Name: Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj protokół generowania onkolicznych wirusów ospy wietrznej z immunomodulatorami dla terapii przeciwnowotworowej. Ta metoda umożliwia projektowanie wektorów dostosowanych do różnych typów nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te metody zostały opracowane w Grupie Wiroterapii kierowanej przez Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts w Narodowym Centrum Chorób Nowotworowych w Heidelbergu. Jesteśmy wdzięczni jemu i wszystkim członkom zespołu laboratoryjnego, zwłaszcza dr Tobiasowi Speckowi, dr Rūcie Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler i Jessice Albert. Prace te były wspierane przez Else Kröner-Fresenius-Stiftung (grant 2015_A78 dla C.E. Engeland) oraz Niemiecką Narodową Fundację Nauki (DFG, grant EN 1119/2-1 dla C.E. Engeland). J.P.W. Heidbuechel otrzymuje stypendium Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

C.E. Engeland jest wymieniony jako współtwórca patentu dotyczącego wirusów RNA do immunoterapii nowotworów, należącego do Uniwersytetu w Heidelbergu. J.P.W. Heidbuechel nie ma nic do ujawnienia.

Immunoterapia onkolityczna (tj. OVT w połączeniu z immunomodulacją) jest bardzo obiecująca w leczeniu nowotworów, wymagając dalszego rozwoju i optymalizacji wirusów onkolitycznych kodujących białka immunomodulujące. Protokół ten opisuje metody generowania i walidacji takich wektorów do późniejszych testów w odpowiednich modelach przedklinicznych i potencjalnego przyszłego przełożenia klinicznego na nowatorskie terapie przeciwnowotworowe.
Dostępnych jest wiele różnych platform wirusów ...

Wirusy onkolityczne (OV) są opracowywane jako terapie przeciwnowotworowe, które specyficznie replikują się w komórkach nowotworowych i zabijają je, pozostawiając zdrowe tkanki nienaruszone. Obecnie powszechnie wiadomo, że wirusoterapia onkolityczna (OVT) w większości przypadków nie opiera się wyłącznie na całkowitej lizie guza poprzez efektywną replikację i rozprzestrzenianie się wirusa, ale wymaga dodatkowych mechanizmów działania dla powodzenia leczenia, w tym celowania naczyniowego i zrębowego oraz, co ważne, stymulacji immunologicznej1,2,3,4. Podczas gdy wiele wczesnych badań nad OV wykorzystywało niezmodyfikowane wirusy, obecne badania skorzystały z lepszego zrozumienia biologii, biobanków wirusów, które potencjalnie zawierają nowe OV, oraz możliwości oferowanych przez inżynierię genetyczną w celu stworzenia zaawansowanych platform OV5,6,7.
Biorąc pod uwagę niedawny sukces immunoterapii, immunomodulujące transgeny są szczególnie interesujące w odniesieniu do inżynierii genetycznej OV. Ukierunkowana ekspresja takich produktów genowych przez komórki nowotworowe zakażone OV zmniejsza toksyczność w porównaniu z podawaniem ogólnoustrojowym. Celowanie osiąga się albo za pomocą wirusów z wrodzoną onkoselektywnością, albo przez modyfikację tropizmu wirusowego8. Miejscowa immunomodulacja wzmacnia wieloaspektowe mechanizmy przeciwnowotworowe OVT. Co więcej, strategia ta odgrywa zasadniczą rolę w badaniu wzajemnych oddziaływań między wirusami, komórkami nowotworowymi i układem odpornościowym gospodarza. W tym celu protokół ten zapewnia odpowiedni i regulowany przepływ pracy do projektowania, klonowania, ratowania, propagacji i walidacji wektorów paramyksowirusa onkolitycznego (w szczególności wirusa odry) kodujących takie transgeny.
Modulacja odpowiedzi immunologicznej może być osiągnięta za pomocą szerokiej gamy produktów transgenicznych ukierunkowanych na różne etapy cyklu odporności nowotworowej9, w tym zwiększenie rozpoznawania antygenów nowotworowych [np. antygenów związanych z nowotworem (TAA) lub induktorów cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I] poprzez wspieranie dojrzewania komórek dendrytycznych w celu efektywnej prezentacji antygenu (cytokiny); rekrutacja i aktywacja pożądanych komórek odpornościowych, takich jak cytotoksyczne i pomocnicze limfocyty T [chemokiny, bispecyficzne zazębiacze limfocytów T (BTE)]; ukierunkowane na komórki supresyjne, takie jak limfocyty T regulatorowe, komórki supresorowe pochodzące z mieloidu, makrofagi związane z nowotworem i fibroblasty związane z rakiem (przeciwciała, aparaty zauszne, cytokiny); oraz zapobieganie hamowaniu i wyczerpaniu komórek efektorowych (inhibitory punktów kontrolnych). W ten sposób dostępnych jest mnóstwo czynników biologicznych. Ocena takich kodowanych przez wirusa immunomodulatorów pod kątem skuteczności terapeutycznej i możliwych synergii, a także zrozumienie odpowiednich mechanizmów jest niezbędna do poprawy terapii przeciwnowotworowej.
Jednoniciowe wirusy RNA z rodziny Paramyxoviridae charakteryzują się kilkoma cechami sprzyjającymi ich wykorzystaniu jako wektorów onkolitycznych. Należą do nich naturalny onkotropizm, duża zdolność genomowa dla transgenów (ponad 5 kb)10,11, efektywne rozprzestrzenianie się, w tym tworzenie syncytii, oraz wysoka immunogenność12. W związku z tym stworzono platformy OV oparte na wirusie nosówki psów13, wirus świnki14, wirus rzekomego pomoru drobiu15, Sendai virus16,17, małpi wirus 518 oraz paramyksowirus Tupaia19. Przede wszystkim żywe atenuowane szczepy szczepionki przeciwko wirusowi odry (MV) poczyniły postępy w rozwoju przedklinicznym i klinicznym20,21. Te szczepy wirusa są używane od dziesięcioleci do rutynowych szczepień z doskonałymi wynikami bezpieczeństwa22. Ponadto nie ma ryzyka mutagenezy insercyjnej ze względu na ściśle cytozolową replikację paramyksowirusów. Dostępny jest wszechstronny system genetyki odwrotnej oparty na antygenomowym cDNA, który pozwala na wprowadzanie transgenów do dodatkowych jednostek transkrypcyjnych (ATU)11,23,24. Wektory MV kodujące symporter jodku sodu (MV-NIS) do obrazowania i radioterapii lub rozpuszczalny antygen rakowo-embrionalny (MV-CEA) jako marker zastępczy ekspresji genów wirusa są obecnie oceniane w badaniach klinicznych (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 i NCT00408590). Potwierdzono bezpieczne podawanie, a przypadki skuteczności przeciwnowotworowej zostały zgłoszone w poprzednich badaniach25,26,27,28,29,30 (recenzja Msaouel et al.31), torując drogę dla dodatkowych onkolitycznych wirusów odry, które zostały opracowane i przebadane przedklinicznie. Wykazano, że cząsteczki immunomodulujące kodujące MV ukierunkowane na różne etapy cyklu rak-odporność opóźniają wzrost guza i / lub przedłużają przeżycie u myszy, z dowodami na skuteczność o podłożu immunologicznym i długotrwałą ochronną pamięć immunologiczną w syngenicznych modelach myszy. Transgeny kodowane wektorowo obejmują czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF)32,33, białko aktywujące neutrofile H. pylori34, inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych35, interleukina-12 (IL-12)36, TAAs37 oraz BTEs38, które sieciują antygen powierzchniowy guza z CD3, a tym samym indukują aktywność przeciwnowotworową przez poliklonalne limfocyty T, niezależnie od swoistości receptora limfocytów T i kostymulacji (<silna klasa = "xfig">Figura 1). Obiecujące wyniki przedkliniczne uzyskane dla tych konstruktów wymagają dalszych wysiłków translacyjnych.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), wirus opryszczki pospolitej typu typu kodujący GM-CSF, jest jedynym onkolitycznym środkiem terapeutycznym zatwierdzonym przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejską Agencję Leków (EMA). Badanie III fazy, które doprowadziło do zatwierdzenia pod koniec 2015 r., wykazało nie tylko skuteczność w miejscu wstrzyknięcia do guza, ale także efekty abskopijne (tj. remisje zmian bez wstrzyknięć) w zaawansowanym czerniaku39. Od tego czasu T-VEC rozpoczął dodatkowe badania kliniczne w celu zastosowania w innych jednostkach nowotworowych (np. nieczerniakowy rak skóry, NCT03458117 rak trzustki NCT03086642) oraz do oceny terapii skojarzonych, zwłaszcza z inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 i Ribas et al.40).
To pokazuje nie tylko potencjał immunoterapii onkolitycznej, ale także potrzebę dalszych badań w celu zidentyfikowania lepszych kombinacji OVT i immunomodulacji. Kluczowe dla tego przedsięwzięcia jest racjonalne zaprojektowanie dodatkowych wektorów i ich opracowanie do badań przedklinicznych. Pozwoli to również na lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw choroby nowotworowej i będzie miało wpływ na postęp w kierunku bardziej spersonalizowanego leczenia raka. W tym celu w niniejszej publikacji przedstawiono metodologię modyfikacji i rozwoju paramyksowirusów do celowanej immunoterapii nowotworów, a dokładniej onkolitycznych wirusów odry kodujących przeciwciała angażujące limfocyty T (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).

<table><tbody><tr><td>Szybki DNA Dephos & Zestaw do ligacji</td><td>Roche Life Science, Mannheim, Niemcy</td><td>4898117001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania CloneJET PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>K1231</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu QIAGEN</td><td>, Hilden, Niemcy</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>NEB 10-beta Kompetentny E. coli</td><td>New England Biolabs (NEB), Frankfurt nad Menem, Niemcy</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>LB medium po Lennox</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>X964.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Miniprep Kit</td><td>QIAGEN, Hilden, Niemcy</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny HindIII-HF</td><td>New England Biolabs (NEB), Frankfurt nad Menem, Niemcy</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen, Darmstadt, Niemcy</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biosera, Boussens, Francja</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Promega, Mannheim, Niemcy</td><td>E2311</td><td>można zastąpić wybranym odczynnikiem do transfekcji</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>K0129</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa Vero</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>CCL81</td><td></td></tr><tr><td>B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td><td>J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td><td></td><td>dostępne na żądanie</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ, Brunszwik, Niemcy</td><td>ACC 342</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (podłoże bez surowicy)</td><td>Gibco Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Komórka kolorymetryczna Viability Kit III (XTT)</td><td>PromoKine, Heidelberg, Niemcy</td><td>PK-CA20-300-1000</td><td>zawiera odczynnik XTT</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td><td>QIAGEN, Hilden, Niemcy</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membrana, 10&nbsp; kDa</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA Merck</td><td>Milipore</td><td>71285-3</td><td></td></tr><tr><td>IgG z ludzkiej surowicy</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-PE</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-092-257</td><td>RRID: AB_871939</td></tr><tr><td>Mysia IgG1, kontrola izotypu kappa, fikoerytryna sprzężona, klon MOPC-21 przeciwciało</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy</td><td>555749</td><td>RRID: AB_396091</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-HA-biotyny, klon 3F10</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>12158167001</td><td>RRID: AB_390915</td></tr><tr><td>Mikrokulki antybiotynowe</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separator MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td><td>MB-030-0050</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 Test cytotoksyczności nieradioaktywnej</td><td>Promega, Mannheim, Niemcy</td><td>G1780</td><td>Zawiera 10x roztwór do lizy, roztwór substratowy (mieszanina substratów i bufor do oznaczania) i roztwór zatrzymujący</td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Corning, Reynosa, Meksyk</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Talerze 10 cm</td><td>Corning, Oneonta, NY, USA</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Szalki 15 cm</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe, TPP z dnem U,</td><td>Trasadingen, Szwajcaria</td><td>92097</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe, płaskodenne</td><td>Neolab, Heidelberg, Niemcy</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Neolab, Heidelberg, Niemcy</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Neolab, Heidelberg, Niemcy</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>nerbe plus, Winsen/Luhe, Niemcy</td><td>02-572-3001</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych T175</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m filters</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Skuteczna immunoterapia nowotworów ma potencjał, aby osiągnąć długoterminową kontrolę nowotworu. Pomimo ostatnich sukcesów klinicznych, nadal istnieje pilna potrzeba bezpiecznych i skutecznych terapii dostosowanych do indywidualnych profili immunologicznych guza. Wirusy onkolityczne umożliwiają indukcję przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych, a także ekspresję genów ograniczoną przez nowotwór. Protokół ten opisuje wytwarzanie i analizę ex vivo immunomodulujących wektorów onkolitycznych. Koncentrując się na przykład na wirusach szczepionki przeciwko odrze kodujących bispecyficzne komórki T, ogólna metodologia może zostać dostosowana do innych gatunków wirusów i transgenów. Prezentowany przepływ pracy obejmuje projektowanie, klonowanie, ratowanie i namnażanie rekombinowanych wirusów. Uwzględniono testy do analizy kinetyki replikacji i aktywności litycznej wektora, a także funkcjonalności izolowanego immunomodulatora ex vivo, co ułatwia generowanie nowych środków do dalszego rozwoju w modelach przedklinicznych i ostatecznie translacji klinicznej.

Rysunek 1 ilustruje mechanizm działania onkolitycznych wirusów odry kodujących bispecyficzne engagery limfocytów T. Schemat blokowy przedstawiający przebieg tego protokołu zaprezentowano na Rysunku 2. Rysunek 3 pokazuje przykład zmodyfikowanego genomu onkolitycznego wirusa odry. Stanowi on wizualną reprezentację specyficznych zmian wprowadzonych do antygenomu wirusa odry oraz szczegó...

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Niniejsza metoda może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie immunoterapii nowotworów poprzez ułatwienie opracowania wektorów onkolitycznych do ukierunkowanej immunomodulacji. Główną zaletą zastosowanego systemu genetyki odwrotnej jest jego wszechstronność; dzięki temu wektory mogą być dostosowywane do różnych problemów badawczych i celować w guzy o zróżnicowanych sygnaturach immunologicznych. Etapy propagacji wirusa, a w szczególności określenie optymalnego momentu zbioru wirusa, są trudne do opanowania na podstawie samego protokołu tekstowego, ponieważ tworzenie syncytiów musi być oceniane wizualnie w czasie.W celu rozpoczęcia projektu i klonowania rekombinowanych wektorów immunomodulujących, postępuj zgodnie z opisem w manuskrypcie. Niniejszy protokół opisuje konkretne kroki opracowania onkolitycznego wektora szczepionkowego przeciwko odrze, kodującego bispecyficzny angażer limfocytów T. Aby odzyskać wirusa odry z cDNA, na 24 godziny przed transfekcją wysiej komórki producenta wirusa odry równomiernie na płytce 6-dołkowej.Wysiać 200 000 komórek w 2 mililitrach DMEM zawierającego 10 procent FBS na każdą studzienkę, aby uzyskać 65 do 75 procent konfluencji w momencie transfekcji. Wymieszać 5 mikrogramów rekombinacyjnego DNA kodującego antygenom wirusa odry, który zostanie użyty do transfekcji komórek, odpowiednie plazmidy oraz fluorescencyjny reporter w całkowitej objętości 200 mikrolitrów DMEM.Do mieszaniny dodaj 18,6 µL odczynnika do transfekcji liposomalnej i natychmiast potrząśnij probówką, aby wymieszać składniki. Inkubuj tę mieszaninę do transfekcji przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Aby przeprowadzić transfekcję komórek produkujących MV, usuń medium z płytki 6-dołkowej z hodowlą o konfluencji od 65 do 75% i dodaj do każdego dołka 1,8 mL DMEM z 2% FBS i 50 µg/mL kanamycyny.Następnie dodaj mieszaninę do transfekcji kroplami do każdej studzienki i ostrożnie zamieszaj. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia wymień medium na 2 mL świeżego DMEM z 2% FBS i 50 µg/mL kanamycyny i powtarzaj tę czynność, gdy medium stanie się zakwaszone, co objawia się żółtym kolorem.Użyj mikroskopu, aby codziennie obserwować komórki pod kątem ekspresji genu reporterowego i tworzenia syncytiów. Zbierz wirusa, gdy widoczne będą duże syncytia składające się z 20 lub więcej komórek lub gdy komórki staną się zbyt gęste. Na 24 godziny przed planowanym zbiorem wysiej około 1,5 miliona komórek producentów MV w 12 mililitrach DMEM z 10 procent FBS na płytkach 10 centymetrów, aby uzyskać 65 do 75 procent konfluencji w momencie inokulacji wirusem.Aby zebrać potomstwo wirusa, należy użyć skrobaka do komórek, aby ostrożnie zeskrobować przylegające komórki producenta z płytki 6-dołkowej z transfekowanymi komórkami. Przenieść medium zawierające zeskrobane komórki do probówki wirówkowej. Wirować przy co najmniej 2500 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby usunąć szczątki komórkowe.Po wirowaniu wymieszaj supernatant pozbawiony komórek z pożywką bezsurowiczą do uzyskania objętości końcowej 4 mililitrów w celu przygotowania inokulum. Usuń pożywkę z szalki o średnicy 10 centymetrów z komórkami produkującymi MV i dodaj inokulum do komórek. Inkubuj przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy 5 procentach dwutlenku węgla.Po inkubacji dodaj 6 mililitrów DMEM z 10 procent FBS i inkubuj komórki przez noc. Następnie wymień medium na 12 mililitrów świeżego DMEM z 10 procent FBS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procent dwutlenku węgla do momentu zbioru. Obserwuj komórki co najmniej dwa razy dziennie.Przed pęknięciem syncytiów, gdy widoczna stanie się destrukcja błon, należy zebrać wirusa. Aby zebrać wirusa z pierwszego pasażu, należy usunąć nadsączz z płytki i dodać 600 µL medium beztłuszczowego. Następnie należy użyć skrobaka do komórek, aby zebrać komórki i przenieść je do czystej probówki.Następnie natychmiast zamroź zawiesinę wirusa w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80°C przez co najmniej 24 godziny, aby zapewnić całkowite zamrożenie. Aby oznaczyć miano zapasów wirusa, wykonaj pomiar w ośmiokrotnych powtórzeniach dla każdej porcji, używając płytek 96-dołkowych. Najpierw połącz komórki produkcyjne z kolb T75 do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.Policz komórki i dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej do 150 000 komórek na mililitr w medium DMEM z 10% FBS. Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej dodaj 90 µL DMEM z 10% FBS. Następnie dodaj 10 µL z jednej alikwoty zapasu wirusa do wszystkich 8 studzienek w pierwszej kolumnie płytki.Wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 10 µL z każdej studzienki z pierwszej do drugiej kolumny, a następnie wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół. Powtórz tę czynność dla każdej kolejnej kolumny, aby uzyskać dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne wirusa, używając świeżych końcówek do pipety na każdym etapie rozcieńczania.Odrzuć 10 µL z każdej studni ostatniej kolumny. Do każdej studni dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej o stężeniu 150 000 komórek/mL, upewniając się, że nie występują skupiska komórek. Inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 48 godzin.Sprawdź obecność syncytiów za pomocą mikroskopu świetlnego. Policz syncytia w każdej studzience kolumny o najwyższym czynniku rozcieńczenia, w której widoczne są syncytia. W przypadku wirusów kodujących reporter fluorescencyjny, syncytia można policzyć przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.W celu analizy kinetyki replikacji wirusa odry, na dzień przed infekcją, wysiać 100 000 komórek Vero w 1 mililitrze DMEM z 10 procent FBS na studnię w płytkach 12-dołkowych, zapewniając co najmniej 2 studnie dla każdego badanego punktu czasowego. Aby zainfekować komórki, wymienić medium na 300 mikrolitrów medium bezsurowiczego zawierającego odpowiednią ilość wirusa. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procent dwutlenku węgla przez co najmniej 2 godziny.Usunąć inokulum, dodać 1 mililitr DMEM z 10 procent FBS i kontynuować inkubację. W odpowiednich punktach czasowych po infekcji zebrać potomstwo wirusowe poprzez bezpośrednie zeskrobanie komórek do pożywki. Przenieść zawartość z każdej studzienki do oddzielnej probówki.Zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu miareczkowania, a następnie postępować zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby rozpocząć ocenę cytotoksyczności indukowanej przez BTE, zależnej od komórek, poprzez uwalnianie LDH, należy najpierw wyizolować wydzielone produkty transgenu ekspresowane przez zainfekowane wirusem komórki docelowe oraz wyizolować efektorowe komórki odpornościowe zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie wysiać komórki docelowe na płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U i dołączyć próbki zgodnie z opisem w manuskrypcie.Do odpowiednich próbek dodać wcześniej wyizolowane immunomodulatory w pożądanych stężeniach. Dodać komórki efektorowe układu odpornościowego w pożądanych proporcjach, a następnie uzupełnić objętość pożywką do całkowitej objętości 100 µL na dołek. Inkubować przez wcześniej określony czas w temperaturze 37 °C i przy 5% zawartości CO2.Na 45 minut przed pobraniem próbek dodać 10 µL 10X Lysis Solution do dołków zawierających próbki T-max oraz odpowiadające im kontrole medium i kontynuować inkubację. Wirować komórki z prędkością 250 ×g przez 4 minuty. Przenieść 50 µL supernatantu z każdego dołka do dołków płaskodنnej płytki 96-dołkowej, uważając, aby nie przenieść komórek.Po przygotowaniu roztworu substratu zgodnie z instrukcją producenta, dodać 50 µL do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut lub do momentu, aż próbki T-max zmienią kolor na ciemnoczerwony. Po inkubacji dodać 50 µL roztworu zatrzymującego do każdej studzienki.Wiruj przez 1 minutę przy 4000 ×g, a następnie użyj igły z pustym przekrojem, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Zmierz absorbancję optyczną przy 490 nanometrach i wykonaj obliczenia zgodnie z opisem w manuskrypcie. Po inokulacji niezmodyfikowanymi oraz kodującymi BTE onkolitycznymi wirusami odry, krzywe wzrostu porównywanych wektorów na komórkach Vero wydają się podobne.Krzywe żywotności komórek mc38 (mysia linia raka jelita grubego) stabilnie eksponujących ludzki antygen karkinoembrionalny oraz receptory MV CD46 po inokulacji wykazują, że aktywność lityczna wirusa kodowanego przez transgen jest opóźniona w mysiej linii komórkowej nowotworu. Cytometria przepływowa komórek eksponujących antygen docelowy, inkubowanych z BTE w pięciu różnych rozcieńczeniach, wykazała wiązanie BTE przez komórki w sposób zależny od stężenia. Immunoblot po magnetycznym wyciąganiu (pull down) komórek związanych z BTE wykazał, że przy użyciu BTE nietargetujących nie stwierdzono obecności komórek, natomiast przy zastosowaniu próbek BTE targetujących, związane komórki były obecne w frakcji elucyjnej.Zależna od stężenia i swoista względem antygenu docelowego cytotoksyczność mysich komórek T indukowana przez BTE została wykazana w reprezentatywnym teście uwalniania LDH, który wskazuje, że w niniejszym przykładzie osiągnięto 15% swoistej śmierci komórkowej przy stosunkowo wysokim stężeniu BTE wynoszącym 1 µg/mL w porównaniu z komórkami referencyjnymi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby regularnie monitorować komórki w celu sprawdzenia postępu infekcji. Należy pamiętać, że rekombinowane szczepy szczepionki przeciw odrze, mimo że są atenuowane, mogą być niebezpieczne, zwłaszcza dla osób z niedoborem odporności.Należy unikać ekspozycji, przestrzegając odpowiednich procedur bezpieczeństwa biologicznego. Osoby pracujące z wirusami powinny zostać zaszczepione przed przeprowadzeniem tych metod. Po zastosowaniu tej procedury można uzyskać ekspresję wirusową kolejnych transgenów w celu analizy oddziaływań wirus-gospodarz oraz efektów terapeutycznych.Rozwój tych technik utorował drogę badaczom z dziedziny bioterapii do zgłębiania efektów działania lokalnie eksprymowanych immunomodulatorów w licznych jednostkach nowotworowych; in vitro, in vivo, a także w badaniach klinicznych.

paramyxoviruses-for-tumor-targeted-immunomodulation-design-evaluation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Paramyxowirusy do immunomodulacji ukierunkowanej na guzy: projektowanie i ocena ex vivo

Opisano wydajny protokół ekspansji ex vivo limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi, izolowanych z węzłów chłonnych drenujących guz lub innych wtórnych tkanek limfatycznych organizmów z nowotworem. Protokół ten pozwala na selektywną ekspansję swoistych dla nowotworu limfocytów T do zastosowania w adoptywnej immunoterapii raka piersi.

Ex vivo ekspansja limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi za pomocą bryostatyny 1/ionomycyny oraz formulacji cytokin wspólnego łańcucha gamma

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Ten film demonstruje test szczepienia nowotworów na bazie komórek. Mysz, której śródskórnie wstrzyknięto komórki czerniaka B16-F10 w celu powstania guza, jest szczepiona komórkami B16-F10 wydzielającymi cytokinę Flt3L w pobliżu rozwiniętego guza. Wydzielany Flt3L ze szczepionki wspomaga dojrzewanie i proliferację komórek dendrytycznych, które następnie prezentują antygeny nowotworowe limfocytom T w węzłach chłonnych, wywołując ukierunkowaną przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną.

Implantacja guza i wstrzyknięcie szczepionki przeciwnowotworowej w modelu mysim

Peptydy pochodzenia wirusowego sprzężone z koniugatami przeciwciał (AC) to podejście, które nabiera rozpędu ze względu na potencjał dostarczania ładunków molekularnych ze zwiększoną akumulacją komórek nowotworowych. Wykorzystując powszechne metody oceny koniugacji peptydów, akumulacji wewnątrzkomórkowej AC i ładunku oraz celowania w guz, protokół ten pomaga naukowcom w kluczowych początkowych fazach rozwoju.

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Ten manuskrypt opisuje, jak ocenić in vivo immunogenność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek nowotworowych (EVs) za pomocą cytometrii przepływowej. EV pochodzące z nowotworów poddawanych immunogennej śmierci komórek indukowanej leczeniem wydają się szczególnie istotne w nadzorze immunologicznym nad nowotworami. Protokół ten stanowi przykład oceny EV guza immunostymulującego indukowanego oksaliplatyną, ale można go dostosować do różnych ustawień.

In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Poznaj protokół generowania onkolicznych wirusów ospy wietrznej z immunomodulatorami dla terapii przeciwnowotworowej. Ta metoda umożliwia projektowanie wektorów dostosowanych do różnych typów nowotworów.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Przeglądaj więcej filmów