Name: Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do wykrywania nowo powstałych komórek macierzystopodobnych po odwróceniu apoptozy w komórkach raka piersi. Technika FACS umożliwia izolację czystych populacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundusz Innowacyjnych Technologii Komisji Technologii Innowacyjnych: Wsparcie Finansowe od Państwowego Kluczowego Laboratorium Agrobiotechnologii (CUHK), Funduszu Badań Biomedycznych Lo Kwee-Seong oraz Fundacji Lee Hysana. Y.X. był wspierany przez stypendium podyplomowe z CUHK.

1. Przygotowanie komórek raka piersi niepochodzących z macierzystego
<ol>
	<li>Hodowla komórek MCF-7 i MDA-MB-231 w 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) w naczyniu o średnicy 100 mm. Kultura T47D w 10 ml pożywki RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, 10% inaktywowanego termicznie FBS i 1% v/v penicyliny-streptomycyny (PS) w naczyniu o średnicy 100 mm. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2 / 95% powietrzem. 
	nuta: Czerwień fenolowa wpływa na wykrywanie oparte na fluorescencji, ale ma również potencjalny wpływ na wzrost komórek raka piersi ze względu na swoje działanie podobne do estrogenów31. Na przykład czerwień fenolowa może stymulować receptor progesteronu i wzrost komórek MCF-731. Może również stymulować wzrost komórek T47D31.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodaj 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA do MCF-7 i MDA-MB-231 lub 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do komórek T47D. 
	nuta: Stężenie trypsyny-EDTA potrzebne do separacji komórek między różnymi typami komórek raka piersi jest różne, podczas gdy niewłaściwe stężenie może wpływać na wzorzec ekspresji niektórych markerów powierzchni komórek, takich jak CD44 i CD2432.</li>
	<li>Hodować naczynia przez 5 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2/95% powietrza. Często sprawdzaj oderwanie komórek pod mikroskopem, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu komórek przez trypsynę-EDTA.</li>
	<li>Gdy ponad 90% komórek odłączy się, dodaj 5 ml gotowej pożywki RPMI do naczynia i kilkakrotnie pipetuj ją po powierzchni warstwy komórek.</li>
	<li>Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 300 x g i 4 °C przez 5 min. 
	nuta: Zwykle około 6 x 106 komórek można uzyskać z szalki o średnicy 100 mm, gdy konfluencja osiągnie 70%.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 106 komórkach/100 μl buforu FACS (PBS zawierający 0,5% BSA i 0,1% azydku sodu) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Podziel komórki na kilka probówek. W przypadku komórek MCF-7 podziel komórki na 4 probówki: dwie do kontroli izotypu, jedną do pojedynczego barwienia CD24 jako kontroli pozytywnej CD24 i jedną do podwójnego barwienia.</li>
	<li>W przypadku komórek T47D podziel komórki na 3 probówki: dwie do kontroli izotypu i jedną do podwójnego barwienia.</li>
	<li>W przypadku komórek MDA-MB-231 podziel komórki na 4 probówki: dwie do kontroli izotypu, jedną do pojedynczego barwienia CD44 jako kontroli pozytywnej CD44 i jedną do podwójnego barwienia.</li>
	<li>Ponownie odwirować probówki w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant, a następnie dodać blok Fc rozcieńczony w stosunku 1:50 do buforu FACS.</li>
	<li>Próbki inkubować na lodzie przez 20 minut w ciemności, a następnie odwirować w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Dodać sprzężone z fluorochromem przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkim CD44 (PerCP-Cy5.5) i CD24 (PE) w rozcieńczeniach 1:40 i 1:10 (w buforze FACS) w podwójnych grupach barwienia. W przypadku kontroli pozytywnych dodaj odpowiednio CD44 (PerCP-Cy5.5) do MDA-MB-231 i dodaj CD24 (PE) do komórek MCF-7 w tym samym stężeniu. 
	nuta: Kombinacja CD44 i C24 była powszechnie stosowana w badaniu CSC piersi26,27,28,29,30.</li>
	<li>Dla grup kontrolnych izotypu dodać PerCP-Cy5.5 IgG2b myszy, κ w rozcieńczeniu 1:40 jako kontrolę izotypu dla przeciwciał CD44 i PE IgG2a, κ w rozcieńczeniu 1:10 jako kontrolę izotypu dla przeciwciał CD24 w 10 6 komórkach/100 μL. 
	nuta: Kontrole izotypu dla przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania są zalecane jako kontrole negatywne33.</li>
	<li>Inkubować próbki (z etapów 1.12 i 1.13) w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut. Wirować przy 300 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć osad dwukrotnie 500 μl PBS i odwirować w temperaturze 300 x g i 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulat w 0,5 ml PBS i przefiltrować przez nylonową siatkę 40 μm przed uruchomieniem na aktywowanym fluorescencją sortowniku komórek.</li>
	<li>W celu bramkowania i kompensacji wybarwić komórki MCF-7 przeciwciałami anty-CD24 sprzężonymi z PE i wybarwić komórki MDA-MB-231 przeciwciałami anty-CD44 sprzężonymi z PerCP-Cy5.5 jako kontrolami pozytywnymi. Użyj komórek zabarwionych kontrolkami izotypu jako kontroli negatywnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Zebrać komórki za pomocą markerów CD44-/CD24+ w probówkach z polistyrenu okrągłodennego o wymiarach 12 x 75 mm zawierających 1 ml pożywki zbiorczej (pożywka RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej uzupełniona 20% inaktywowanym termicznie FBS i 2% v/v PS). Odwirować probówki o sile 300 x g i temperaturze pokojowej przez 5 minut i wyrzucić supernatant. 
	nuta: Komórki podobne do CSC w komórkach raka piersi są zdefiniowane jako komórki CD44+/CD24-26,27,28,29,30, a komórki raka piersi niebędące komórkami macierzystymi są zdefiniowane jako komórki CD44-/CD24+18 (Rysunek 1).</li>
	<li>Posortowane komórki raka piersi niepochodzące z raka piersi umieścić na płytce zawierającej świeżą pożywkę do dalszej hodowli w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% CO2 . </li>
</ol>
2. Indukcja i detekcja apoptozy
<ol>
	<li>Przygotuj 1 mM staurosporine12,34 w DMSO. W przypadku grupy leczonej MCF-7 dodać 25 μl 1 mM staurosporyny do gotowej pożywki komórek MCF-7, aby uzupełnić do 10 ml końcowej objętości (2,5 μM staurosporyny) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odpipetować, aby równomiernie wymieszać zawartość.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, przemyć komórki jednorazowo 2 ml PBS. Następnie dodaj 10 ml pożywki z 2,5 μM staurosporyną do komórek MCF-7 przez 6 godzin, aby wywołać apoptozę, gdy gęstość komórek osiągnie 70% zbieżności.</li>
	<li>Przygotuj 1 mM paclitaxel35,36 w DMSO. W przypadku leczonej grupy T47D dodać 12,5 μl 1 mM paklitakselu do gotowej pożywki komórek T47D, aby uzupełnić do końcowej objętości 10 ml (5 μM paklitakselu) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odpipetować, aby równomiernie wymieszać zawartość.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek i przemyć komórki jednorazowo 2 ml PBS. Następnie dodaj 10 ml pożywki z 5 μM paklitakselem do komórek T47D przez 10 godzin, aby wywołać apoptozę, gdy gęstość komórek osiągnie 70% konfluencji. 
	nuta: Czas indukcji i stężenie induktorów indukujących apoptozę powinny być optymalizowane za każdym razem, gdy nowa linia komórkowa jest używana po raz pierwszy.</li>
	<li>W przypadku grupy MCF-7 poddanej działaniu rozpuszczalnika dodać 25 μl sterylnego dimetylosulfotlenku (DMSO) do gotowej pożywki komórek MCF-7, aby uzyskać końcową objętość 10 ml (tj. 0,25% v/v DMSO) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odpipetować, aby równomiernie wymieszać zawartość.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek MCF-7 poddanych działaniu rozpuszczalnika, przemyć jednorazowo 2 ml PBS. Następnie dodaj 10 ml pożywki z 0,25% v/v DMSO przez 6 godzin jako kontrolę rozpuszczalnika dla STS.</li>
	<li>W przypadku grupy T47D poddanej działaniu rozpuszczalnika dodać 5 μl sterylnego DMSO do gotowej pożywki komórek T47D, aby uzyskać do 10 ml końcowej objętości (tj. 0,05% v/v DMSO) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odpipetować, aby równomiernie wymieszać zawartość.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek T47D poddanych działaniu rozpuszczalnika, przemyć jednorazowo 2 ml PBS. Następnie dodać 10 ml pożywki z 0,05% v/v DMSO przez 10 godzin jako kontrolę rozpuszczalnika dla paklitakselu.</li>
	<li>Aby zaobserwować zmiany morfologiczne leczonych komórek, wybarwić komórki 50 nM Mitotracker Red CMXRos i 250 ng/ml Hoechst 33342 i inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 / 95% powietrza. Obserwuj typową morfologię komórek apoptotycznych pod 60-krotnym konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym (<silna klasa="xfig">Ryc. 2). 
	nuta: Typowa morfologia apoptozy obejmuje kurczenie się komórek, pęcherzenie błony, fragmentację mitochondriów i kondensację jądrową, ale z nienaruszoną błoną komórkową12,13,14,15,18,37.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek apoptotycznych i procedura odwrócenia apoptozy
<ol>
	<li>Zabarwić zarówno komórki MCF-7 lub T47D potraktowane induktorem apoptozy, jak i rozpuszczalnikiem, barwnikiem 3 μM kaspazy-3/7 Zielona detekcja o stężeniu komórek 106/ml w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2/95% powietrza.</li>
	<li>Przefiltruj komórki przez nylonową siatkę o grubości 40 μm przed uruchomieniem na sortowniku w celu sortowania.</li>
	<li>Dla celów bramkowania, najpierw przebramuj główną populację (R1) i wyklucz szczątki, wykreślając wykres w kropkach z rozproszeniem do przodu i rozproszeniem bocznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Użyj nieleczonych komórek bez dodawania zielonego barwnika wykrywającego kaspazę-3/7 jako kontroli ujemnej, aby zabramować region ujemny (R2) (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Użyj komórek potraktowanych staurosporyną12,18,34 przez 24 godziny i wybarwionych barwnikiem jako kontroli pozytywnej, aby zabramować region dodatni (R3) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Zebrać komórki dodatnie (R3) z grup traktowanych induktorem w probówkach z polistyrenu okrągłodennego o wymiarach 12 x 75 mm zawierających 1 ml pożywki zbiorczej (takiej samej jak pożywka w kroku 1.18) (Rysunki 3 C-3D). Odwirować probówki o sile 300 x g i RT przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zebrać komórki ujemne (R2) z grup traktowanych rozpuszczalnikiem w probówkach z polistyrenu okrągłodennego 12 × 75 mm z 1 ml pożywki zbiorczej, jak w kroku 3.6 (Rysunki 3 E-3F). 
	nuta: Niewielka część komórek (np. 10 000 komórek) może zostać zebrana i ponownie uruchomiona w sortowniku w celu sprawdzenia wzoru markera aktywnych kaspaz. Jeśli ponad 90% posortowanych komórek potraktowanych rozpuszczalnikiem znajduje się w regionie kaspazo-ujemnym lub ponad 90% posortowanych komórek potraktowanych induktorem jest pokazanych w regionie kaspazo-dodatnim, uważa się, że te zebrane komórki są stosunkowo czyste (ryc. 3C-3F). W przeciwnym razie region sortowania i/lub sorter powinny zostać zresetowane.</li>
	<li>Ponownie zawiesić posortowane komórki w świeżej pożywce do zbierania i wysiać je na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i hodowli w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2/95% powietrza przez 7 dni w celu odwrócenia apoptozy.</li>
</ol>
4. Potwierdzenie apoptozy w komórkach aktywowanych kaspazą
<ol>
	<li>Wymieszać 10 mM HEPES, 140 mM NaCl i 2,5 mM CaCl2 w celu przygotowania buforu wiążącego anektynę (pH 7,4). Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C i unikać wystawiania buforu na działanie światła.</li>
	<li>Przygotować 100 μg/ml roztworu roboczego jodku propidyny (PI), rozcieńczając 5 μl roztworu podstawowego PI o stężeniu 1 mg/ml w 45 μl buforu wiążącego aneksynę. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C i unikać wystawiania roztworu na działanie światła. 
	nuta: PI jest potencjalnym mutagenem i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
	<li>Przygotować komórki poddane działaniu induktora jak w krokach 2.1-2.5.</li>
	<li>Zbierz komórki MCF-7 lub T47D potraktowane induktorem, pipetując pożywkę przez warstwę komórkową 3-5 razy, aby odłączyć komórki. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować przy 300 x g i RT przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki z gotowym podłożem o stężeniu komórek 106/ml w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wybarwić komórki 3 μM kaspazą 3/7 Green Detection barwnikiem w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować przy 300 x g i RT przez 5 minut. Odrzucić supernatanty.</li>
	<li>Przemyć komórki 1 ml lodowatego PBS i odwirować w temperaturze 300 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatanty.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 100 μl buforu wiążącego anektynę, dodając 5 μl koniugatu aneksyny V i 1 μl roztworu roboczego 100 μg/ml PI na każde 100 μl zawiesiny komórkowej i inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
	nuta: Aneksyna V i PI są powszechnie używane razem do oznaczania komórek apoptotycznych w cytometrii przepływowej38,39,40.</li>
	<li>Dodać 400 μl buforu wiążącego aneksynę, delikatnie wymieszać. Utrzymuj próbki na lodzie przed uruchomieniem na cytometrze przepływowym.</li>
</ol>
5. Pomiar komórek CSC piersi za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zbierz odwrócony MCF-7 w obu grupach traktowanych induktorem lub rozpuszczalnikiem z 0,05% trypsyną-EDTA. Zbierz komórki T47D zarówno w grupach traktowanych induktorem, jak i rozpuszczalnikiem lub z 0,25% trypsyną-EDTA, jak w krokach od 1,2 do 1,5.</li>
	<li>Wybarwić komórki przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z fluorochromem przeciwko ludzkim CD44 (PerCP-Cy5.5) i CD24 (PE) jak w kroku 1.12. W międzyczasie przygotuj kontrolki izotypu, jak w kroku 1.13.</li>
	<li>Uruchom komórki na cytometrze przepływowym i wykryj procent komórek z markerami CD44+/CD24-.</li>
</ol>

<ol><li>McGuire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Cancer+Report+2014.+Geneva%2C+Switzerland%3A+World+Health+Organization%2C+International+Agency+for+Research+on+Cancer%2C+WHO+Press%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015.</a> Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).</li>
<li>Slamon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).</li>
<li>Geyer, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+plus+capecitabine+for+HER2-positive+advanced+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).</li>
<li>Cameron, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+III+randomized+comparison+of+lapatinib+plus+capecitabine+versus+capecitabine+alone+in+women+with+advanced+breast+cancer+that+has+progressedon+trastuzumab%3A+updatedefficacy+andbiomarker+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).</li>
<li>Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+poisons+as+antitumor+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).</li>
<li>Hertel, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+antitumor+activity+of+gemcitabine+%282%27%2C2%27-difluoro-2%27-deoxycytidine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine).</a> Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).</li>
<li>Ni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+nuclear+factor+kappa+B+%28NF-kappa+B%29+in+multiple+myeloma%3A+downregulation+of+NF-kappa+B+induces+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis.</a> British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).</li>
<li>Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bortezomib%3A+proteasome+inhibition+as+an+effective+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy.</a> Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Pirozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+cancer+stem+cells%2C+epithelial-mesenchymal+transition+and+circulating+tumor+cells+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer.</a> Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).</li>
<li>Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reversibility of apoptosis in cancer cells.</a> British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Tang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+survival%2C+DNA+damage%2C+and+oncogenic+transformation+after+a+transient+and+reversible+apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).</li>
<li>Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genistein+promotes+cell+death+of+ethanol-stressed+HeLa+cells+through+the+continuation+of+apoptosis+or+secondary+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis.</a> Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).</li>
<li>Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepG2+cells+recovered+from+apoptosis+show+altered+drug+responses+and+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+%26+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness.</a> Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CaspaseTracker+biosensor+system+for+detecting+anastasis+and+non-apoptotic+caspase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity.</a> Scientific Reports. 5, 9015(2015).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tracking+anastasis%2C+a+cell+survival+phenomenon+that+reverses+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+reversal+promotes+cancer+stem+cell-like+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation.</a> Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).</li>
<li>Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+anastasis+in+vivo+by+CaspaseTracker+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Li, J., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+apoptosis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Caspases in apoptosis and beyond.</a> Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).</li>
<li>Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+point+of+no+return%3A+mitochondria%2C+caspases%2C+and+the+commitment+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Cioffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+distinct+population+of+CD133%28%2B%29+CXCR4%28%2B%29+cancer+stem+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer.</a> Scientific Reports. 5, 10357(2015).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+stem+cells+transition+between+epithelial+and+mesenchymal+states+reflective+of+their+normal+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).</li>
<li>Sheridan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+CD24%28-%2Flow%29%2FCD44%2B+breast+cancer-initiating+cells+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine+induces+apoptosis+through+both+caspase-dependent+and+caspase-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms.</a> Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).</li>
<li>Saunders, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+in+MCF-7+breast-cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells.</a> International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).</li>
<li>Miller, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+is+BAK-dependent%2C+but+BAX+and+BIM-independent+in+breast+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor.</a> PLoS One. 8 (4), e60685(2013).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Ng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+voltage-gated+potassium+channels+in+the+fate+determination+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).</li>
<li>Lo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV3+channel+negatively+regulates+cell+cycle+progression+and+safeguards+the+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).</li>
<li>Talanian, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+caspase+family+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of caspase family proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activity+defines+colon+cancer+stem+cells+and+is+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Desiderio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fucosylation+has+a+pivotal+role+in+invasive+and+metastatic+properties+of+head+and+neck+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells.</a> Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).</li>
<li>Gupta, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+State+Transitions+Give+Rise+to+Phenotypic+Equilibrium+in+Populations+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells.</a> Cell. 146 (4), 633-644 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje bezpośredni i jasny sposób wykrywania przejścia komórek niemacierzystych raka piersi w komórki podobne do CSC piersi w wyniku odwrócenia apoptozy. Potwierdzenie właściwości CSC tych odwróconych komórek może być wspomagane przez zastosowanie testu tworzenia mammosfery invitro i przeszczepu ksenoprzeszczepu in vivo u myszy z niedoborem odporności 18,24,26,27,42,43,44,45<sup class="...

Rak jest główną przyczyną zgonów, powodując duże obciążenie dla krajów na całym świecie1. Rak piersi plasuje się wysoko zarówno pod względem zachorowalności, jak i śmiertelności u kobiet wśród wszystkich rodzajów raka1. Ze względu na niejednorodność nowotworów, w chemioterapii zwykle stosuje się kombinację leków w celu osiągnięcia śmierci komórek rakowych2,3,4. Ponieważ jednak popularne leki chemioterapeutyczne często celują w DNA5,6, synteza białek7,8 i/lub dynamika mikrotubul9, szybko rosnące komórki są najbardziej dotknięte, podczas gdy komórki w stanie spoczynku, takie jak rakowe komórki macierzyste (CSC), są zwykle mniej dotknięte10. W związku z tym CSC mają większe szanse na przeżycie po leczeniu, które później prowadzi do oporności na leki i nawrotu raka10,11. W związku z tym eliminacja CSC stała się ważnym tematem w leczeniu nowotworów i konieczne jest badanie pochodzenia CSC.
W ciągu ostatniej dekady przeprowadzono więcej badań nad zjawiskiem odwrócenia apoptozy12,13,14,15,16,17,18,19. Przed pojawieniem się tej koncepcji powszechnie akceptowano, że komórki nieodwracalnie ulegną apoptozie po aktywacji kaspazy. Kaspazy to rodzina enzymów białkowych, które odgrywają kluczową rolę w etapach inicjacji i realizacji apoptozy, w tym w tworzeniu kompleksu apoptotycznego i rozszczepianiu dalszych substratów20. Aktywacja kaspaz egzekucyjnych, takich jak kaspaza 3 lub kaspaza 7, została uznana za "punkt bez powrotu" dla apoptozy21. Jednak naukowcy zaobserwowali niedawno, że odwrócenie apoptozy następuje zarówno in vitro, jak i in vivo, podczas którego komórki mogą odzyskać sprawność po apoptozie nawet po aktywacji kaspazy12,13,14,15,16,17,18,19. Co więcej, agresywne cechy, takie jak wyższa odporność na oryginalny induktor apoptozy i większa inwazyjność, są wykrywane w odwróconych komórkach nowotworowych15. W związku z tym zaproponowano, że odsetek komórek podobnych do CSC byłby wyższy w odwróconej populacji w porównaniu z komórkami nieleczonymi, co ostatecznie przyczyniłoby się do bardziej złośliwych cech po odwróceniu apoptozy18.
Poprzednio podjęto wiele wysiłków, aby śledzić odwrócenie apoptozy in vitro, a co ważniejsze, in vivo, co bardzo pomaga w potwierdzeniu uniwersalności tego procesu16,17,19. Brakuje jednak ogólnoustrojowych badań nad konsekwencjami odwróconych komórek ze względu na niezadowalającą izolację komórek, które rzeczywiście przeszły odwrócenie apoptozy. Istnieje potrzeba pozyskania czystych komórek apoptotycznych i odzyskania ich do dalszych badań. W związku z tym używamy tradycyjnie dobrze akceptowanego markera aktywacji kaspazy kata jako markera "punktu bez powrotu"21 dla apoptozy i wykorzystujemy sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do rozróżniania komórek aktywowanych kaspazą wybarwionych barwnikiem kaspazy-3/7 Green Detection. Barwnik jest kowalencyjnie połączony z krótką sekwencją aminokwasów, DEVD, która może być rozpoznana i rozszczepiona przez aktywne kaspazy 3/7. Rozszczepienie pomaga uwolnić barwnik, który przemieszcza się z cytozolu do jądra, gdzie wiąże się z DNA i emituje silną fluorescencję. Ta procedura pozwala uniknąć użycia masowej populacji komórek, w której niektóre komórki mogły nie zostać poddane apoptozie.
CSC lub komórki inicjujące nowotwór zostały zidentyfikowane w wielu guzach litych przy użyciu jednego lub kombinacji kilku markerów powierzchniowych, a bardzo niewiele tych komórek jest wystarczających do powstania guzów u myszy z niedoborem odporności22,23,24,25,26,27. Kombinacja CD44 i CD24 była powszechnie stosowana w badaniach CSC piersi, a komórki CD44+/CD24- zostały zdefiniowane jako CSCs piersi26,27,28,29,30. Ostatnio przeprowadziliśmy serię eksperymentów, aby potwierdzić proponowany związek między odwróceniem apoptozy a CSC i wykazać, że odwrócone komórki raka piersi uzyskały zwiększoną zdolność do tworzenia guza in vitro i in vivo z podwyższonym odsetkiem komórek z markerami CSC18. Chociaż nie mogliśmy wykluczyć możliwości, że CSC piersi przetrwają lepiej, a tym samym wzbogacą się po odwróceniu apoptozy, co ważne, gdy wyizolujemy komórki raka innego niż macierzyste i poddamy je odwróceniu apoptozy, CSC pojawi się w populacji komórek pierwotnie niebędących komórkami raka macierzystego, co sugeruje, że komórki niebędące komórkami raka macierzystego mogą przyczyniać się do wzrostu odsetka CSC podczas odwrócenia apoptozy.
Ten artykuł ma na celu pokazanie przejścia od komórek niemacierzystych raka piersi do komórek podobnych do komórek CSC piersi po odwróceniu apoptozy i wykrycie tego przejścia za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki raka piersi niebędące komórkami macierzystymi są początkowo przygotowywane przez wyizolowanie komórek raka piersi CD44-/CD24+ za pomocą FACS. Następnie indukowana jest apoptoza, która jest potwierdzana zmianami morfologicznymi pod mikroskopem. Następnie komórki apoptotyczne pozytywnie znakowane barwnikiem Caspase 3/7 Green Detection są izolowane przez FACS i dalej hodowane przy braku induktorów apoptozy w celu odwrócenia apoptozy. Odwrócone komórki są następnie barwione markerami CSC po 7 dniach od wyzdrowienia w celu analizy cytometrii przepływowej. Komórki z markerami CD44 + / CD24- pojawiają się ponownie w odwróconej populacji, co sugeruje, że przejście z komórek raka niemacierzystego do komórek podobnych do CSC nastąpiło podczas odwrócenia apoptozy.
Odwrócenie apoptozy zaobserwowano w wielu liniach komórek rakowych, jak również w normalnych komórkach pierwotnych leczonych różnymi bodźcami apoptozy in vitro12,13. Proces ten został również prześledzony w modelu Drosophila in vivo16,17,19. Wiele informacji na temat mechanizmu leżącego u podstaw nawrotu choroby nowotworowej w różnych modelach choroby nowotworowej oraz pochodzenia CSC można uzyskać dzięki zastosowaniu techniki opisanej w tym manuskrypcie.

<table><tbody><tr><td>MCF-7</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td><td>HTB-133</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,05% trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 koniugat aneksyny V</td><td>Invitrogen</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent kaspaza-3/7 zielony barwnik fluorescencyjny</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fc blok</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td>inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>USB</td><td>16926</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td> Przeciwciała monoklonalne <td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>przeciwko ludzkiemu CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>555428</td><td>PE Klon: ML5 Partia: 5049759 RRID: AB_395822</td></tr><tr><td>przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5 Klon: G44-26 Partia: 7230770 RRID:AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>paklitaksel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz IgG2a, &kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>klon: G155-178 (RUO) RRID:AB_395491</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Mysz IgG2b, &kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>klon: 27-35 RRID:</td></tr> sól <tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanem</td> AB_647257 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>jodek propidium</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 podłoże</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td>fenol</td></tr><tr><td>azydek sodu</td> bez czerwieni <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>staurosporyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm naczynie hodowlane</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Cell Sitko 40 &mu; m siatka nylonowa</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania FACSuite v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny FluoView FV1000</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>60X obiektyw</td></tr><tr><td>FV10-ASW Przeglądarka Ver.4.2b</td><td></td><td></td> Polistyren okrągłodenny Olympus <td></td></tr><tr><td>12 &czasy; Rurki 75 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Sorter S3e</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Nawrót raka jest od dawna badany przez onkologów, podczas gdy mechanizmy leżące u jego podstaw pozostają niejasne. Niedawno my i inni odkryliśmy, że zjawisko zwane odwróceniem apoptozy prowadzi do zwiększonej rakotwórczości w różnych modelach komórkowych pod wpływem różnych bodźców. Wcześniejsze badania koncentrowały się na śledzeniu tego procesu in vitro i in vivo; Jednak izolacja prawdziwych odwróconych komórek nie została jeszcze osiągnięta, co ogranicza naszą wiedzę na temat konsekwencji odwrócenia apoptozy. Tutaj wykorzystujemy barwnik Caspase-3/7 Green Detection do znakowania komórek aktywowanymi kaspazami po indukcji apoptozy. Komórki z sygnałami dodatnimi są dalej sortowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w celu odzyskania. Badanie morfologiczne pod mikroskopią konfokalną pomaga potwierdzić stan apoptozy przed FACS. Wzrost rakotwórczości można często przypisać zwiększeniu odsetka komórek podobnych do rakowych komórek macierzystych (CSC). Ponadto, biorąc pod uwagę niejednorodność raka piersi, identyfikacja pochodzenia tych komórek podobnych do CSC miałaby kluczowe znaczenie w leczeniu raka. W ten sposób przygotowujemy komórki raka piersi niebędące komórkami macierzystymi przed wywołaniem apoptozy, wyizolowaniem komórek aktywowanych kaspazą i przeprowadzeniem procedury odwrócenia apoptozy. Analiza cytometrii przepływowej ujawnia, że komórki podobne do CSC piersi pojawiają się ponownie w odwróconej grupie, co wskazuje, że komórki podobne do CSC piersi są tranzycowane z komórek raka piersi innych niż macierzysty podczas odwrócenia apoptozy. Podsumowując, protokół ten obejmuje izolację apoptotycznych komórek raka piersi i wykrywanie zmian procentowego CSC w odwróconych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Aby zaobserwować przejście z nieplemiennych komórek raka piersi w komórki raka piersi o charakterystyce CSC, konieczne było przeprowadzenie wstępnego sortowania komórek raka piersi CD44-/CD24+. W przypadku linii komórkowej MCF-7, w której w populacji wyjściowej znajduje się około 0,15% komórek z markerami CSC (Rycina 1), krok ten pomógł wykluczyć możliwość wzbogacenia frakcji CSC podczas odwracania procesu apoptozy. Z kolei w przypadku b...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek apoptotycznego raka piersi poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i dalsze wykrywanie przejścia komórek raka piersi niebędących komórkami macierzystymi do komórek podobnych do komórek macierzystych raka piersi po odwróceniu apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Izolacje prawdziwych populacji komórek odwracających apoptozę były już wcześniej problemem, co znacznie ogranicza nasze zrozumienie konsekwencji odwrócenia apoptozy. Protokół ten pozwala nam wygenerować czystsze populacje komórek odwrócenia apoptozy. Główną zaletą tej techniki jest to, że używane materiały i sprzęt są powszechnie dostępne w różnych instytucjach.Technika ta jest łatwo stosowana do izolowania czystszych populacji komórek, które przeszły odwrócenie apoptozy. Jak wcześniej informowano, normalne komórki mogą również ulec odwróceniu apoptozy, co oznacza, że oprócz komórek raka piersi można uruchomić różne komórki chemioterapii, a także normalne komórki, i wykorzystać różne bodźce apoptotyczne. Ponieważ odwrócona komórka przeszła apoptozę i szybkie sortowanie, wskaźnik odzysku jest zwykle niski.Większa początkowa liczba komórek jest rekombinowana w celu zwiększenia końcowej wydajności. Na początek kultura MCF-7, MDA-MB-231, Na początek hodowla komórek MCF-7, MDA-MB-231 i T47D, zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dwukrotnie umyj komórki PBS, a następnie dodaj dwa mililitry 0,05 procent trypsyny-EDTA 0,05 procent trypsyny-EDTA do komórek MCF-7 i MDA-MB-231 do komórek MCF-7 i MDA-MB-231 oraz dwa mililitry 0,25 procent trypsyny-EDTA i dwa mililitry 0,25 procent trypsyny-EDTA do komórek T47D.do komórek T47D. Hoduj komórki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Podczas inkubacji komórek sprawdź oderwanie komórek pod mikroskopem, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu przez trypsynę-EDTA.Gdy ponad 90 procent komórek odłączy się, dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki RPMI do naczynia i kilkakrotnie pipetuj ją po powierzchni warstwy komórek. Następnie przenieś komórki do 15-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj. Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulki z buforem FACS w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek.Następnie podziel komórki na kilka probówek. Ponownie odwirować probówki i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj rozcieńczony blok Fc do próbek.Próbki należy inkubować na lodzie w ciemności przez 20 minut, a następnie ponownie odwirować próbki. Następnie wyrzuć supernatant. Następnie dodaj sprzężone z fluorochromem przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD44 i CD24 przeciwko ludzkiemu CD44 i CD24, w rozcieńczeniach odpowiednio jeden do 40 i od jednego do 10 do grup podwójnego barwienia.W przypadku kontroli pozytywnych dodać przeciwciała CD44 W przypadku kontroli pozytywnych dodać przeciwciała CD44 do komórek MDA-MB-231, do komórek MDA-MB-231 oraz przeciwciała CD24 do komórek MCF-7 i przeciwciała CD24 do komórek MCF-7 odpowiednio w jednym do 40 i jednym do 10 rozcieńczeniach. Dodaj PerCP-Cy5.5 Mysz IgG2b Kappa, Dodaj PerCP-Cy5.5 Mysia IgG2b Kappa, rozcieńczony w stosunku 1 do 40 do komórek jako kontrola izotopowa dla przeciwciał CD44. Następnie dodaj PE Mouse IgG2a Kappa, a następnie dodaj PE Mouse IgG2a Kappa, rozcieńczony w stosunku od 1 do 10 do komórek jako kontrolę izotopową dla przeciwciał CD24.Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 30 minut. Następnie odwirować próbki w temperaturze 300 g, a następnie odwirować próbki w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć osad w 500 mikrolitrach PBS.Następnie powtórz wirowanie, jak opisano wcześniej. Ponownie zawiesić granulat na 0,5 mililitra PBS i przefiltrować zawiesinę przez nylonową siatkę o grubości 40 mikrometrów. Następnie przepuść zawiesinę przez aktywowany fluorescencją sortownik komórek.Zebrać komórki z markerami CD44 ujemnymi i CD24 dodatnimi w probówkach okrągłodennych zawierających jeden mililitr pożywki zbiorczej. Następnie odwirować probówki i wyrzucić supernatant. Następnie umieść posortowane komórki raka piersi niebędące komórkami macierzystymi w naczyniu hodowlanym zawierającym świeżą pożywkę do dalszej hodowli.Najpierw użyj jednej milimolowej staurosporyny w DMSO, Aby przygotować 2,5 mikromolowej staurosporyny w pożywce, zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie usuń pożywkę hodowlaną z komórek. Umyj komórki dwoma mililitrami PBS raz, a następnie dodaj 10 mililitrów pożywki staurosporyny do komórek MSF-7 przez sześć godzin, aby wywołać apoptozę, gdy komórki są w 70 procentach zlewne.Następnie przygotuj jeden milimolowy paklitaksel w DMSO. Następnie dodaj 12,5 mikrolitra Następnie dodaj 12,5 mikrolitra 1 milimolowego paklitakselu do gotowego podłoża komórek T47D, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Usuń pożywkę hodowlaną z komórek i umyj komórki 2 mililitrami PBS.Następnie dodaj pożywkę paklitakselu do komórek na 10 godzin, aby wywołać apoptozę na 10 godzin, aby wywołać apoptozę, gdy komórki osiągną 70-procentową konfluencję. Następnie usuń pożywkę z grupy MCF-7 potraktowanej rozpuszczalnikiem i umyj je dwoma mililitrami PBS. Następnie dodaj 10 mililitrów 0,25 procent pożywki DMSO Następnie dodaj 10 mililitrów 0,25 procent pożywki DMSO przez sześć godzin jako kontrolę rozpuszczalnika dla staurosporyny.Usunąć pożywkę hodowlaną z grupy T47D poddanej działaniu rozpuszczalnika i przemyć komórki dwoma mililitrami PBS. Następnie dodaj 10 mililitrów 0,05 procent pożywki DMSO Następnie dodaj 10 mililitrów 0,05 procent pożywki DMSO przez 10 godzin jako kontrolę rozpuszczalnika dla paklitakselu. Następnie wybarwić komórkę i inkubować ją przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla.Użyj 60-krotnego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, aby zaobserwować zmiany morfologiczne leczonych komórek. Wybarwić zarówno induktor apoptozy, jak i komórki MCF-7 i T47D potraktowane rozpuszczalnikiem oraz komórki MCF-7 i T47D potraktowane rozpuszczalnikiem w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Za pomocą aktywowanego fluorescencją sortera komórek zbierz dodatnie komórki z grup traktowanych induktorem w probówkach z okrągłym dnem zawierających jeden mililitr pożywki zbiorczej.Następnie odwirować probówki zgodnie z wcześniejszym opisem i wyrzucić supernatant. Zebrać komórki ujemne z grup potraktowanych rozpuszczalnikiem w probówkach okrągłodennych z jednym mililitrem pożywki zbiorczej. Odwirować probówki i wyrzucić supernatant.Następnie ponownie zawieś posortowane komórki na świeżym podłożu zbiorczym. Wysiewaj komórki na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i hoduj je przez siedem dni w celu odwrócenia apoptozy. Zbierz odwrócony MCF-7 zarówno w grupie potraktowanej induktorem, jak i rozpuszczalnikiem z 0,05 procentami trypsyny-EDTA.z 0,05 procentami trypsyny-EDTA. Następnie zbierz komórki T47D w obu induktorach Następnie zbierz komórki T47D zarówno w grupie induktora, jak i rozpuszczalnika z 0,25 procent trypsyny-EDTA. Wybarwić komórki przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z fluorochromem przeciwko ludzkim CD44 i CD24.Podczas gdy komórki barwią, przygotuj kontrole izotypu, jak pokazano wcześniej. Na koniec uruchom komórki na cytometrze przepływowym i wykryj odsetek komórek z markerami CD44 dodatnimi i ujemnymi CD24. W tym protokole zaobserwowano przejście od komórek niemacierzystych raka piersi do komórek podobnych do CSC piersi.Izolację komórek nowotworowych innych niż macierzysta po raz pierwszy przeprowadzono w komórkach MCF-7. Typowe zmiany morfologiczne zaobserwowano po dodaniu induktorów apoptozy, a komórki odzyskały się z apoptozy o podobnej morfologii po odstawieniu leku. Komórki aktywowane caspace zostały oznaczone i posortowane na podstawie ich wyższej intensywności fluorescencji niż komórki bez aktywacji caspace.Podczas procesu indukcji apoptotycznej użyto rozpuszczalnika, aby wykluczyć możliwość, że przyczyną przejścia była procedura faktów lub sam rozpuszczalnik. Stwierdzono, że komórki aktywowane Caspace w grupach leczonych induktorem apoptozy były nexin five dodatnie i PI ujemne, co sugeruje, że były to komórki apoptotyczne. Komórki apoptotyczne zebrano i wyhodowano w celu wyzdrowienia, w porównaniu z grupami traktowanymi rozpuszczalnikiem, analiza cytometrii przepływowej wykazała, że w odwróconej pierwotnie populacji komórek raka piersi niemacierzystych pojawiły się komórki pojawiające się w kwadrancie CD44 dodatnim i ujemnym CD24.Przyrząd pomiarowy jest ważny w analizie przepływu i sortowaniu komórek, dlatego w laboratoriach należy przygotować odpowiednią kontrolę. Ponieważ ta procedura odwrócenia apoptozy in vitro izoluje czyste apoptotyczne komórki rakowe, można przeprowadzić eksperymenty, takie jak aktywa nowotworzenia in vivo, aby zrozumieć konsekwencje rzeczywistego odwrócenia komórek. Technika ta rzuca światło na przyczynę nawrotu raka, dlatego można ją zbadać, aby potencjalnie zapobiec ponownemu wystąpieniu choroby u pacjentów z rakiem.Pamiętaj, aby odpowiednio zabezpieczyć się podczas przeprowadzania eksperymentów z hodowlami komórkowymi zgodnie z przepisami dotyczącymi poziomu bezpieczeństwa biologicznego w Twojej instytucji.

flow-cytometric-detection-newly-formed-breast-cancer-stem-cell-like

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie opisujemy izolację subpopulacji komórek macierzystych nowotworowych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją lub FACS. Wyizolowaną populację boczną komórek można wykorzystać do dalszej analizy.

Test dyskryminacji populacji po stronie raka: metoda izolowania rakowych komórek macierzystych za pomocą testu wypływu barwnika Hoechsta

Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom.  Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Ta procedura pokaże, jak zsyntetyzowaliśmy i scharakteryzowaliśmy aktywność anty-NFκB i przeciwnowotworowych komórek macierzystych proleku aspiryny-fumaranu.

Synteza i charakterystyka proleku fumaranu aspiryny, który hamuje aktywność NFκB i komórki macierzyste raka piersi

Metody pozwalające na charakterystykę i izolację populacji komórek macierzystych z próbek biologicznych są kluczowe dla rozwoju terapii komórek macierzystych w leczeniu raka i nie tylko. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji nowotworowych komórek macierzystych przy użyciu fenotypu populacji bocznej wywołanego barwnikiem.

Wykorzystanie fenotypu populacji bocznej wyzwalanego barwnikiem DNA do wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Apoptozę można scharakteryzować za pomocą analizy cytometrycznej wczesnych i późnych biomarkerów apoptozy. Linię komórkową raka szyjki macicy, SiHa, analizowano pod kątem biomarkerów apoptozy po leczeniu aktynomycyną D przy użyciu laboratoryjnego cytometru przepływowego.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D

Użyliśmy barwienia proliferacji komórek, aby zidentyfikować komórki w stanie spoczynku w modelu T-ostrej białaczki limfoblastycznej u danio pręgowanego. Barwnik jest zatrzymywany w komórkach niedzielących się i redukowany podczas proliferacji komórek, co umożliwia selekcję uśpionych komórek do dalszego badania. Protokół ten zapewnia funkcjonalne narzędzie do badania samoodnowy w kontekście spoczynku komórkowego.

Identyfikacja komórek w stanie spoczynku w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej limfocytów T danio pręgowanego za pomocą barwienia proliferacji komórek

Ten protokół opisuje metodę ustawiania assayu formacji mammosfer w celu badania inhibitora apoptozy 5 (Api5) wywołanej skurczliwości komórek macierzystych raka w nienowotworowych komórkach nabłonkowych piersi. Lizat zebrany z mammosfer pierwszej generacji jest analizowany pod kątem różnych markerów skurczliwości w celu oceny indukcji właściwości przypominających komórki macierzyste.

Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do wykrywania nowo powstałych komórek macierzystopodobnych po odwróceniu apoptozy w komórkach raka piersi. Technika FACS umożliwia izolację czystych populacji komórek.

Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy

Przeglądaj więcej filmów