienek, wyniki należy odrzucić i powtórzyć test. Poniżej przedstawiono przykładowy wykres przedstawiający wyniki testu synergii zabijania w czasie. Szczegółowe informacje na temat interpretacji testu synergii zabijania w czasie można znaleźć w dołączonym protokole tekstowym.Więcej informacji na temat aktywności synergicznych kombinacji można uzyskać poprzez ocenę farmakokinetyki i farmakodynamiki oraz poprzez badania in vivo na modelach zwierzęcych. Podczas pracy z bakteriami należy zawsze przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa, w tym stosowania środków ochrony osobistej. Jeśli generujesz aerozole lub używasz patogenów wysokiego ryzyka, wszystkie prace wykonuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

antimicrobial-synergy-testing-inkjet-printer-assisted-automated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test do badania przesiewowego związków przeciwdrobnoustrojowych, które skutecznie eliminują biofilmy za pomocą płytki kołkowej. Metodologia ta monitoruje stan metaboliczny biofilmu po poddaniu działaniu związków przeciwdrobnoustrojowych, ułatwiając określenie minimalnego stężenia eradykacji biofilmu.

Test biofilmu na płytce kołkowej do badań przesiewowych środków przeciwbakteryjnych

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Synergiczne kombinacje leków są trudne i czasochłonne do empirycznego zidentyfikowania. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i walidacji synergicznych małych cząsteczek.

Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap2

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru aktywności Shigellacidal przeciwciał w surowicy. Surowicę miesza się z bakteriami i egzogennym dopełniaczem, inkubuje, a mieszaninę reakcyjną posiewa się na płytkach agarowych. Żywe bakterie tworzą kolonie, które są zliczane za pomocą automatycznego enumeratora kolonii i wykorzystywane do określenia miana bakteriobójczego.

Wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella

Ten protokół opisuje, jak badać wszystkie możliwe kombinacje, które można uzyskać między czterema lekami w jednym eksperymencie. Metoda ta opiera się na standardowym teście mikrorozcieńczania na 96-dołkowej płytce i obliczeniu frakcyjnych stężeń hamujących (FIC) w celu oceny wyników.

Poczwórna szachownica: modyfikacja trójwymiarowej szachownicy do badania kombinacji leków

Tutaj prezentujemy protokół oceny skuteczności przeciwbakteryjnej polimeru uwalniającego antybiotyki do symulacji profilaktycznego zastosowania klinicznego za pomocą dostępnego na rynku testu żywotności mikrobiologicznej luminescencyjnego opartego na ATP w czasie rzeczywistym. Metoda ta umożliwia monitorowanie aktywności podłużnej materiałów uwalniających leki i może być szeroko stosowana do testowania przeciwdrobnoustrojowych platform dostarczania leków.

Nowatorska metoda określania podłużnej aktywności przeciwbakteryjnej materiałów uwalniających leki

Tutaj przedstawiamy zasadę, strukturę i instrukcję inteligentnego, wysokoprzepustowego systemu testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów. Jego zastosowanie ilustruje przykład Salmonelli wyizolowanej z drobiu w Shandong w Chinach. Obliczany jest indeks Lar, a jego znaczenie w ocenie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest szczegółowo omawiane.

Zastosowanie inteligentnego, wysokowydajnego systemu badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów oraz wskaźnika Lar oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Protokół ten opisuje metodę produkcji i oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz naśladowcy peptydu RK758. Integrując syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowaną oraz standaryzowane testy funkcjonalne, zapewnia usprawniony proces produkcji i testowania peptydów oraz naśladowców małych cząsteczek.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Czynniki komórek gospodarza odgrywają krytyczną rolę w powstawaniu i utrzymywaniu się mięsaka Kaposiego (KS). Opisujemy metody identyfikacji czynników komórek gospodarza, które uległy zmianie w zakażonych KSHV komórkach DMVEC oraz w tkance nowotworowej KS. Geny komórkowe zmodyfikowane przez wirusa będą służyć jako potencjalne cele dla nowych terapii.

Identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV)

Badanie wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na środki przeciwdrobnoustrojowe jest trudne, lecz kluczowe dla opieki nad pacjentem. Ten format z użyciem płytek mikrotytrujących umożliwia przetestowanie 12 leków przeciwprątkowych i pozwala wyznaczyć wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC), co pomoże w doborze odpowiedniego leczenia.

Badanie wrażliwości kompleksu Mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Poznaj zautomatyzowaną metodę tablicy szachownicy wspomaganą drukarką atramentową do testowania synergii przeciwdrobnoustrojowej oraz klasyczną metodę zabijania czasu. Technika ta umożliwia szybkie przesiewanie kombinacji leków przeciwko bakteriom opornym.

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu (Wideo) | JoVE Journal

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

Przeglądaj więcej filmów