Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Metoda ta może pomóc w sprostaniu kluczowym wyzwaniom w dziedzinie immunoterapii nowotworów poprzez ułatwienie opracowania wektorów onkolitycznych do celowanej immunomodulacji. Główną zaletą zastosowanego odwróconego systemu genetycznego jest jego uniwersalność; W związku z tym wektory można dostosować do różnych pytań badawczych i celować w nowotwory o różnych sygnaturach immunologicznych. Etapy namnażania się wirusa, w szczególności określające optymalny punkt czasowy do zebrania wirusa, są trudne do nauczenia się na podstawie protokołu tekstowego, ponieważ tworzenie się syncytii musi być oceniane wizualnie w czasie.

Rozpoczęcie projektowania i klonowania rekombinowanych wektorów immunomodulujących zgodnie z opisem w manuskrypcie. Protokół ten opisuje konkretne kroki w celu opracowania onkolitycznego wektora szczepionki przeciwko odrze, kodującego bispecyficznego aktywatora limfocytów T. Aby uratować wirusa odry przed cDNA, 24 godziny przed transfekcją płytki produkującej wirusa odry równomiernie na 6-ściennej płytce.

Wysiewaj 200 000 komórek w 2 mililitrach DMEM zawierających 10 procent FBS na dołek, aby osiągnąć 65 do 75 procent konfluencji w momencie transfekcji. Wymieszaj 5 mikrogramów rekombinowanego DNA kodującego antygenom wirusa odry, który zostanie użyty do transfekcji komórek. Odpowiednie plazmidy i reporter fluorescencyjny w łącznej objętości 200 mikrolitrów DMEM.

Dodaj 18,6 mikrolitra odczynnika do transfekcji liposomalnej do mieszaniny i natychmiast przesuń probówkę, aby wymieszać. Inkubować tę mieszankę transfekcyjną przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Aby transfekować komórki producenta MV, usuń pożywkę z płytki 6-dołkowej wyhodowanej do 65 do 75 procent konfluencji i dodaj 1,8 mililitra DMEM z 2 procentami FBS i 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny na studzienkę.

Następnie dodaj kroplami mieszankę transfekcyjną do każdej studzienki i ostrożnie zamieszaj. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procentach dwutlenku węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę 2 mililitrami świeżego DMEM z 2 procentami FBS i 50 mikrogramami na mililitr Kanamycyny i powtórz to, gdy podłoże stanie się kwaśne, rozpoznawane przez żółty kolor.

Użyj mikroskopu, aby codziennie obserwować komórki pod kątem ekspresji genów reporterowych i tworzenia syncytorii. Gdy widoczna jest duża syncytia składająca się z 20 lub więcej komórek lub gdy komórki stają się zbyt gęste, należy zebrać wirusa. 24 godziny przed przewidywanymi zbiorami wysiewaj około 1,5 miliona komórek produkcyjnych MV w 12 mililitrach DMEM z 10-procentowym FBS na 10-centymetrowych szalkach, aby osiągnąć 65 do 75 procent konfluencji w momencie inokulacji wirusa.

Aby zebrać progynę wirusa, użyj skrobaka do komórek, aby ostrożnie zeskrobać przylegające komórki produkcyjne z 6 płytek ściennych z transfekowanymi komórkami. Przenieść pożywkę zawierającą zeskrobane komórki do probówki wirówkowej. Wirować przez co najmniej 2500 razy G i 4 stopnie Celsjusza przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek.

Po odwirowaniu zmieszać bezkomórkowy supernatant z pożywką wolną od surowicy do końcowej objętości 4 mililitrów, aby przygotować inokulum. Usunąć pożywkę z 10-centymetrowej płytki z komórkami producenta MV i dodać inokulum do komórek. Inkubuj przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procentach dwutlenku węgla.

Po inkubacji dodaj 6 mililitrów DMEM z 10 procentami FBS i inkubuj komórki przez noc. Następnie zastąp pożywkę 12 mililitrami świeżego DMEM z 10 procentami FBS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procentach dwutlenku węgla aż do zbioru. Obserwuj komórki co najmniej dwa razy dziennie.

Zanim syncytia pęknie, gdy przerwanie błony stanie się widoczne, zbierz wirusa. Aby zebrać pierwsze pasaże, usuń supernatant z płytki i dodaj 600 mikrolitrów wolnego podłoża surowicy. Następnie użyj podnośnika komórkowego, aby zeskrobać komórki i przenieść do czystej probówki.

Natychmiast po tym zawiesinę wirusa należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny, aby zapewnić dokładne zamrożenie. Do oznaczania mian zapasów wirusa w ośmioduplikatach na podwielokrotność przy użyciu 96 płytek ściennych. Najpierw wyciągnij komórki produkcyjne z kolb do hodowli komórkowych T75 do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Policz komórki i dostosuj zawiesinę komórek do 150 000 komórek na mililitr w DMEM z 10-procentowym FBS. Dodaj 90 mikrolitrów DMEM z 10 procentami FBS na studzienkę 96 płytki ściennej. Następnie dodać 10 mikrolitrów z jednej porcji wywaru wirusa do wszystkich 8 studzienek w pierwszej kolumnie płytki.

Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 10 mikrolitrów każdego dołka z pierwszej do drugiej kolumny i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Powtórzyć tę czynność dla każdej kolumny, aby uzyskać seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia wirusa przy użyciu świeżych końcówek pipet dla każdego etapu rozcieńczania.

Wyrzuć 10 mikrolitrów z każdej studzienki ostatniej kolumny. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej po 150 000 komórek na mililitr do każdej studzienki, upewniając się, że nie ma grudek komórek. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5 procent dwutlenku węgla przez 48 godzin.

Sprawdź syncytię za pomocą mikroskopu świetlnego. Policz syncytia w każdym dołku kolumny o najwyższym współczynniku rozcieńczenia zawierającym widoczną syncytię. W przypadku wirusów kodujących reporter fluorescencyjny syncytia można policzyć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Do analizy kinetyki replikacji wirusa odry na dzień przed zakażeniem wysiewa 100 000 komórek vero w 1 mililitrze DMEM z 10 procentami FBS na studzienkę na 12 płytkach ściennych z co najmniej 2 dołkami dla każdego punktu zainteresowania czasowego. Aby zainfekować komórki, zastąp pożywkę 300 mikrolitrami wolnej pożywki surowicy zawierającej odpowiednią ilość wirusa. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procent dwutlenku węgla przez co najmniej 2 godziny.

Usuń inokulum i dodaj 1 mililitr DMEM z 10 procentami FBS i kontynuuj inkubację. W odpowiednich punktach czasowych po infekcji należy zebrać progynię wirusa, bezpośrednio zeskrobując komórki do pożywki. Przenieś zawartość z każdej studzienki do pojedynczej probówki.

Szybkie zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu miareczkowania, a następnie postępowanie zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby rozpocząć ocenę cytotoksyczności komórek indukowanej przez BTE poprzez uwalnianie LDH, najpierw wyizoluj wydzielane produkty transgenu ulegające ekspresji przez komórki docelowe zakażone wirusem i wyizoluj komórki efektorowe układu odpornościowego, jak opisano w manuskrypcie. Następnie umieść komórki docelowe w płytce ściennej U-bottom 96 i dołącz próbki zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Do odpowiednich próbek dodać wcześniej wyizolowane immunomodulatory w żądanych stężeniach. Dodaj komórki uciekinierów immunologicznych w pożądanych proporcjach i dodaj pożywkę do całkowitej objętości 100 mikrolitrów na studzienkę. Inkubuj przez pożądane, wcześniej określone ramy czasowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procentach dwutlenku węgla.

45 minut przed pobraniem próbki dodać 10 mikrolitrów 10-krotnego roztworu do lizy do studzienek zawierających próbki T max i odpowiadające im pożywki kontrolne i kontynuować inkubację. Odwirować komórki w temperaturze 250 razy G przez 4 minuty. Przenieś 50 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki do studzienek płytki ściennej o płaskim dnie 96, uważając, aby nie przenosić komórek.

Po przygotowaniu roztworu podłoża według producenta dodać 50 mikrolitrów do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut lub do momentu, gdy próbki T max zmienią kolor na ciemnoczerwony. Po inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki.

Wirować przez 1 minutę w temperaturze 4000 razy G, a następnie użyć wydrążonej igły do usunięcia pęcherzyków powietrza. Zmierz absorbancję optyczną przy 490 nanometrach i oblicz zgodnie z opisem w manuskrypcie. Po inokulacji niezmodyfikowanymi i zausznymi kodami wirusów odry onkolitycznej krzywe wzrostu porównywanych wektorów na komórkach vero wydają się podobne.

Krzywe żywotności komórek mysiego raka jelita grubego mc38 stabilnie eksprymujących ludzki antygen rakowo-embrionalny i receptory MV CD46 po inokulacji pokazują, że aktywność lityczna wirusa kodującego transgen pozostaje w tyle w linii komórkowej mysiego nowotworu. Cytometria przepływowa komórek wykazujących ekspresję antygenu docelowego inkubowanych z BTE w pięciu różnych rozcieńczeniach wykazała wiązanie BTE przez komórki w sposób zależny od stężenia. W immunoblot po magnetycznym ściągnięciu komórek związanych z BTE wykazało, że gdy zastosowano zauszne aparaty zauszne nieukierunkowane, nie było wykrywalnych ilości komórek; podczas gdy przy celowaniu w próbki zauszne stosowano komórki związane obecne we frakcji elucyjnej.

Cytotoksyczność mysich limfocytów T swoista dla antygenu docelowego i zależna od stężenia za pośrednictwem BTE jest wskazywana przez reprezentatywny test uwalniania LDH i pokazuje, że w niniejszym przykładzie osiągnięto 15-procentowe specyficzne zabijanie komórek przy stosunkowo wysokim stężeniu 1 mikrograma na mililitr w porównaniu z komórkami referencyjnymi. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o regularnym monitorowaniu komórek w celu sprawdzenia postępu infekcji. Nie zapominaj, że rekombinowane szczepy szczepionki przeciwko odrze, choć atenuowane, mogą być niebezpieczne, szczególnie dla osób z obniżoną odpornością.

Unikaj narażenia, przestrzegając odpowiednich procedur bezpieczeństwa biologicznego. Osoby mające kontakt z wirusami powinny zostać zaszczepione przed wykonaniem tych metod. Po tej procedurze można osiągnąć ekspresję wirusa kolejnych transgenów w celu analizy interakcji z gospodarzami wirusa i efektów terapeutycznych.

Rozwój tych technik utorował drogę naukowcom zajmującym się bioterapią do zbadania wpływu immunomodulatorów wykazujących lokalną ekspresję w wielu jednostkach nowotworowych; In Vitro, In Vivo, a także w badaniach klinicznych.