Izolacja tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wątroby
August 21st, 2019
To jest protokół izolowania tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od wątroby. Protokół opisuje dwuetapowy proces obejmujący perfuzję kolagenazy, po której następuje różnicowe ultrawirowanie w celu wyizolowania EV tkanki wątroby.
Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vivo, dostarczając nam źródła pęcherzyków, które są reprezentatywne dla lokalnego mikrośrodowiska tkankowego. Badania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w środowisku tkankowym mogą pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologicznych ról pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i ich zmian w procesach patofizjologicznych in vivo. Wizualna demonstracja kaniulacji żyły wrotnej jest pomocna, ponieważ mały rozmiar żyły utrudnia manipulację.
Procedurę zademonstruje doktor Kaori Ishiguro Irene Yan, technolog badawczy z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem zabiegu zabezpiecz kończyny znieczulonej myszy i podłącz igłę o rozmiarze 23 zestawu do pobierania krwi ze skrzydlatymi do wolnego końca rurki pompy strzykawkowej. Oczyść skórę brzucha myszy 70% etanolem i wacikiem nasączonym alkoholem i użyj nożyczek, aby otworzyć mysz od przedniej części klatki piersiowej do kości miednicy, uważając, aby nie uszkodzić żadnych narządów wewnętrznych.
Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby delikatnie przesunąć jelita na prawą stronę jamy brzusznej, aby odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną dolną, a następnie użyj zakrzywionych kleszczy, aby umieścić nić pod żyłą wrotną. Zawiąż luźno węzeł w szwie, aby przygotować się do zaciskania po kaniulacji i napełnij kaniulę HBSS o temperaturze 40 stopni Celsjusza, aż roztwór dotrze do końcówki igły kaniuli. Włóż kaniulę do żyły wrotnej pięć do 10 milimetrów poniżej ligatury i zabezpiecz kaniulę szwem.
Rozpocznij infuzję przy natężeniu przepływu od jednego do dwóch mililitrów na minutę. Jeśli kaniula została prawidłowo umieszczona, wątroba zacznie blednąć. Przetnij żyłę główną dolną i pozwól, aby nadmiar płynu w wątrobie spłynął.
Powoli zwiększaj szybkość przepływu do ośmiu mililitrów na minutę, aż pełne 50 mililitrów HBSS zostanie przepuszczone przez wątrobę w ciągu następnych pięciu minut. Tuż przed wyczerpaniem HBSS zmień świeżo przygotowany roztwór kolagenazy czwartej o temperaturze 40 stopni Celsjusza na zlewkę perfuzacyjną i użyj kleszczy, aby wywrzeć przejściowy nacisk na żyłę główną dolną w odstępach pięciosekundowych, aby spowodować obrzęk wątroby i pomóc w trawieniu i dysocjacji tkanek. W miarę postępu trawienia wątroba puchnie i staje się biała.
Gdy resztki zostaną wciśnięte po delikatnym sondowaniu aplikatorem z bawełnianą końcówką, zatrzymaj pompę i wyjmij kaniulę. Usuń woreczek żółciowy z wątroby, uważając, aby nie rozerwać tkanki pęcherzyka żółciowego, i użyj czystych nożyczek i kleszczy, aby pobrać wątrobę do sterylnego 10-centymetrowego naczynia hodowlanego PBS. Po delikatnym umyciu przenieś wątrobę do nowego 10-centymetrowego naczynia hodowlanego zawierającego świeży roztwór kolagenazy cztery i użyj dwóch czystych kleszczy, aby rozerwać wątrobę, delikatnie potrząsając, aby oddzielić komórki od tkanki wątroby.
Gdy cały narząd zostanie rozdrobniony, użyj trzymililitrowej strzykawki, aby rozcierać zawiesinę tkanki, aż niestrawione kawałki wątroby zostaną strząśnięte. Wlej powstały roztwór komórek przez sitko z nylonowej siatki o grubości 70 mikronów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, myjąc naczynie HBSS, aby zebrać pozostałe komórki. Połączyć płuczkę z zawiesiną jednokomórkową i usunąć hepatocyty przez odwirowanie.
Następnie przenieś supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki. Aby usunąć wszelkie inne komórki, odwiruj supernatant przed przeniesieniem do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Usunąć martwe komórki za pomocą kolejnego wirowania i przenieść supernatant do probówki z okrągłym dnem w celu usunięcia wszelkich resztek komórek i agregatów.
Teraz przenieś supernatant do ultra probówki wirówkowej z poliwęglanu i ponownie zawieś osad w około 20 mililitrach PBS do drugiego i ostatniego ultra wirowania. Następnie ponownie zawieś zewnątrzkomórkowy osad nanopęcherzyków w jednym mililitrze PBS do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jeśli pęcherzyki nie zostaną natychmiast przeanalizowane. Z pojedynczej wątroby myszy metoda ta pozwala uzyskać stężenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w tkance, które waha się od 1,74 do czterech razy 10 do dwunastej ze średnią 3,46 razy 10 do dwunastej cząstki na mililitr, jak określono za pomocą analizy śledzenia nanocząstek.
Średnia wielkość izolowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych tkanki wątroby wynosi 157,7 nanometrów przy wielkości trybu 144,5 nanometra i rozmiarach pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od 100 do 600 nanometrów według analizy śledzenia nanocząstek. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, które są izolowane przy użyciu tego podejścia, nadają się do dalszych zastosowań, a dalsza charakterystyka może obejmować oceny morfologiczne za pomocą elektromikroskopii lub analizę ich markerów powierzchniowych lub zawartości.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę izolacji pozakomórkowych pęcherzyków (EVs) z tkanki wątroby z wykorzystaniem perfuzji kolagenazy i różnicowej ultracentrifugacji. To podejście zapewnia źródło EVs, które odzwierciedla lokalne środowisko mikrośrodowiska tkankowego, pomagając w badaniu ich fizjologicznych ról i zmian w chorobach.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórkowa
- Badania nad pozakomórkowymi pęcherzykami
Tło
- Pozakomórkowe pęcherzyki odgrywają kluczowe role w komunikacji międzykomórkowej.
- Zrozumienie ich funkcji in vivo jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów chorobowych.
- Ten protokół ułatwia badanie EVs pochodzących z tkanki wątroby.
- Pokazy wizualne procedury zwiększają odtwarzalność.
Cel badania
- Izolacja pozakomórkowych pęcherzyków pochodzących z wątroby do celów badawczych.
- Badanie fizjologicznych ról EVs w mikrośrodowisku tkankowym.
- Dostarczenie niezawodnej metody badania zmian EVs w chorobach.
Wykorzystane metody
- Perfuzja kolagenazą w celu rozpuszczenia tkanki wątroby.
- Różnicowa ultracentrifugacja w celu izolacji EVs.
- Analiza śledzenia nanocząstek w celu scharakteryzowania stężenia i wielkości EV.
- Pokaz wizualny techniki cewnikowania żyły wrotnej.
Główne wyniki
- Otrzymano stężenie od 1,74 do 4 x 10^12 cząsteczek/mL EVs.
- Średnia wielkość izolowanych EVs wynosiła 157,7 nm, z modalnością 144,5 nm.
- Izolowane EVs nadają się do dalszych zastosowań.
- Charakteryzacja może obejmować oceny morfologiczne i analizę markerów powierzchniowych.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia solidną metodę izolacji EVs z wątroby.
- Izolowane EVs można wykorzystać do różnych dalszych analiz.
- Dalsze badania mogą zwiększyć zrozumienie ról EVs w zdrowiu i chorobie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating extracellular vesicles from liver tissue enables direct study of in vivo vesicle populations that reflect the local microenvironment, supporting target validation and mechanistic de-risking in hepatology and metabolic disease research. This method provides a reproducible source of tissue-derived vesicles for biomarker discovery and preclinical model development, improving predictive confidence in early-stage therapeutic hypotheses. By yielding quantifiable EV concentrations and size profiles, the approach facilitates assay standardization and cross-functional collaboration in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-specific EV roles in physiological and pathophysiological processes, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a consistent source of liver-derived EVs for functional assays that clarify pathway involvement and biological de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields EVs suitable for downstream characterization, enabling standardized assays for cargo analysis and surface marker profiling.
- Operational Value: Delivers reproducible nanoparticle tracking analysis outputs for concentration and size metrics, supporting assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects in vivo EV isolation to disease-relevant systems, allowing study of EV alterations in pathophysiological contexts.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by providing vesicles reflective of the liver microenvironment for preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by providing tissue-derived EVs that support hypothesis testing, assay development, and preclinical continuity, particularly in liver-focused therapeutic areas.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by enabling study of EV-mediated communication in the liver tissue microenvironment.
- Screening: Produces standardized EV isolates with quantifiable concentration and size, facilitating reliable compound or modulator screening.
- Analytics: Generates nanoparticle tracking analysis data for concentration (1.74–4 × 10¹² particles/mL) and size (mean 157.7 nm), enabling comparative condition assessment.
- Translational Research: Links tissue EV profiles to disease models, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical programs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable collagenase perfusion and ultracentrifugation protocol for consistent EV isolation across liver studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by providing tissue-representative EVs that reduce mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined perfusion, digestion, and centrifugation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of EV-mediated biological activity in disease models.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization through quantitative EV yield and characterization data from tissue sources.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, vascular cannulation, and aseptic tissue handling.
- Dependent on perfusion pumps, centrifuges, and nanoparticle tracking analyzers for execution and validation.
- Necessitates cross-team standardization of collagenase concentration, flow rates, and g-force parameters for reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other tissues with differing structural integrity.
- Limited by tissue dissociation challenges that may affect EV yield if collagenase digestion is suboptimal.
