Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

Ręczne testowanie synergii z tablicą szachownicową jest metodą pracochłonną i podatną na błędy. W przeciwieństwie do tego, nasza zautomatyzowana metoda szachownicy oparta na drukarce atramentowej znacznie poprawia szybkość, dokładność i przepustowość. Zautomatyzowana metoda szachownicy umożliwia badanie przesiewowe dużej liczby leków pod kątem synergicznych kombinacji, podczas gdy metoda zabijania w czasie może potwierdzić i dalej badać aktywność tych kombinacji.

Odkrycia nowych antybiotyków nie nadążają za rozprzestrzenianiem się oporności, ale badanie synergicznych kombinacji daje możliwość uratowania istniejących leków w leczeniu opornych bakterii. Chociaż demonstrujemy tę technikę w przypadku środków przeciwbakteryjnych, może być ona również stosowana z innymi klasami środków przeciwdrobnoustrojowych, a nawet do różnych rodzajów testów skojarzonych leków lub związków. W tym filmie pokazujemy zautomatyzowaną metodę szachownicy i ręczną metodę zabijania czasu.

Sugerujemy najpierw przeprowadzenie badań z tablicą szachownicową w celu zidentyfikowania obiecujących kombinacji, a następnie dalsze ich badanie za pomocą badań zabijających czas. Na początek należy przygotować przeciwbakteryjne roztwory podstawowe kolistyny i minocykliny, a następnie przeprowadzić kontrolę jakości roztworów podstawowych zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie dodaj około jednego mililitra 0,9% chlorku sodu z solą fizjologiczną do szklanych probówek hodowlanych o wymiarach 12 milimetrów na 75 milimetrów.

Wybierz jedną lub dwie kolonie z nocnego talerza bakterii i umieść je w probówkach hodowlanych. Delikatnie wymieszaj probówki, aby zawiesić bakterie w roztworze. Sprawdź stężenie bakterii za pomocą czytnika McFarland.

Dostosuj stężenie, dodając więcej soli fizjologicznej lub więcej bakterii, aby uzyskać odczyt zmętnienia 0,5 McFarlanda. Następnie rozcieńczyć bakterie od jednego do 300, dodając 100 mikrolitrów zawiesiny do 30 mililitrów bulionu Muellera-Hintona z dostosowaniem kationów w 50-mililitrowej stożkowej probówce, aby osiągnąć końcową gęstość komórek pięć razy 10 do piątej jednostki tworzącej kolonie na mililitr. Teraz przygotuj środki przeciwdrobnoustrojowe do drukowania, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym.

Zapisz protokół, a następnie kliknij przycisk Uruchom w lewym górnym rogu, a następnie przycisk Start. Załaduj 384-dołkową płytkę do uchwytu płytki i naciśnij Załadowano pod monitem Load Plate 1 Synergy. Następnie umieść kasetę T8+w gnieździe kasety i naciśnij przycisk Załadowano pod monitem Załaduj kasetę T8+.

Po wyświetleniu monitu dodaj podstawowy roztwór antybiotyku do wskazanych zbiorników na kasecie. Po dodaniu każdego roztworu naciśnij przycisk Napełniony. Gdy dozownik D300 doda do każdej studzienki materiał z antybiotykiem w odpowiednich ilościach i pojawi się okno Run Completed (Przebieg zakończony), kliknij przycisk Zamknij, wyjmij płytkę i wyłącz D300.

Następnie należy wlać wcześniej przygotowaną zawiesinę bakteryjną do sterylnego zbiornika odczynnika. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 50 mikrolitrów zawiesiny do wszystkich studzienek w układzie szachownicy. Następnie dodaj 50 mikrolitrów bulionu Muellera-Hintona bez bakterii z dodatkiem kationów do pustej studzienki.

Będzie to studnia kontroli negatywnej, która potwierdzi sterylność pożywki. Inkubować w inkubatorze z powietrzem otoczenia o temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin. Aby przeanalizować test, postępuj zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym.

Do testu synergii zabijania czasu ponownie przygotuj podstawowe roztwory przeciwdrobnoustrojowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie należy sporządzić zawiesinę badanego organizmu w stężeniu 0,5 McFarlanda w sterylnej soli fizjologicznej. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny 0,5 McFarland do pięciu mililitrów CAMHB w szklanej probówce hodowlanej z okrągłym dnem o wymiarach 25 na 150 milimetrów z zamknięciem ze stali nierdzewnej i delikatnie wymieszaj.

Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, wyizoluj kroplę rozcieńczonej zawiesiny na płytkę z agarem z krwią i inkubuj płytkę w temperaturze 35 stopni Celsjusza w otaczającym powietrzu, aby potwierdzić czystość inokulum. Załóż zamknięcie na probówkę i inkubuj ją w stojaku na probówki na wytrząsarce w temperaturze 35 stopni Celsjusza w otaczającym powietrzu przez co najmniej 3 godziny, aż do osiągnięcia wzrostu w fazie logarytmicznej. Podczas inkubacji początkowej kultury dodaj 10 mililitrów bulionu Muellera-Hintona z dostosowaniem kationów do pięciu autoklawowanych szklanych probówek hodowlanych.

W przypadku badania synergii zabijającej w czasie, co najmniej jeden lek powinien mieć stężenie, które nie wpływa indywidualnie na krzywą wzrostu. Można to ustalić, oceniając wpływ stężeń poszczególnych leków przed badaniem synergii. Do pierwszej probówki dodaj 10 mikrolitrów kolozyny o zawartości jednego miligrama na mililitr, aby uzyskać końcowe stężenie kolistyny wynoszące jeden mikrogram na mililitr, ponieważ jest to stężenie nieskuteczne w przypadku szczepu użytego w tym przykładzie.

Do drugiej probówki dodaj 10 mikrolitrów bulionu minocykliny o grubości jednego miligrama na mililitr, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. To stężenie jest również nieskuteczne w stosunku do szczepu używanego w tym przykładzie. Do trzeciej probówki dodaj 10 mikrolitrów bulionu minocykliny o miligramie na mililitr i 10 mikrolitrów bulionu kolistyny o miligramie na mililitr

Jest to taka sama ilość kolistyny i minocykliny, jaka jest stosowana w probówkach pierwszej i drugiej. W czwartej i piątej probówce nie dodawaj antybiotyków. Będą to odpowiednio probówki kontroli wzrostu i kontroli ujemnej.

Następnie przygotuj 96 głębokich płytek polipropylenowych z dwumililitrowymi studzienkami do seryjnych rozcieńczeń, dodając 900 mikrolitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej do rzędów od B do H kolumn od pierwszego do czwartego za pomocą pipety wielokanałowej. Gdy kultura jest w logarytmicznej fazie wzrostu, wyjmij probówkę hodowlaną z wytrząsarki i delikatnie ją przemieszaj. Przenieś jeden mililitr zawiesiny do szklanej probówki hodowlanej o wymiarach 12 na 75 milimetrów i sprawdź gęstość za pomocą czytnika McFarland.

Jeśli gęstość jest mniejsza niż 1,0 McFarlanda, włóż probówkę z powrotem do wytrząsarki i inkubuj dłużej. Jeśli jest większa niż 1,0 McFarlanda, dodaj do probówki bulion Muellera-Hintona z dostosowaniem kationowym, delikatnie przemieszaj i ponownie próbkuj, aż zawiesina osiągnie poziom 1,0 McFarlanda. Ważne jest, aby kultura znajdowała się w logarytmicznej fazie wzrostu podczas przygotowywania początkowego inokulum.

Możesz skonstruować krzywą wzrostu, aby określić, kiedy organizm osiąga tę fazę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów zawieszenia 1.0 McFarland do rurek od pierwszej do czwartej i delikatnie je wymieszaj. Natychmiast po wymieszaniu i po jednej, dwóch, czterech, sześciu i 24 godzinach należy wyjąć 150-mikrolitrową porcję z każdej probówki hodowlanej, przechylając probówkę tak, aby tylko sterylna końcówka pipety weszła do probówki, a nie do niesterylnego trzonu pipety podczas pobierania podwielokrotności.

Dodać podwielokrotności odpowiednio do kolejnych studzienek w pierwszym rzędzie wcześniej przygotowanej płytki głębinowej 96. Umieść probówki z powrotem na stojaku na probówki na wytrząsarce w inkubatorze powietrza otoczenia o temperaturze 35 stopni Celsjusza natychmiast po usunięciu podwielokrotności w każdym punkcie czasowym. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń 100 mikrolitrów z rzędu A płytki i dodaj ją do rzędu B, zawierającego 900 mikrolitrów soli fizjologicznej, tworząc rozcieńczenie od 1 do 10.

Pipetuj roztwór w górę i w dół cztery do pięciu razy, aby wymieszać, a następnie wyrzuć końcówki. Najpierw oznacz płytki agarowe Muellera-Hintona warunkami antybiotykowymi i rozcieńczeniem, które mają być platerowane. Następnie rozcieńczone próbki należy pokryć płytką w celu zliczenia kolonii metodą płytki kroplowej, używając wielokanałowej pipety z bardzo długimi końcówkami.

Wyjmij 10 mikrolitrów z każdej studzienki w pierwszej kolumnie i ostrożnie dozuj z rzędu na odpowiednio oznakowaną płytkę. Kontynuuj, aż wszystkie rzędy zostaną wylane na talerze. Ponadto w 24-godzinnym punkcie czasowym umieścić 10-mikrolitrową kroplę pobraną bezpośrednio z probówki kontroli ujemnej w miejscu do tego przeznaczonym w celu zbadania sterylności.

Następnie odwróć wszystkie płytki i inkubuj je przez noc w temperaturze 35 stopni Celsjusza w otaczającym powietrzu. Następnie policz liczbę kolonii na każdym obszarze i oblicz gęstość komórek. Oznacz kolonie markerem permanentnym z cienką końcówką na odwrocie płytki, aby uniknąć podwójnego liczenia lub brakujących kolonii.

Dla każdej serii rozcieńczeń należy zidentyfikować krople zawierające od trzech do 30 kolonii. Policz kolonie w tych kroplach i zapisz liczbę wraz ze współczynnikiem rozcieńczenia. Pokazana tutaj jest siatka z eksperymentu synergicznego z tablicą szachownicową, w którym minocyklina w stężeniach od zera do 32 mikrogramów na mililitr została połączona z kolistyną w stężeniach od zera do 16 mikrogramów na mililitr i przetestowana przeciwko szczepowi E. coli.

Studzienki o wartościach OD600 poniżej 07 reprezentują brak wzrostu i są zacieniowane na czerwono, podczas gdy studzienki o wartościach OD600 powyżej lub równej 07 reprezentują wzrost i są zacieniowane na zielono. Dla każdego leku minimalne stężenie hamujące to najniższe stężenie leku, które hamuje wzrost bakterii. W przypadku minocykliny jest to 32 mikrogramy na mililitr, a w przypadku kolistyny osiem mikrogramów na mililitr.

Zacienienie jest tutaj zachowane, ale wartości w studzienkach, w których wzrost jest zahamowany, są zastępowane wartościami indeksu frakcji o stężeniu hamującym lub FIC. W każdym dołku wskaźnik FIC każdego leku oblicza się, dzieląc stężenie antybiotyku w tym dołku przez minimalne stężenie hamujące leku. Studnie o indeksie FIC mniejszym lub równym 0,5, który jest uważany za punkt odcięcia dla synergii, są oznaczone przerywaną linią, a studnia o najniższym wskaźniku FIC jest pogrubiona.

Ponieważ minimalna wartość FIC mieści się w zakresie synergii, połączenie jest uważane za synergiczne. Przykład przypadku, który nie wykazuje synergii, jest pokazany tutaj, ponieważ minimalny wskaźnik, przy którym wzrost jest zahamowany, to jeden, który jest większy niż 0,5. Wreszcie, w tym przykładzie, wystąpiło kilka pominiętych studzienek, co oznacza wzrost bakterii, który jest zahamowany, pomimo obecności wzrostu bakterii w sąsiednich studzienkach o wyższych stężeniach antybiotyku.

Jeśli w tablicy szachownicy wystąpił więcej niż jeden pominięty studzienek, wyniki należy odrzucić i powtórzyć test. Poniżej przedstawiono przykładowy wykres przedstawiający wyniki testu synergii zabijania w czasie. Szczegółowe informacje na temat interpretacji testu synergii zabijania w czasie można znaleźć w dołączonym protokole tekstowym.

Więcej informacji na temat aktywności synergicznych kombinacji można uzyskać poprzez ocenę farmakokinetyki i farmakodynamiki oraz poprzez badania in vivo na modelach zwierzęcych. Podczas pracy z bakteriami należy zawsze przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa, w tym stosowania środków ochrony osobistej. Jeśli generujesz aerozole lub używasz patogenów wysokiego ryzyka, wszystkie prace wykonuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego.