Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biopestycydów, takie jak wpływ dwuniciowego RNA na ekspresję genów i płodność u dorosłych muchówek. Główną zaletą tej techniki jest to, że mierzalne dawki dwuniciowego RNA są dostarczane do komara lub muchy, a następnie można ocenić wynikający z tego wpływ na śmiertelność wielopokoleniową. Chociaż metoda ta jest przedstawiona dla komara aedes aegypti i muchy domowej musca domestica, można ją również zastosować do innych gatunków komarów i much.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ opanowanie samej procedury wstrzykiwania jest inwestycją czasu. Wstrzykiwanie każdemu owadowi optymalnego rozmiaru końcówki igły ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia dostawy przy jednoczesnym zminimalizowaniu obrażeń i śmiertelności. Na początek użyj kleszczy, aby ostrożnie ustawić komary, aby ostatecznie zostały wystawione na szkiełko mikroskopowe w odległości około pół centymetra od siebie.

Aby ułatwić obsługę slajdów, pozostaw odstęp od jednego do półtora centymetra po lewej lub prawej stronie zjeżdżalni. Następnie umieść szkiełko z inscenizowanymi owadami w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dużej szalce Petriego. Ustaw mikroskop preparacyjny i mikroiniektor na stole chłodzącym.

Po naciągnięciu szklanych naczyń włosowatych do cienkiej końcówki, umieść igłę kapilarną w mikrowstrzykiwaczu i rozbij końcówkę igły kleszkami. Następnie przepłukać igłę, trzykrotnie pobierając i usuwając wodę wolną od nukleaz. Należy pamiętać, że rozmiary szklanych otworów na igły różnią się w zależności od komarów i much domowych.

Następnie należy przygotować roztwór do wstrzykiwań o odpowiednim stężeniu dla komarów. Dodaj trzy mikrogramy na mililitr rodaminy B do roztworu, aby pomóc w wizualizacji. Za pomocą pipety przenieś trzy do czterech mikrolitrów roztworu na czystą powierzchnię i wciągnij go do szklanej igły bez wdychania powietrza.

Należy kilkakrotnie nacisnąć przycisk wstrzykiwania, aż płyn zacznie wypływać z igły. Użyj bardzo cienkiego markera punktowego, aby narysować znaki krzyżyka w odległości około jednego milimetra od siebie, zaczynając od płynnego menisku do trzonka igły. Umieść szkiełko komarów pod igłą i upewnij się, że pole widzenia jest wystarczająco szerokie, aby zobaczyć menisk roztworu w igle.

Wyrównaj igłę ze środkową jedną trzecią mostka mezokarapy. Przymocuj komara do igły kleszczami umieszczonymi po przeciwnej stronie komara i delikatnie nakłuj naskórek końcówką igły. Delikatnie wsuń igłę w komara, aż końcówka przejdzie przez linię środkową.

Naciskać przycisk wstrzykiwania, aż do momentu wstrzyknięcia żądanej ilości płynu. Jeśli łąkotka się nie porusza, powoli zsuń komara lub odleć z igły, obserwując ruch łąkotki. Jeśli część wstrzykniętego roztworu wydostanie się z naskórka po usunięciu igły lub jeśli łąkotka nie porusza się, należy wyrzucić owada, ponieważ wstrzyknięcie nie powiodło się.

Na muchy domowej wyrównaj igłę z mezopleuronem. Przymocuj muchę do igły kleszczami umieszczonymi po przeciwnej stronie muchy i delikatnie nakłuj naskórek końcówką igły. Przenieś wstrzyknięte owady, aby oczyścić kubki o pojemności 3,5 uncji w grupach od dziesięciu do 15.

Następnie przykryj kubek siatką i pozwól im zregenerować się w temperaturze pokojowej. Po tym, jak owady dojdą do siebie, odwróć kubek na wacik nasączony 10% roztworem sacharozy. Najpierw napełnij 12-calową sztuczną membranę świeżą krwią i podgrzej ją do 60 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej.

Osusz membranę ręcznikiem papierowym i połóż ją na siatkowej nasadce kubka. Po nakarmieniu komarów wymień wacik i pozwól komarom odpocząć przez 24 godziny. Następnie skonstruuj kubki do składania jaj, wypełniając przezroczyste kubki z biooctanu o pojemności 3,5 uncji około 30 milimetrami wody dejonizowanej.

Następnie umieść kawałek papieru do kiełkowania nasion na dnie kubka. Przykryj kubek siatką i wytnij małą szczelinę w nasadce siatki. 24 godziny po karmieniu wytnij małą szczelinę w nasadce kubka do składania jaj i przenieś samice, które pomyślnie się karmiły, do miseczek do składania jaj

Następnie uszczelnij małą szczelinę w nasadce do składania jaj wacikiem nasączonym sacharozą o sacharozie. Monitoruj komary i śledź dzienną śmiertelność. Po umożliwieniu komarom składania jaj przez pięć do siedmiu dni, policz jaja pod mikroskopem preparacyjnym.

Procedurę zademonstruje dr Christopher Geden, entomolog badawczy USDA ARS. Trzy dni po wstrzyknięciu znieczulij muchy dwutlenkiem węgla. Następnie przenieś muchy do czystej klatki z wodą i przygotowaną dietą much.

Rejestruj dane o śmiertelności i codziennie usuwaj martwe muchy. Następnie wymieszaj 75% otrębów pszennych z 25% granulowaną paszą dla żywego bydła na wagę, aby przygotować podłoże do odchowu larw. Dodaj wodę do mieszanki, aż do uzyskania 62% wilgotności.

Dodaj zwilżoną mieszankę paszową dla żywego bydła z otrębów pszennych do kwadratu czarnej szmatki i zwiń ją w kulkę. Użyj gumowej opaski, aby utrzymać szmatkę na miejscu i delikatnie ściśnij, aż płynne medium przesączy się. Umieść piłkę w kubku o pojemności 60 mililitrów i umieść ją w klatce na muchy na pięć godzin.

Następnie spłucz jajka z kuli, upewniając się, że jajka zostały usunięte spod fałd szmatki. Potrząśnij jajkami, aby rozbić wszelkie grona, i przenieś je do 20-mililitrowej probówki wirówkowej z podziałką. Pozwól jajom się uspokoić i zanotuj objętość osadzonych jaj w probówce.

Następnie dodaj tyle wody, aby zwiększyć objętość do 20-krotności objętości osadzonych jaj. Następnie użyj magnetycznego mieszadła, aby wymieszać wodę i zawiesinę jajeczną. Na koniec użyj zmodyfikowanej końcówki pipety, aby dozować 0,5 mililitra zawiesiny na kawałek wstępnie zwilżonej czarnej szmatki w szeregu linii.

W tym protokole samicom komarów wstrzyknięto mikrozastrzyki w celu oceny ekspresji genów. Wstrzyknięcie samicom dwuniciowego RNA wykazało znaczne zmniejszenie względnej ekspresji w wielu cyklach składania jaj. Średnie rozmiary lęgów u komarów w pierwszym cyklu gonotroficznym były znacznie zmniejszone zarówno w grupach leczonych dsRPS6, jak i dsRPL26.

Oczywisty wpływ dawki zaobserwowano w rozmiarach lęgów podczas wstrzykiwania dsRPS6 od jednego mikrograma do 50 nanogramów samicom komarów. Muchom domowym wstrzyknięto również pięć mikrogramów dwuniciowych konstruktów RNA. Podobnie jak w przypadku obserwacji komarów, zaobserwowano znaczne zmniejszenie zarówno specyficznej ekspresji transkryptu, jak i wielkości lęgu.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wyrzuceniu owadów, które nie zostały skutecznie wstrzyknięte. Korzystając z tej procedury, każdy dwuniciowy konstrukt RNA lub inny bioracjonalny może zostać dostarczony komarom lub muchom. Nie zapominaj, że praca ze szklanymi igłami może być niebezpieczna i zawsze należy je wyrzucać do odpowiednich pojemników na ostre odpady.