Name: Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę CZE-ESI-MS/MS do dużoskalowej analizy proteoform z wysoką rozdzielczością. Technika ta umożliwia efektywną separację i czułą detekcję intaktywnych białek z modyfikacjami potranslacyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują grupie Heedeoka Honga z Wydziału Chemii Uniwersytetu Stanowego Michigan za uprzejme dostarczenie komórek Escherichia coli do eksperymentów. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych, Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) poprzez Grant R01GM118470 (dla X. Liu) i Grant R01GM125991 (dla L. Sun i X. Liu).

<ol><li>Aebersold, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteoforms+are+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How many proteoforms are there.</a> Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).</li>
<li>Catherman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+Top-down+Proteomics+of+the+Human+Proteome%3A+Membrane+Proteins%2C+Mitochondria%2C+and+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-Down+Proteomics+of+Large+Proteins+up+to+223+kDa+Enabled+by+Serial+Size+Exclusion+Chromatography+Strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).</li>
<li>Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+Top-Down+Proteomics+and+the+Analysis+of+Proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).</li>
<li>Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Zone+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capillary Zone Electrophoresis.</a> Science. 222 (4621), 266-272 (1983).</li>
<li>Keithley, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+with+three-color+fluorescence+detection+for+the+analysis+of+glycosphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism.</a> Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Line+Separation+by+Capillary+Electrophoresis+Prior+to+Analysis+by+Top-Down+Mass+Spectrometry+Enables+Sensitive+Characterization+of+Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).</li>
<li>Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+and+Fast+Bottom-up+Analysis+of+Femtogram+Amounts+of+Complex+Proteome+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).</li>
<li>Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Peptide+Detection+Toward+Single-Neuron+Proteomics+by+Reversed-Phase+Fractionation+Capillary+Electrophoresis+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).</li>
<li>Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Top-Down+Intact+Protein+Characterization+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+comprehensiveness+and+sensitivity+of+sheathless+capillary+electrophoresis-tandem+mass+spectrometry+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachable+strong+cation+exchange+monolith%2C+integrated+with+capillary+zone+electrophoresis+and+coupled+with+pH+gradient+elution%2C+produces+improved+sensitivity+and+numbers+of+peptide+identifications+during+bottom-up+analysis+of+complex+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+10%2C000+peptide+identifications+from+the+HeLa+proteome+by+using+single-shot+capillary+zone+electrophoresis+combined+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).</li>
<li>Aebersold, R., Morrison, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dilute+peptide+samples+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).</li>
<li>Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Focusing+of+Catecholamines+and+Weakly+Acidic+Compounds+by+Capillary+Electrophoresis+Using+a+Dynamic+pH+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction.</a> Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).</li>
<li>Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+Capillary+Zone+Electrophoresis+to+a+Q+Exactive+HF+Mass+Spectrometer+for+Top-down+Proteomics%3A+580+Proteoform+Identifications+from+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).</li>
<li>Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-Up+Proteomics+of+Escherichia+coli.+Using+Dynamic+pH+Junction+Preconcentration+and+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).</li>
<li>Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Shot+Top-Down+Proteomics+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nearly+600+Escherichia+coli+Proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).</li>
<li>Busnel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+capacity+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization+mass+spectrometry%3A+coupling+a+porous+sheathless+interface+with+transient-isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).</li>
<li>Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Confined+Aqueous+Reversible+Addition-Fragmentation+Chain+Transfer+%28SCARAFT%29+Polymerization+Method+for+Preparation+of+Coated+Capillary+Leads+to+over+10+000+Peptides+Identified+from+25+ng+HeLa+Digest+by+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).</li>
<li>Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally-initiated+free+radical+polymerization+for+reproducible+production+of+stable+linear+polyacrylamide+coated+capillaries%2C+and+their+application+to+proteomic+analysis+using+capillary+zone+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry.</a> Talanta. 146, 839-843 (2016).</li>
<li>Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00169a022">Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).</li>
<li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+CE-MS+Operation.+2.+Interfacing+Low-Flow+Separation+Techniques+to+Mass+Spectrometry+Using+a+Porous+Tip%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip.</a> Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).</li>
<li>Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+capillary+electrophoresis+nanospray+sheath-flow+interface+for+high+efficiency+and+sensitive+peptide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).</li>
<li>Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-Generation+Electrokinetically+Pumped+Sheath-Flow+Nanospray+Interface+with+Improved+Stability+and+Sensitivity+for+Automated+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry+Analysis+of+Complex+Proteome+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).</li>
<li>McCool, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Top-Down+Proteomics+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry%3A+Identification+of+5700+Proteoforms+from+the+Eschericia+coli+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).</li>
<li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoWizard%3A+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li>
<li>TopPIC Suite. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/">http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/</a> (2017).</li>
<li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopPIC+%3A+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Methods - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/">http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/</a> (2018).</li>
<li>Software - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.topdownproteomics.org/resources/software/">http://www.topdownproteomics.org/resources/software/</a> (2018).</li>
<li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+proteomics+reveals+a+unique+protein+S-thiolation+switch+in+Salmonella+Typhimurium+in+response+to+infection-like+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultrahigh-pressure+long+column+reversed-phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).</li>
<li>Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-energy+C-trap+dissociation+for+peptide+modification+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis.</a> Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).</li>
<li>Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+protein+sequence+analysis+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).</li>
<li>Shaw, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Protein+Characterization+Using+Top-Down+Mass+Spectrometry+and+Ultraviolet+Photodissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania CZE-MS/MS do charakterystyki proteoform w wysokiej rozdzielczości w prostych próbkach białkowych oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomu. Schemat systemu CZE-ESI-MS/MS przedstawiono na rysunku 1. W protokole znajdują się cztery kluczowe kroki. Po pierwsze, niezwykle ważne jest przygotowanie wysokiej jakości powłoki LPA na wewnętrznej ścianie kapilary separacyjnej. Kapilara separacyjna pokryta ...

Proteomika odgórna (TDP) ma na celu scharakteryzowanie proteoform w proteomie na dużą skalę. TDP opiera się na efektywnym rozdzielaniu nienaruszonych białek w fazie ciekłej przed analizą ESI-MS/MS (ESI-MS/MS) za pomocą efektywnej separacji faz ciekłych i fazy ciekłej przed analizą metodą tandemowej spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną (ESI-MS/MS) ze względu na wysoką złożoność i duży zakres dynamiki stężeń proteomu<><>="xref"<> 5. Elektroforeza w strefie kapilarnej (CZE) jest potężną techniką rozdzielania biomolekuł na podstawie ich stosunku wielkości do ładunku6. CZE jest stosunkowo proste, wymaga jedynie otwartej kapilary krzemionkowej z rurką, elektrolitu tła (BGE) i zasilacza. Próbka nienaruszonych białek może zostać załadowana do kapilary za pomocą ciśnienia lub napięcia, a separacja jest inicjowana przez zanurzenie obu końców kapilary w BGE i przyłożenie wysokiego napięcia. CZE może zbliżyć się do ultra-wysokiej wydajności separacji (> miliona teoretycznych płytek) do separacji biomolekuł7. CZE-MS ma znacznie wyższą czułość niż powszechnie stosowana chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (RPLC)-MS do analizy nienaruszonych białek8. Chociaż CZE-MS ma ogromny potencjał w zakresie proteomiki odgórnej na dużą skalę, jej szerokie zastosowanie w proteomice zostało utrudnione przez kilka problemów, w tym niską zdolność ładowania próbek i wąskie okno separacji. Typowa objętość obciążenia próbki w CZE wynosi około 1% całkowitej objętości kapilarnej, co zwykle odpowiada mniej niż 100 nL9,10,11. Okno separacji CZE jest zwykle krótsze niż 30 minut ze względu na silny przepływ elektroosmotyczny (EOF)9,10. Zagadnienia te ograniczają CZE-MS/MS do identyfikacji dużej liczby proteoform i mało obfitych proteoform ze złożonego proteomu.
Wiele wysiłku włożono w poprawę objętości ładowania próbki CZE za pomocą metod koncentracji próbek online (np. mikroekstrakcja w fazie stałej [SPME]12,13, układanie próbek w terenie [FESS]9,11,14 i dynamiczne połączenie pH15,16,17,18). FESS i dynamiczne złącze pH są prostsze niż SPME, wymagają jedynie znacznej różnicy między buforem próbki a BGE pod względem przewodności i pH. FESS wykorzystuje bufor próbki o znacznie niższej przewodności niż BGE, co prowadzi do układania analitów na granicy między strefą próbki a strefą BGE w kapilarze. Dynamiczne złącze pH wykorzystuje zasadową zatyczkę próbki (np. 50 mM wodorowęglanu amonu, pH 8) i kwaśny BGE (np. 5% [v/v] kwas octowy, pH 2,4) po obu stronach korka próbki. Po przyłożeniu wysokiego napięcia dodatniego na końcu iniekcji kapilary, następuje miareczkowanie korka próbki podstawowej, skupiając anality w szczelnym korku przed poddaniem ich separacji CZE. Ostatnio grupa Sun systematycznie porównywała FESS i dynamiczne połączenie pH dla układania w stos online nienaruszonych białek, wykazując, że dynamiczne połączenie pH może zapewnić znacznie lepszą wydajność niż FESS dla stężenia online nienaruszonych białek, gdy objętość wstrzyknięcia próbki wynosiła 25% całkowitej objętości kapilary19.
Neutralnie powlekane kapilary separacyjne (np. liniowy poliakrylamid [LPA]) zostały zastosowane w celu zmniejszenia EOF w kapilarze, spowalniając separację CZE i poszerzając okno separacji20,21. Niedawno grupa Dovichi opracowała prostą procedurę przygotowania stabilnej powłoki LPA na wewnętrznej ścianie naczyń włosowatych, wykorzystując nadsiarczan amonu (APS) jako inicjator i temperaturę (50 °C) do produkcji wolnych rodników i polimeryzacji22. Całkiem niedawno grupa Sun zastosowała kapilarnę separacyjną pokrytą LPA i metodę dynamicznego połączenia pH do separacji CZE nienaruszonych białek, osiągając objętość ładowania próbki w skali mikrolitrów i 90-minutowe okno separacji19. Ten system CZE otwiera drzwi do wykorzystania CZE-MS/MS w proteomice odgórnej na dużą skalę.
CZE-MS wymaga bardzo solidnego i czułego interfejsu do połączenia CZE z MS. Trzy interfejsy CE-MS zostały dobrze rozwinięte i skomercjalizowane w historii CE-MS, a są to współosiowy interfejs przepływu osłony23, interfejs bez osłony wykorzystujący porowatą końcówkę jako emiter ESI24, oraz elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu płaszcza25,26. Pompowany elektrokinetycznie interfejs przepływu osłonki CZE-MS/MS osiągnął niską granicę wykrywalności peptydów zeptomole9, ponad 10 000 identyfikacji peptydów (ID) z proteomu komórkowego HeLa w jednym przebiegu14, szybka charakterystyka nienaruszonych białek11, oraz wysoce stabilne i powtarzalne analizy biomolekuł26. Ostatnio kapilara separacyjna pokryta LPA, metoda dynamicznego połączenia pH i elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu osłonki zostały wykorzystane do proteomiki na dużą skalę prote<omiki Escherichia coli (E. coli) proteomu Escherichia coli (E. coli) class="xref">19,27. Platforma CZE-MS/MS zbliżyła się do ponad 500 identyfikatorów proteoform w jednym przebiegu19 i prawie 6 000 identyfikatorów proteoform poprzez sprzężenie z chromatografią wykluczania wielkości (SEC)-frakcjonowanie RPLC27. Wyniki wyraźnie wskazują na możliwości CZE-MS/MS w proteomice odgórnej na dużą skalę.
Tutaj opisana jest szczegółowa procedura użycia CZE-MS/MS do proteomiki na dużą skalę z góry na dół. System CZE-MS/MS wykorzystuje kapilarnę pokrytą LPA w celu redukcji EOF w kapilarze, metodę dynamicznego połączenia pH do koncentracji białek w trybie online, elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu osłonki do sprzężenia CZE z MS, spektrometr masowy orbitrap do zbierania widm białek MS i MS/MS oraz oprogramowanie TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform Identification and Characterization) do identyfikacji proteoform poprzez wyszukiwanie w bazie danych.

<table><tbody><tr><td>Kapilara ze stopionej krzemionki</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td>50 & mikro; m i.d. 360 & mikro; m o.d.</td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>woda klasy LC-MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA48-1</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td>Toksyczny, Zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6514</td><td>Wrażliwy na wilgoć i ciepło</td></tr><tr><td>Kwas fluorowodorowy</td><td>Acros Organics</td><td>423805000</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Toksyczny, zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Zagrożenie dla zdrowia, Lizozym utleniacza</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Mioglobina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-kazeina</td><td>Sgma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Anhydraza węglanowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3934</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Alfa Aesar</td><td>36428-36</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>Zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122270250</td><td>Zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>, zagrażająca zdrowiu</td></tr><tr><td>kolumna pułapki C4</td><td>Sepax Technologies</td><td>110043-4001C</td><td>3 i mikro; m cząstki, 300 i Aring; pory, średnica wewnętrzna 4,0 mm o długości 10 mm</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>Toksyczny, utleniacz</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1066-33-7</td><td></td></tr><tr><td>Filtry szybkoprzepływowe Nalgene</td><td>Thermo Scientific</td><td>126-0020</td><td>0,2 i mikro; m błona CN i</td></tr><tr>komórki <td></td><td></td><td>E. coli</td> o średnicy 50 mm <td>K-12 MG1655</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td> Test BCA <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td> System HPLC <td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td></td></tr><tr><td>do odsalania białek</td><td>Agilient</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny podajnik próbek CE</td><td>CMP Scientific</td><td>ECE-001</td><td></td></tr><tr><td>Elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu w osłonie</td><td>CMP Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hybrydowy kwadrupolowo-orbitrapowy spektrometr masowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutter płonący/brązowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy zakłócacz komórek do lizy komórek</td><td>Branson</td><td>101063196</td><td>Model S-250A</td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD131DDA-115</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Spektrometria mas w strefie kapilarnej-jonizacja elektronatryskowa (CZE-ESI-MS/MS) została uznana za użyteczne narzędzie do proteomiki odgórnej, która ma na celu scharakteryzowanie proteoform w złożonych proteomach. Jednak zastosowanie CZE-MS/MS w proteomice odgórnej na dużą skalę było utrudnione ze względu na niską zdolność ładowania próbek i wąskie okno separacji CZE. W tym miejscu opisano protokół wykorzystujący CZE-MS/MS z objętością próbki w skali mikrolitrów i 90-minutowym oknem separacji dla proteomiki na dużą skalę od góry do dołu. Platforma CZE-MS/MS opiera się na liniowej kapilarze separacyjnej pokrytej poliakrylamidem (LPA) o wyjątkowo niskim przepływie elektroosmotycznym, dynamicznej metodzie zatężania próbki online opartej na złączu pH o wysokiej wydajności układania białek, elektrokinetycznie pompowanym interfejsie CE-MS z przepływem w osłonie o wyjątkowo wysokiej czułości oraz spektrometrze masowym z pułapką jonową o wysokiej rozdzielczości masy i prędkości skanowania. Platforma może być wykorzystywana do charakteryzowania w wysokiej rozdzielczości prostych, nienaruszonych próbek białek oraz do charakteryzowania na dużą skalę proteoform w różnych złożonych proteomach. Jako przykład pokazano wysoce wydajną separację standardowej mieszaniny białkowej i bardzo czułe wykrywanie wielu zanieczyszczeń za pomocą platformy. Innym przykładem jest to, że platforma ta może wyprodukować ponad 500 proteoform i 190 identyfikacji białek z proteomu Escherichia coli w jednym cyklu CZE-MS/MS.

Rysunek 1 przedstawia schemat dynamicznego systemu CZE-ESI-MS opartego na złączu pH wykorzystanego w eksperymencie. Długa strefa próbki w buforze zasadowym jest wstrzykiwana do kapilary rozdziałczej powlekanej LPA, wypełnionej kwasowym BGE. Po przyłożeniu wysokich napięć I i II, anality w strefie próbki zostaną skoncentrowane poprzez metodę dynamicznego złącza pH. Aby ocenić wydajność systemu CZE-MS, zazwyczaj analizowana jest standardowa mieszanina ...

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Metoda ta może pomóc w poprawie wielkoskalowej i wysokorozdzielczej charakterystyki izoform białek i modyfikacji potranslacyjnych białek w komórkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że spektrometria mas z elektroforezą w strefie kapilarnej zapewnia wysoce wydajną separację i bardzo czułe wykrywanie nienaruszonych białek. Aby wstępnie oczyścić kapilarę, osusz ją gazowym azotem o ciśnieniu 10 psi przez co najmniej 12 godzin.Następnie napełnij kapilarę metakrylanem 3-propylu w metanolu o stężeniu 50% objętości za pomocą pompy strzykawkowej. Uszczelnij oba końce kapilary gumą krzemionkową. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny, kontynuować nakładanie liniowej powłoki poliakrylowej na wewnętrzną ścianę kapilary separacyjnej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Spal część kapilary delikatnym płomieniem, aby usunąć zewnętrzną powłokę poliamidową w odległości około czterech centymetrów od jednego końca kapilary. Delikatnie oczyść spaloną część kapilary, wycierając, aby całkowicie usunąć powłokę poliamidową. Wywierć mały otwór na końcu rurki o pojemności 200 mikrolitrów, mniej więcej tego samego rozmiaru, co zewnętrzna średnica kapilary, aby wystarczająco utrzymać kapilarę na miejscu po przewleceniu przez ten otwór.Przeciągnij koniec kapilary, która znajduje się blisko spalonej części, przez otwór, aż spalona część znajdzie się w probówce. Następnie dodaj około 150 mikrolitrów HF do probówki o pojemności 200 mikrolitrów, tak aby roztwór HF znajdował się mniej więcej w połowie wysokości spalonej części na kapilarze. Inkubować kapilar w roztworze HF w temperaturze pokojowej przez 90 do 100 minut.Przygotować wzorcową mieszaninę białek i próbkę E. coli zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby skonfigurować elektroforezę strefy kapilarnej lub system CZE, załaduj próbkę, elektrolit tła i kapilarnę separacyjną do automatycznego próbnika CZE. Wybierz wsad próbki na stronie sterowania ręcznego automatycznego próbnika CZE.Załadować fiolkę z elektrolitem tła do tacki buforowej automatycznego próbnika, zwracając uwagę na jej położenie w tacy buforowej. Następnie załaduj fiolkę z próbką do tacki na próbki automatycznego próbnika, zwracając uwagę na jej położenie w tacy na próbki. Ustaw automatyczny próbnik w pozycji wyrównania za pomocą sterowania ręcznego.Teraz załaduj kapilarnę separacyjną do automatycznego samplera CZE za pomocą niewytrawionego końca kapilary. Dostosuj wysokość końcówki iniekcyjnej kapilary, jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 50 mikrolitrów. Przełącz automatyczny próbnik w tryb czuwania za pomocą sterowania ręcznego.Wpisz pozycję próbki w systemie i przesuń kapilatę do próbki. Wcisnąć końcówkę kapilary do wstrzykiwań bardziej w dół, aby dotrzeć do dna fiolki z próbką. Kontynuując korzystanie ze sterowania ręcznego, przepłukiwać kapilarę elektrolitem tła przez 20 minut pod ciśnieniem 20 psi.Teraz zamontuj komercyjny elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu płaszcza z przodu spektrometru masowego. Napełnij zbiornik buforowy osłony buforem zawierającym metanol o stężeniu 10% objętości i kwas mrówkowy o zawartości 0,2% objętości w wodzie o niskiej zawartości LCMS. Przepłukać T w interfejsie z buforem osłony, wywierając nacisk ręcznie za pomocą strzykawki.Przewlecz końcówkę emitera elektrorozpylania o średnicy zewnętrznej jednego milimetra przez rurkę tulejową i połącz emiter z jednym portem T za pomocą złączki. Wystarczy ponownie ręcznie przepłukać T za pomocą strzykawki, aby napełnić emiter buforem osłony. Dostosuj odległość między otworem emitera a wejściem spektrometru masowego do około dwóch milimetrów za pomocą kamery dołączonej do interfejsu.Zastosować napięcie od dwóch do 2,2 kilowolta w fiolce z buforem osłonowym do elektrorozpylania. Następnie wyreguluj napięcie natrysku, aby osiągnąć stabilny elektrorozpylanie. Podczas tego procesu należy zastosować niskie ciśnienie na końcu kapilary do wstrzykiwania, aby upewnić się, że w kapilarze nie ma pęcherzyków.Wyłącz napięcie natrysku i delikatnie przeciągnij wytrawiony koniec kapilary separacyjnej przez T do emitera, aż nie będzie można go dalej popchnąć. Po zatrzymaniu niskiego ciśnienia na końcu iniekcji kapilary, należy nieco przepłukać emiter buforem osłonowym. Ponownie zastosuj od dwóch do 2,2 kilowoltów napięcia natrysku, aby przetestować spray.Wybierz nową metodę z menu rozwijanego pliku na głównym ekranie instrumentu. Tam wybierz wlot jako początkową fiolkę z próbką, końcową fiolkę z próbką, tacę jako próbkę, ciśnienie jako pięć psi, kilowolty jako zero i czas trwania jako 95 sekund dla wstrzyknięcia próbki. Następnie ustaw wlot jako fiolkę wlotową, tacę jako bufor, ciśnienie jako zero psi, kilowolty jako 30, a czas trwania jako 4,200 sekundy na oddzielenie próbki standardowej mieszaniny białek.W celu oddzielenia próbki proteomu E. coli należy ustawić wlot jako fiolkę wlotową, tacę jako bufor, ciśnienie jako zero psi, kilowolty jako 20, a czas trwania jako 6,600 sekund. Na koniec wybierz wlot jako fiolkę wlotową, tacę jako bufor, ciśnienie jako 10 psi, kilowolty jako 30 i czas trwania jako 600 sekund do płukania kapilary. Teraz ustaw parametry MS i MS/MS do analizy nienaruszonych białek za pomocą spektrometru z poczwórną maską pułapki jonowej.Aby dostosować ustawienia pliku strojenia, włącz tryb nienaruszonego białka i użyj ciśnienia pułapkowania 0,2. Ustaw temperaturę kapilary wymiany jonów na 320 stopni Celsjusza, a poziom RF soczewki S na 55. Aby przeprowadzić eksperyment CZE MS/MS, należy uruchomić metodę akwizycji danych na komputerze spektrometru mas, wybierając opcję Uruchom sekwencję.Następnie rozpocznij sekwencję elektroforezy kapilarnej na komputerze automatycznego pobierania próbek elektroforezy kapilarnej. Przeszukaj bazę danych za pomocą TopPIC w pakiecie TopPIC oraz w graficznym interfejsie użytkownika TopPIC. Kliknij na plik bazy danych i wybierz odpowiednią bazę danych do wyszukiwania.Kliknij plik widma i wybierz wygenerowany plik ms2. msalign wygenerowany jako dane wejściowe. Wybierz plik elementów MS1 i wybierz wygenerowany plik elementów.Ustaw cysteinę karbamidometyl C57 jako stałą modyfikację ze względu na leczenie jodoacetamidem. Wybierz funkcję bazy danych wabika i w ustawieniach odcięcia wybierz opcję False Discovery Rate w menu rozwijanym obok poziomu widma. Ustaw współczynnik fałszywych wykryć na 0,01 na poziomie widma.Pozostaw funkcję generowania niezaznaczoną i ustaw tolerancję błędu na 15 części na milion. Ustaw współczynnik fałszywych wykryć na 0,05 na poziomie proteoformu. W obszarze Parametry zaawansowane wybierz dwa, aby uzyskać maksymalną liczbę przesunięć masy z menu rozwijanego.Ustawia maksymalne przesunięcie masy nieznanych modyfikacji na 500 daltonów. Pozostaw wszystkie inne parametry z wartościami domyślnymi i kliknij przycisk Start w prawym dolnym rogu graficznego interfejsu użytkownika. Pokazany jest reprezentatywny elektroferogram dla wzorcowej mieszaniny białek.Standardowa mieszanina białek jest zwykle uruchamiana co najmniej w dwóch egzemplarzach w celu oceny skuteczności separacji i odtwarzalności systemu. Skuteczność separacji można ocenić za pomocą liczby teoretycznych płytek niektórych białek. Odtwarzalność można ocenić na podstawie względnych odchyleń standardowych intensywności białka i czasu migracji.Platforma CZE MS/MS może być wykorzystywana do wielkoskalowej charakterystyki proteoform w różnych złożonych proteomach, identyfikując z dużą pewnością ponad 500 proteoform i 190 białek z proteomu E. coli w jednym przebiegu. W tym przypadku powiększony widok elektroferogramu może być wykorzystany do oceny okna separacji systemu. Bardzo niska wartość E i spektralny FDR sugerują wysoki poziom ufności proteoformy ID. Wysoka liczba dopasowanych jonów fragmentacyjnych dodatkowo wskazuje na wysoki poziom pewności ID. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o powolnym i delikatnym nawlekaniu wytrawionej kapilary separacyjnej na emiter elektrosprayu.Znakowanie stabilnymi izotopami lub metody bezznacznikowe mogą być włączone do procedury CZE MS w celu określenia, jak zmienia się obfitość proteoform w komórkach w różnych warunkach. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się proteomiką odgórną do zbadania roli proteoform w regulacji różnych procesów biologicznych w komórkach. Nie zapominaj, że praca z kwasem fluorowodorowym może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki ochrony osobistej i stosowanie procedur awaryjnych.

large-scale-top-down-proteomics-using-capillary-zone-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Analiza proteomu nabłonka czuciowego ślimaka może być trudna ze względu na jego mały rozmiar oraz dlatego, że białka błonowe są trudne do wyizolowania i zidentyfikowania. Zarówno białka błonowe, jak i rozpuszczalne można zidentyfikować, łącząc wiele metod preparatywnych i technik separacji wraz ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Proteomika oddolna i proteomika typu shotgun w celu zidentyfikowania kompleksowego proteomu ślimakowego

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Prezentujemy zoptymalizowany protokół etykietowania tandemowego znacznika masy (TMT), który zawiera szczegółowe informacje dla każdego z następujących etapów: ekstrakcja białka, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie, etykietowanie, przesyłanie do ośrodka proteomicznego i analiza danych.

Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Poznaj metodę CZE-ESI-MS/MS do dużoskalowej analizy proteoform z wysoką rozdzielczością. Technika ta umożliwia efektywną separację i czułą detekcję intaktywnych białek z modyfikacjami potranslacyjnymi.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Przeglądaj więcej filmów