Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Metoda ta może pomóc w poprawie wielkoskalowej i wysokorozdzielczej charakterystyki izoform białek i modyfikacji potranslacyjnych białek w komórkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że spektrometria mas z elektroforezą w strefie kapilarnej zapewnia wysoce wydajną separację i bardzo czułe wykrywanie nienaruszonych białek. Aby wstępnie oczyścić kapilarę, osusz ją gazowym azotem o ciśnieniu 10 psi przez co najmniej 12 godzin.

Następnie napełnij kapilarę metakrylanem 3-propylu w metanolu o stężeniu 50% objętości za pomocą pompy strzykawkowej. Uszczelnij oba końce kapilary gumą krzemionkową. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny, kontynuować nakładanie liniowej powłoki poliakrylowej na wewnętrzną ścianę kapilary separacyjnej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Spal część kapilary delikatnym płomieniem, aby usunąć zewnętrzną powłokę poliamidową w odległości około czterech centymetrów od jednego końca kapilary. Delikatnie oczyść spaloną część kapilary, wycierając, aby całkowicie usunąć powłokę poliamidową. Wywierć mały otwór na końcu rurki o pojemności 200 mikrolitrów, mniej więcej tego samego rozmiaru, co zewnętrzna średnica kapilary, aby wystarczająco utrzymać kapilarę na miejscu po przewleceniu przez ten otwór.

Przeciągnij koniec kapilary, która znajduje się blisko spalonej części, przez otwór, aż spalona część znajdzie się w probówce. Następnie dodaj około 150 mikrolitrów HF do probówki o pojemności 200 mikrolitrów, tak aby roztwór HF znajdował się mniej więcej w połowie wysokości spalonej części na kapilarze. Inkubować kapilar w roztworze HF w temperaturze pokojowej przez 90 do 100 minut.

Przygotować wzorcową mieszaninę białek i próbkę E. coli zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby skonfigurować elektroforezę strefy kapilarnej lub system CZE, załaduj próbkę, elektrolit tła i kapilarnę separacyjną do automatycznego próbnika CZE. Wybierz wsad próbki na stronie sterowania ręcznego automatycznego próbnika CZE.

Załadować fiolkę z elektrolitem tła do tacki buforowej automatycznego próbnika, zwracając uwagę na jej położenie w tacy buforowej. Następnie załaduj fiolkę z próbką do tacki na próbki automatycznego próbnika, zwracając uwagę na jej położenie w tacy na próbki. Ustaw automatyczny próbnik w pozycji wyrównania za pomocą sterowania ręcznego.

Teraz załaduj kapilarnę separacyjną do automatycznego samplera CZE za pomocą niewytrawionego końca kapilary. Dostosuj wysokość końcówki iniekcyjnej kapilary, jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 50 mikrolitrów. Przełącz automatyczny próbnik w tryb czuwania za pomocą sterowania ręcznego.

Wpisz pozycję próbki w systemie i przesuń kapilatę do próbki. Wcisnąć końcówkę kapilary do wstrzykiwań bardziej w dół, aby dotrzeć do dna fiolki z próbką. Kontynuując korzystanie ze sterowania ręcznego, przepłukiwać kapilarę elektrolitem tła przez 20 minut pod ciśnieniem 20 psi.

Teraz zamontuj komercyjny elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu płaszcza z przodu spektrometru masowego. Napełnij zbiornik buforowy osłony buforem zawierającym metanol o stężeniu 10% objętości i kwas mrówkowy o zawartości 0,2% objętości w wodzie o niskiej zawartości LCMS. Przepłukać T w interfejsie z buforem osłony, wywierając nacisk ręcznie za pomocą strzykawki.

Przewlecz końcówkę emitera elektrorozpylania o średnicy zewnętrznej jednego milimetra przez rurkę tulejową i połącz emiter z jednym portem T za pomocą złączki. Wystarczy ponownie ręcznie przepłukać T za pomocą strzykawki, aby napełnić emiter buforem osłony. Dostosuj odległość między otworem emitera a wejściem spektrometru masowego do około dwóch milimetrów za pomocą kamery dołączonej do interfejsu.

Zastosować napięcie od dwóch do 2,2 kilowolta w fiolce z buforem osłonowym do elektrorozpylania. Następnie wyreguluj napięcie natrysku, aby osiągnąć stabilny elektrorozpylanie. Podczas tego procesu należy zastosować niskie ciśnienie na końcu kapilary do wstrzykiwania, aby upewnić się, że w kapilarze nie ma pęcherzyków.

Wyłącz napięcie natrysku i delikatnie przeciągnij wytrawiony koniec kapilary separacyjnej przez T do emitera, aż nie będzie można go dalej popchnąć. Po zatrzymaniu niskiego ciśnienia na końcu iniekcji kapilary, należy nieco przepłukać emiter buforem osłonowym. Ponownie zastosuj od dwóch do 2,2 kilowoltów napięcia natrysku, aby przetestować spray.

Wybierz nową metodę z menu rozwijanego pliku na głównym ekranie instrumentu. Tam wybierz wlot jako początkową fiolkę z próbką, końcową fiolkę z próbką, tacę jako próbkę, ciśnienie jako pięć psi, kilowolty jako zero i czas trwania jako 95 sekund dla wstrzyknięcia próbki. Następnie ustaw wlot jako fiolkę wlotową, tacę jako bufor, ciśnienie jako zero psi, kilowolty jako 30, a czas trwania jako 4,200 sekundy na oddzielenie próbki standardowej mieszaniny białek.

W celu oddzielenia próbki proteomu E. coli należy ustawić wlot jako fiolkę wlotową, tacę jako bufor, ciśnienie jako zero psi, kilowolty jako 20, a czas trwania jako 6,600 sekund. Na koniec wybierz wlot jako fiolkę wlotową, tacę jako bufor, ciśnienie jako 10 psi, kilowolty jako 30 i czas trwania jako 600 sekund do płukania kapilary. Teraz ustaw parametry MS i MS/MS do analizy nienaruszonych białek za pomocą spektrometru z poczwórną maską pułapki jonowej.

Aby dostosować ustawienia pliku strojenia, włącz tryb nienaruszonego białka i użyj ciśnienia pułapkowania 0,2. Ustaw temperaturę kapilary wymiany jonów na 320 stopni Celsjusza, a poziom RF soczewki S na 55. Aby przeprowadzić eksperyment CZE MS/MS, należy uruchomić metodę akwizycji danych na komputerze spektrometru mas, wybierając opcję Uruchom sekwencję.

Następnie rozpocznij sekwencję elektroforezy kapilarnej na komputerze automatycznego pobierania próbek elektroforezy kapilarnej. Przeszukaj bazę danych za pomocą TopPIC w pakiecie TopPIC oraz w graficznym interfejsie użytkownika TopPIC. Kliknij na plik bazy danych i wybierz odpowiednią bazę danych do wyszukiwania.

Kliknij plik widma i wybierz wygenerowany plik ms2. msalign wygenerowany jako dane wejściowe. Wybierz plik elementów MS1 i wybierz wygenerowany plik elementów.

Ustaw cysteinę karbamidometyl C57 jako stałą modyfikację ze względu na leczenie jodoacetamidem. Wybierz funkcję bazy danych wabika i w ustawieniach odcięcia wybierz opcję False Discovery Rate w menu rozwijanym obok poziomu widma. Ustaw współczynnik fałszywych wykryć na 0,01 na poziomie widma.

Pozostaw funkcję generowania niezaznaczoną i ustaw tolerancję błędu na 15 części na milion. Ustaw współczynnik fałszywych wykryć na 0,05 na poziomie proteoformu. W obszarze Parametry zaawansowane wybierz dwa, aby uzyskać maksymalną liczbę przesunięć masy z menu rozwijanego.

Ustawia maksymalne przesunięcie masy nieznanych modyfikacji na 500 daltonów. Pozostaw wszystkie inne parametry z wartościami domyślnymi i kliknij przycisk Start w prawym dolnym rogu graficznego interfejsu użytkownika. Pokazany jest reprezentatywny elektroferogram dla wzorcowej mieszaniny białek.

Standardowa mieszanina białek jest zwykle uruchamiana co najmniej w dwóch egzemplarzach w celu oceny skuteczności separacji i odtwarzalności systemu. Skuteczność separacji można ocenić za pomocą liczby teoretycznych płytek niektórych białek. Odtwarzalność można ocenić na podstawie względnych odchyleń standardowych intensywności białka i czasu migracji.

Platforma CZE MS/MS może być wykorzystywana do wielkoskalowej charakterystyki proteoform w różnych złożonych proteomach, identyfikując z dużą pewnością ponad 500 proteoform i 190 białek z proteomu E. coli w jednym przebiegu. W tym przypadku powiększony widok elektroferogramu może być wykorzystany do oceny okna separacji systemu. Bardzo niska wartość E i spektralny FDR sugerują wysoki poziom ufności proteoformy ID. Wysoka liczba dopasowanych jonów fragmentacyjnych dodatkowo wskazuje na wysoki poziom pewności ID. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o powolnym i delikatnym nawlekaniu wytrawionej kapilary separacyjnej na emiter elektrosprayu.

Znakowanie stabilnymi izotopami lub metody bezznacznikowe mogą być włączone do procedury CZE MS w celu określenia, jak zmienia się obfitość proteoform w komórkach w różnych warunkach. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się proteomiką odgórną do zbadania roli proteoform w regulacji różnych procesów biologicznych w komórkach. Nie zapominaj, że praca z kwasem fluorowodorowym może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki ochrony osobistej i stosowanie procedur awaryjnych.