Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Niniejsza metoda może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie immunoterapii nowotworów poprzez ułatwienie opracowania wektorów onkolitycznych do ukierunkowanej immunomodulacji. Główną zaletą zastosowanego systemu genetyki odwrotnej jest jego wszechstronność; dzięki temu wektory mogą być dostosowywane do różnych problemów badawczych i celować w guzy o zróżnicowanych sygnaturach immunologicznych. Etapy propagacji wirusa, a w szczególności określenie optymalnego momentu zbioru wirusa, są trudne do opanowania na podstawie samego protokołu tekstowego, ponieważ tworzenie syncytiów musi być oceniane wizualnie w czasie.

W celu rozpoczęcia projektu i klonowania rekombinowanych wektorów immunomodulujących, postępuj zgodnie z opisem w manuskrypcie. Niniejszy protokół opisuje konkretne kroki opracowania onkolitycznego wektora szczepionkowego przeciwko odrze, kodującego bispecyficzny angażer limfocytów T. Aby odzyskać wirusa odry z cDNA, na 24 godziny przed transfekcją wysiej komórki producenta wirusa odry równomiernie na płytce 6-dołkowej.

Wysiać 200 000 komórek w 2 mililitrach DMEM zawierającego 10 procent FBS na każdą studzienkę, aby uzyskać 65 do 75 procent konfluencji w momencie transfekcji. Wymieszać 5 mikrogramów rekombinacyjnego DNA kodującego antygenom wirusa odry, który zostanie użyty do transfekcji komórek, odpowiednie plazmidy oraz fluorescencyjny reporter w całkowitej objętości 200 mikrolitrów DMEM.

Do mieszaniny dodaj 18,6 µL odczynnika do transfekcji liposomalnej i natychmiast potrząśnij probówką, aby wymieszać składniki. Inkubuj tę mieszaninę do transfekcji przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Aby przeprowadzić transfekcję komórek produkujących MV, usuń medium z płytki 6-dołkowej z hodowlą o konfluencji od 65 do 75% i dodaj do każdego dołka 1,8 mL DMEM z 2% FBS i 50 µg/mL kanamycyny.

Następnie dodaj mieszaninę do transfekcji kroplami do każdej studzienki i ostrożnie zamieszaj. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia wymień medium na 2 mL świeżego DMEM z 2% FBS i 50 µg/mL kanamycyny i powtarzaj tę czynność, gdy medium stanie się zakwaszone, co objawia się żółtym kolorem.

Użyj mikroskopu, aby codziennie obserwować komórki pod kątem ekspresji genu reporterowego i tworzenia syncytiów. Zbierz wirusa, gdy widoczne będą duże syncytia składające się z 20 lub więcej komórek lub gdy komórki staną się zbyt gęste. Na 24 godziny przed planowanym zbiorem wysiej około 1,5 miliona komórek producentów MV w 12 mililitrach DMEM z 10 procent FBS na płytkach 10 centymetrów, aby uzyskać 65 do 75 procent konfluencji w momencie inokulacji wirusem.

Aby zebrać potomstwo wirusa, należy użyć skrobaka do komórek, aby ostrożnie zeskrobować przylegające komórki producenta z płytki 6-dołkowej z transfekowanymi komórkami. Przenieść medium zawierające zeskrobane komórki do probówki wirówkowej. Wirować przy co najmniej 2500 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby usunąć szczątki komórkowe.

Po wirowaniu wymieszaj supernatant pozbawiony komórek z pożywką bezsurowiczą do uzyskania objętości końcowej 4 mililitrów w celu przygotowania inokulum. Usuń pożywkę z szalki o średnicy 10 centymetrów z komórkami produkującymi MV i dodaj inokulum do komórek. Inkubuj przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy 5 procentach dwutlenku węgla.

Po inkubacji dodaj 6 mililitrów DMEM z 10 procent FBS i inkubuj komórki przez noc. Następnie wymień medium na 12 mililitrów świeżego DMEM z 10 procent FBS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procent dwutlenku węgla do momentu zbioru. Obserwuj komórki co najmniej dwa razy dziennie.

Przed pęknięciem syncytiów, gdy widoczna stanie się destrukcja błon, należy zebrać wirusa. Aby zebrać wirusa z pierwszego pasażu, należy usunąć nadsączz z płytki i dodać 600 µL medium beztłuszczowego. Następnie należy użyć skrobaka do komórek, aby zebrać komórki i przenieść je do czystej probówki.

Następnie natychmiast zamroź zawiesinę wirusa w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80°C przez co najmniej 24 godziny, aby zapewnić całkowite zamrożenie. Aby oznaczyć miano zapasów wirusa, wykonaj pomiar w ośmiokrotnych powtórzeniach dla każdej porcji, używając płytek 96-dołkowych. Najpierw połącz komórki produkcyjne z kolb T75 do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.

Policz komórki i dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej do 150 000 komórek na mililitr w medium DMEM z 10% FBS. Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej dodaj 90 µL DMEM z 10% FBS. Następnie dodaj 10 µL z jednej alikwoty zapasu wirusa do wszystkich 8 studzienek w pierwszej kolumnie płytki.

Wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 10 µL z każdej studzienki z pierwszej do drugiej kolumny, a następnie wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół. Powtórz tę czynność dla każdej kolejnej kolumny, aby uzyskać dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne wirusa, używając świeżych końcówek do pipety na każdym etapie rozcieńczania.

Odrzuć 10 µL z każdej studni ostatniej kolumny. Do każdej studni dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej o stężeniu 150 000 komórek/mL, upewniając się, że nie występują skupiska komórek. Inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 48 godzin.

Sprawdź obecność syncytiów za pomocą mikroskopu świetlnego. Policz syncytia w każdej studzience kolumny o najwyższym czynniku rozcieńczenia, w której widoczne są syncytia. W przypadku wirusów kodujących reporter fluorescencyjny, syncytia można policzyć przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

W celu analizy kinetyki replikacji wirusa odry, na dzień przed infekcją, wysiać 100 000 komórek Vero w 1 mililitrze DMEM z 10 procent FBS na studnię w płytkach 12-dołkowych, zapewniając co najmniej 2 studnie dla każdego badanego punktu czasowego. Aby zainfekować komórki, wymienić medium na 300 mikrolitrów medium bezsurowiczego zawierającego odpowiednią ilość wirusa. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procent dwutlenku węgla przez co najmniej 2 godziny.

Usunąć inokulum, dodać 1 mililitr DMEM z 10 procent FBS i kontynuować inkubację. W odpowiednich punktach czasowych po infekcji zebrać potomstwo wirusowe poprzez bezpośrednie zeskrobanie komórek do pożywki. Przenieść zawartość z każdej studzienki do oddzielnej probówki.

Zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu miareczkowania, a następnie postępować zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby rozpocząć ocenę cytotoksyczności indukowanej przez BTE, zależnej od komórek, poprzez uwalnianie LDH, należy najpierw wyizolować wydzielone produkty transgenu ekspresowane przez zainfekowane wirusem komórki docelowe oraz wyizolować efektorowe komórki odpornościowe zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie wysiać komórki docelowe na płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U i dołączyć próbki zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Do odpowiednich próbek dodać wcześniej wyizolowane immunomodulatory w pożądanych stężeniach. Dodać komórki efektorowe układu odpornościowego w pożądanych proporcjach, a następnie uzupełnić objętość pożywką do całkowitej objętości 100 µL na dołek. Inkubować przez wcześniej określony czas w temperaturze 37 °C i przy 5% zawartości CO2.

Na 45 minut przed pobraniem próbek dodać 10 µL 10X Lysis Solution do dołków zawierających próbki T-max oraz odpowiadające im kontrole medium i kontynuować inkubację. Wirować komórki z prędkością 250 ×g przez 4 minuty. Przenieść 50 µL supernatantu z każdego dołka do dołków płaskodنnej płytki 96-dołkowej, uważając, aby nie przenieść komórek.

Po przygotowaniu roztworu substratu zgodnie z instrukcją producenta, dodać 50 µL do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut lub do momentu, aż próbki T-max zmienią kolor na ciemnoczerwony. Po inkubacji dodać 50 µL roztworu zatrzymującego do każdej studzienki.

Wiruj przez 1 minutę przy 4000 ×g, a następnie użyj igły z pustym przekrojem, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Zmierz absorbancję optyczną przy 490 nanometrach i wykonaj obliczenia zgodnie z opisem w manuskrypcie. Po inokulacji niezmodyfikowanymi oraz kodującymi BTE onkolitycznymi wirusami odry, krzywe wzrostu porównywanych wektorów na komórkach Vero wydają się podobne.

Krzywe żywotności komórek mc38 (mysia linia raka jelita grubego) stabilnie eksponujących ludzki antygen karkinoembrionalny oraz receptory MV CD46 po inokulacji wykazują, że aktywność lityczna wirusa kodowanego przez transgen jest opóźniona w mysiej linii komórkowej nowotworu. Cytometria przepływowa komórek eksponujących antygen docelowy, inkubowanych z BTE w pięciu różnych rozcieńczeniach, wykazała wiązanie BTE przez komórki w sposób zależny od stężenia. Immunoblot po magnetycznym wyciąganiu (pull down) komórek związanych z BTE wykazał, że przy użyciu BTE nietargetujących nie stwierdzono obecności komórek, natomiast przy zastosowaniu próbek BTE targetujących, związane komórki były obecne w frakcji elucyjnej.

Zależna od stężenia i swoista względem antygenu docelowego cytotoksyczność mysich komórek T indukowana przez BTE została wykazana w reprezentatywnym teście uwalniania LDH, który wskazuje, że w niniejszym przykładzie osiągnięto 15% swoistej śmierci komórkowej przy stosunkowo wysokim stężeniu BTE wynoszącym 1 µg/mL w porównaniu z komórkami referencyjnymi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby regularnie monitorować komórki w celu sprawdzenia postępu infekcji. Należy pamiętać, że rekombinowane szczepy szczepionki przeciw odrze, mimo że są atenuowane, mogą być niebezpieczne, zwłaszcza dla osób z niedoborem odporności.

Należy unikać ekspozycji, przestrzegając odpowiednich procedur bezpieczeństwa biologicznego. Osoby pracujące z wirusami powinny zostać zaszczepione przed przeprowadzeniem tych metod. Po zastosowaniu tej procedury można uzyskać ekspresję wirusową kolejnych transgenów w celu analizy oddziaływań wirus-gospodarz oraz efektów terapeutycznych.

Rozwój tych technik utorował drogę badaczom z dziedziny bioterapii do zgłębiania efektów działania lokalnie eksprymowanych immunomodulatorów w licznych jednostkach nowotworowych; in vitro, in vivo, a także w badaniach klinicznych.