Name: Wykorzystanie systemów robotycznych do przetwarzania i osadzania próbek myszy okrężnicy do analiz histologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Poznaj zautomatyzowany protokół przetwarzania tkanek myszy okrężnicy przy użyciu systemów robotycznych. Ta metoda poprawia jakość próbek i standaryzację procedur histopatologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Wydziałowi Patologii Szpitala Poliklinicznego IRCCS w Mediolanie za wsparcie techniczne oraz Zakładowi Zwierząt IEO za pomoc w hodowli zwierząt.

Procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (Auth. 127/15, 27/13) i były zgodne z wytycznymi Europejskiego Instytutu Onkologii IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Indukcja przewlekłego zapalenia jelita grubego przez powtarzające się podawanie DSS
<ol>
	<li>Oddzielne myszy dopasowane pod względem wieku i płci w 2 grupach (leczenie DSS vs. kontrola H2O, co najmniej 5 miotu myszy na grupę eksperymentalną).</li>
	<li>Podawać 2,5% DSS (40 kDa) w wodzie pitnej przez 7 dni grupie leczonej i wodzie grupie kontrolnej. 
	nuta: Model ten wywołuje przewlekłe przezścienne zapalenie jelit9.</li>
	<li>Po 7 dniach należy przerwać leczenie DSS i podawać wodę obu grupom przez 14 dni. Powtórz ten proces 3 razy. 
	UWAGA: Powtarzające się podawanie DSS wywołuje zmiany w błonie śluzowej jelita grubego bardzo przypominające ludzkie IBD, tj. zwłóknienie9.</li>
	<li>Myszy należy składać w ofierze zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny IACUC, tj. przez wdychanie CO2 .</li>
	<li>Otwórz brzuch myszy i otrzewną za pomocą skalpela. 
	nuta: Sterylność jest zalecana, ale nie jest ściśle wymagana.</li>
	<li>Oddziel okrężnicę od jelita cienkiego za pomocą kleszczy i pęsety. Wytnij okrężnicę pęsetą i kleszczami. 
	nuta: Pomiar długości jelita grubego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) to metoda określania, czy zapalenie jelita grubego wystąpiło u myszy leczonych DSS.</li>
	<li>Opłucz okrężnicę na szalce Petriego z 10 ml zimnego 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) i delikatnie dociśnij, aby usunąć kał.</li>
</ol>
2. Utrwalanie tkanek mysich
<ol>
	<li>Zanurz każdą próbkę mysiej okrężnicy w 10 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF) w temperaturze pokojowej (RT). 
	nuta: Sterylność jest zalecana, ale nie jest ściśle wymagana.</li>
	<li>Utrwalaj tkankę przez 18–24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Cięcie jelita grubego i przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Usuń utrwalone chusteczki z pojemnika NBF za pomocą małej pęsety i umieść je na szalce Petriego. Umieść dwukropek na płycie roboczej do krojenia za pomocą małej pęsety.</li>
	<li>Dwukropki pokrój na kawałki (o długości od 0,2 cm do 0,3 cm) sterylnym skalpelem. Ta długość fragmentu jest optymalna, aby nie przekraczać grubości kasety.</li>
	<li>Podnieś jeden segment dwukropka za pomocą małej pęsety (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Włóż jeden segment dwukropka do jednej z plastikowych wystających końcówek zorientowanej kasety do zatapiania parafiny za pomocą małej pęsety (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Powtórz operację (3.2–3.3) z dodatkowymi 3 segmentami dwukropka na kasetę. Unikaj wkładania segmentów w sąsiednie wystające końcówki, aby zminimalizować nakładanie się tkanek</li>
	<li>Szczelnie zamknij kasetę, ostrożnie dociskając cztery krawędzie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Unikaj ściskania tkanki, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki.</li>
	<li>Włóż siatkę do plastikowej ramy nośnej. Oznacz ramę nośną, aby zidentyfikować próbkę. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki biologicznej.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Włącz automatyczny procesor, naciskając przycisk zasilania (Rysunek 3A, 3B).</li>
	<li>Rozgrzej się przez 1 godzinę, aby zapewnić stopienie wosku parafinowego. Poczekaj, aż przyrząd potwierdzi, że parafina jest całkowicie stopiona, obserwując obecność dedykowanej ikony (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Włóż każdą zorientowaną kasetę (zawierającą próbki tkanek) ręcznie do metalowego kosza dostarczonego przez automatyczny procesor (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D). Umieść kasety pionowo, ustawiając je blisko siebie, aby zoptymalizować zajętość kosza.</li>
	<li>Zamknij metalowy kosz (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E).</li>
	<li>Otwórz pokrywę retorty (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F). Retorta to miejsce, w którym kosz jest wkładany do maszyny. Włóż koszyk do dedykowanej obudowy procesora (<silna klasa="xfig">Rysunek 3G). Zamknij pokrywę retorty (Rysunek 3H).</li>
	<li>Użyj ekranu dotykowego na komputerze instrumentu, aby zdefiniować protokół roboczy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3I). Należy wybrać sekwencję rozwiązań, czas i temperaturę, które mają zostać wdrożone, zgodnie ze schematem przedstawionym w tabeli 1.</li>
	<li>Przypisz protokół, który ma zostać uruchomiony na retorcie zawierającej koszyk, klikając na dedykowaną ikonę komputera (Rysunek 3J). Uruchom protokół, klikając przycisk Start (Rysunek 3L).</li>
	<li>Poczekaj, aż przyrząd potwierdzi koniec protokołu, obserwując obecność dedykowanej ikony i słysząc sygnał alarmowy dochodzący z urządzenia.</li>
	<li>Otwórz pokrywę retorty. Wyjmij kosz z procesora (<silna klasa="xfig">Rysunek 3M).</li>
</ol>
5. Osadzanie tkanek
<ol>
	<li>Włącz automatyczne osadzanie, naciskając przycisk zasilania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>Rozgrzej się przez 1 godzinę, aby zapewnić stopienie wosku parafinowego. Poczekaj, aż przyrząd potwierdzi, że parafina jest całkowicie stopiona, obserwując temperaturę kąpieli parafinowej wskazywaną przez wewnętrzny termometr przyrządu.</li>
	<li>Ręcznie przenieś wszystkie przetworzone kasety z kosza procesora do stojaka do zatapiania. Każdy stojak może pomieścić do 32 kaset. (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B, 4C).</li>
	<li>Otwórz główną pokrywę osadzacza (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C, 4D, 4E).</li>
	<li>Użyj ekranu dotykowego na komputerze przyrządu, aby zasygnalizować systemowi robota, że stojak jest wkładany (Rysunek 4F).</li>
	<li>Otwórz pokrywę obudowy wlotu powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 4G). Włóż stojak do obudowy wlotowej. Każdy moduł osadzający może zawierać do 4 stojaków jednocześnie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4H, 4I). Zamknij pokrywę obudowy wlotu powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 4J).</li>
	<li>Użyj ekranu dotykowego na komputerze instrumentu, aby rozpocząć procedurę osadzania, zgodnie z tabelą 2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4K). 
	UWAGA: Osadzenie każdego stojaka z 32 kasetami zajmuje 45 minut.</li>
	<li>Poczekaj, aż instrument potwierdzi koniec protokołu, obserwując obecność dedykowanej ikony (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4L).</li>
	<li>Wyjmij stojak wylotowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 4M). Zamknij główną pokrywę osadzawki.</li>
	<li>Wyjmij osadzone bloki (zawierające siatki orientacyjne) ze stojaka. Przenieś osadzone klocki w kartonowym pudełku do przechowywania.</li>
</ol>
6. Cięcie mikrometryczne
<ol>
	<li>Włącz płytę chłodzącą mikrotomu. Ustaw temperaturę w zakresie od -8 do -10 °C.</li>
	<li>Włączyć termostatyczną łaźnię wodną mikrotomu, zawierającą 2 l wody destylowanej. Ustawić temperaturę łaźni wodnej w zakresie 42–45 °C.</li>
	<li>Umieść bloki zatopione w parafinie na płycie chłodzącej. Odczekaj co najmniej 5 minut, aby bloki ostygły.</li>
	<li>Wyjmij jeden blok z płyty chłodzącej i umieść go w uchwycie bloku mikrotomu.</li>
	<li>Ustaw grubość cięcia mikrotomu na 10 μm. Przytnij blok, przycinając go 6 razy o grubości 10 μm.</li>
	<li>Zmień ustawienie grubości mikrotomu z 10 μm na 3 μm. Wytnij jeden odcinek 3 μm do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E).</li>
	<li>Zbierz odcinek 3 μm za pomocą małej szczoteczki. Umieść odcinek 3 μm w łaźni wodnej, układając go ostrożnie na powierzchni wody, aby zmniejszyć zmarszczki tkanek. Pobrać wycinek tkanki z łaźni wodnej sterowanej termostatycznie na pojedynczym szkiełku podstawowym.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby wytnij dodatkowe sekcje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz szkiełko szkiełkowe, wpisując dane identyfikacyjne próbki.</li>
	<li>Wstaw szkiełka do piekarnika o temperaturze 37 °C na co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Szkiełka należy umieszczać w stojakach do natychmiastowych analiz lub w pudełkach do przechowywania.</li>
</ol>
7. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
<ol>
	<li>Włącz automatyczny winiar, naciskając przycisk zasilania. Zezwól na inicjalizację ramienia robota, obserwując zmianę pręta załadowczego na monitorze przyrządów.</li>
	<li>Włóż szkiełka do stojaka na witraże, wkładając pionowo do 30 szkiełek.</li>
	<li>Oznacz stojak odpowiednią plastikową etykietą do identyfikacji radiowej (RFID). Znakowanie RFID to system identyfikujący prawidłowy protokół barwienia załadowany do komputera barwierki.</li>
	<li>Włóż stojak do bejcy. Pozwól komputerowi automatycznie załadować i uruchomić protokół barwienia zgodnie z rozpoznaniem tagu RFID. 
	nuta: Protokół barwienia H&E jest opisany w tabeli 3.</li>
</ol>
8. Barwienie immunohistochemiczne
<ol>
	<li>Wykonaj barwienie immunohistochemiczne i trichromowe Mallory'ego, jak opisano wcześniej7.</li>
</ol>

<ol><li>Gibson-Corley, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+Integration+of+the+Histology+Core+Laboratory+in+Translational+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+histotechnology%22%5BJournal%5D)">Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research.</a> Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).</li>
<li>Olivier, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+species+in+research%3A+Opportunities+and+challenges+for+the+histology+core+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+histotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory.</a> Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).</li>
<li>Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+valid+histopathologic+scoring+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+pathology%22%5BJournal%5D)">Principles for valid histopathologic scoring in research.</a> Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).</li>
<li>Stolfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+interleukin-21+in+the+regulation+of+colitis-associated+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li>
<li>Peters, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+SR+%22A+Practical+Guide+to+Frozen+Section+Technique%22">A Practical Guide to Frozen Section Technique</a>. , New York, N.S.N.Y. (2010).</li>
<li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosai%2C+J+%22Rosai+and+Ackerman%27s+Surgical+Pathology%22">Rosai and Ackerman's Surgical Pathology</a>. , Elsevier. (2011).</li>
<li>Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+mucosal+inflammation+and+their+relation+to+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease.</a> Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease.</a> Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).</li>
<li>Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+an+automated+inclusion+system+for+the+histological+analysis+of+murine+tissue+samples%3A+A+feasibility+study+in+DSS-induced+chronic+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis.</a> European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystujemy różne zautomatyzowane kroki podczas przygotowania tkanek myszy do analizy histopatologicznej. Protokół ten ma na celu dostarczenie wskazówek technicznych w celu zwiększenia odtwarzalności i standaryzacji całego procesu, a tym samym poprawy ogólnej jakości końcowej oceny histopatologicznej. Wdrożyliśmy zautomatyzowane instrumenty i metody do przygotowywania i osadzania tkanek, rutynowo stosowane w podstawowych obiektach patologii do badania próbek ludzkich.
Aby wykazać potencjaln...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58654/using-robotic-systems-to-process-embed-colonic-murine-samples-for">Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.
The affiliation for Claudia&#160;Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58654/using-robotic-systems-to-process-embed-colonic-murine-samples-for">Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.

Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

W ostatnich dziesięcioleciach opracowano kilka eksperymentalnych modeli do analizy mechanizmów patogennych prowadzących do chorób u ludzi1,2. Aby ocenić nasilenie choroby, badacze muszą ocenić efekt leczenia i zbadać cytologiczne i histologiczne różnice architektoniczne lub ilość stanu zapalnego3. Aby przeprowadzić te badania na tych modelach eksperymentalnych, potrzebne są szczegółowe analizy histopatologiczne, często porównujące próbki mysie i ludzkie4,5.
Dodatkowo, próbki ludzkie są powszechnie przetwarzane i oceniane przez główne placówki histopatologii i doświadczonych patologów za pomocą standardowych kryteriów i metod histopatologicznych. I odwrotnie, tkanki mysie są zwykle ustalane, osadzane i analizowane przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w protokołach histopatologicznych. Jakość i rzetelność badania histopatologicznego zaczyna się od przygotowania wysokiej jakości wycinków tkanek. Kilka czynników ma decydujący wpływ na zwiększenie lub obniżenie jakości końcowej analizy, w tym utrwalenie, makroskopowe przekroje, przetwarzanie, zatapianie parafiny i osadzanie próbek6,7.
Wszystkie te przejścia związane z manipulacją próbką są poddawane ręcznym błędom, w tym ręcznemu osadzaniu próbek oraz, w mniejszym stopniu, ręcznemu cięciu i barwieniu mikrotomów. Obecnie cały proces przygotowania tkanek mysich do oceny histologicznej opiera się na protokołach, które różnią się w zależności od laboratorium i protokołu ręcznego. Celem tego badania jest wdrożenie ustandaryzowanych zautomatyzowanych protokołów w celu zmniejszenia błędów i zmienności w badaniu histopatologicznym na myszach.
O naszej wiedzy, opisujemy tutaj pierwsze protokoły do w pełni zautomatyzowanego przetwarzania i osadzania tkanek do oceny histologicznej tkanek mysich; są one rutynowo używane w jednostkach patologii do analiz próbek ludzkich. Jako praktyczny przykład wykonalności metody przeanalizowano mysi model zapalenia jelit, tj. model przewlekłego zapalenia jelita grubego spowodowanego wielokrotnym podawaniem siarczanu sodu dekstranu (DSS) w wodzie pitnej8,9. To eksperymentalne ustawienie bardzo przypomina ludzkie nieswoiste zapalenie jelit (IBD)10, ponieważ zwierzęta leczone DSS wykazują oznaki zapalenia jelit, np. utratę wagi, luźny stolec lub biegunkę, skrócenie jelita grubego, a także zwłóknienie8,9,11. Jak zaobserwowano u pacjentów z IBD, leczenie DSS generuje złożony przebieg choroby. W tym kontekście konieczne są szczegółowe oceny histologiczne, aby zrozumieć głębokie zmiany w architekturze tkanki. W związku z tym wdrożenie opisanych protokołów w celu poprawy jakości przygotowania próbek może przynieść korzyści naukowcom polegającym na interpretacji analiz histologicznych i immunohistochemicznych w warunkach eksperymentalnych na myszach. Mysie modele doświadczalne chorób człowieka obejmujące zmiany w architekturze tkanek, obecność nacieku tkanki komórkowej lub stan zapalny w różnych tkankach i narządach (jelito, mózg, wątroba, skóra) mogą wykorzystać zwiększoną jakość przygotowania próbki do badania histopatologicznego.

<table><tbody><tr><td>Bezwodny etanol absolutny</td><td>Carlo Erba</td><td>414605</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>Absolute ETOH</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik Aluminium Potassium Sulfate</td><td>SIGMA</td><td>A6435</td><td></td></tr><tr><td>Aniline Blue</td><td>Odczynnik</td><td>415049 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Fuchsin</td><td>SIGMA</td><td>C4165</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (klon M1/70)</td><td>TONBO biosciences</td><td>35-0112-U100</td><td>przeciwciało</td></tr><tr><td>CD20 IHC (klon SA275A11)</td><td>Przeciwciało 150403 Biolegend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 (17A2)</td><td>TONBO biosciences</td><td>35-0032-U100</td><td>przeciwciało</td></tr><tr><td>CD4 (GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>552051</td><td>przeciwciało</td></tr><tr><td>CD45.2 (klon 104)</td><td>Przeciwciało 109837 BioLegend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 (53-6,7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553031</td><td>przeciwciało</td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowy pH 6 10x</td><td>odczynnik SIGMA</td><td>C9999</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td>Dab</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Microgem</td><td>L0615-500</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>DSS</td><td>TdB Consultancy</td><td>Odczynnik</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Flex Odczynnik blokujący peroksydazę</td><td>DAKO</td><td></td><td>compreso w GV80011-2</td></tr><tr><td>EnVision Flex Substrate</td><td>DAKO</td><td></td><td>compreso w GV80011-2</td></tr><tr><td>EnVision Flex/HRP</td><td>DAKO</td><td></td><td>compreso w GV80011-2</td></tr><tr><td>EnVision Flex+ Rat Linker</td><td>DAKO</td><td></td><td>compreso w GV80011-2</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>1.09844</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>F4/80 (klon BM8)</td><td>Przeciwciało BioLegend</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>PanReac</td><td>2,529,311,215</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>SIGMA</td><td>71251</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Kozioł-anty-Szczur-HRP</td><td>Przeciwciało Agilent DAKO</td><td>P0448</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Odczynnik</td><td>DIAPATH</td><td>C0303</td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy LEICA (RM2255)</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td>sprzęt</td></tr><tr><td>Ly6g (klon 1A8)</td><td>Przeciwciało 551459 BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td>203793</td><td>Mercury II Oxide</td><td>SIGMA</td></tr><tr><td>Omnis Clearify Clearing Agent</td><td>DAKO</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>Omnis EnVision Flex TRS</td><td>DAKO</td><td>GV80011-2</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>SIGMA</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Odczynnik Sakura</td><td>7052</td><td></td></tr><tr><td>Peloris</td><td>Sprzęt LEICA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Percoll</td><td>SIGMA</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 bez L-Glutaminy</td><td>Microgem</td><td>L0501-500</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>STS020</td><td>Sprzęt Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Teck Paraform Sectionable Kaseta</td><td>SAKURA</td><td>7022</td><td>sprzęt</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Zautomatyzowany zatapiacz parafiny</td><td>Sprzęt Sakura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Xylene</td><td>J.T.Baker</td><td>8080.1000</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie systemów robotycznych do przetwarzania i osadzania próbek myszy okrężnicy do analiz histologicznych

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Zrozumienie ludzkich chorób znacznie się poszerzyło dzięki badaniom na modelach zwierzęcych. Niemniej jednak ocena histopatologiczna modeli eksperymentalnych musi być równie rygorystyczna, jak w przypadku próbek ludzkich. Rzeczywiście, na wyciąganie wiarygodnych i dokładnych wniosków decydujący wpływ ma jakość przygotowania wycinków tkanek. W tym miejscu opisujemy protokół analizy histopatologicznej tkanek myszy, który realizuje kilka zautomatyzowanych kroków podczas zabiegu, od wstępnego przygotowania do zatopienia parafiny w próbkach myszy. Redukcja zmiennych metodologicznych poprzez rygorystyczną standaryzację protokołów z procedur zautomatyzowanych przyczynia się do zwiększenia ogólnej wiarygodności analizy patologicznej u myszy. W szczególności protokół ten opisuje wykorzystanie zautomatyzowanych systemów robotycznych do przetwarzania i osadzania, rutynowo stosowanych do przetwarzania tkanek i zatapiania parafiny w próbkach ludzkich, do przetwarzania mysich próbek zapalenia jelit. Stwierdzamy, że wiarygodność badania histopatologicznego tkanek myszy znacznie wzrasta po wprowadzeniu wystandaryzowanych i zautomatyzowanych technik.

Eksperymentalne przewlekłe zapalenie jelita grubego indukowane powtarzalnym podawaniem DSS w wodzie pitnej jest mysim modelem zapalenia jelit ściśle przypominającym ludzkie IBD8,9. Rysunek 1 przedstawia efekty leczenia DSS, w tym skrócenie jelita grubego (Rysunek 1A), będące powszechnie stosowanym parametrem oceny występowania zapalenia indukowanego DSS, oraz ekspresję ge...

Brak standaryzacji przetwarzania tkanek mysich obniża jakość analizy histopatologicznej myszy w porównaniu do próbek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania badania histopatologicznego mysich tkanek okrężnicy objętych stanem zapalnym i bez stanu zapalnego, aby wykazać wykonalność systemów robotycznych rutynowo stosowanych do przetwarzania i osadzania próbek ludzkich.

Wykorzystanie systemów robotycznych do przetwarzania i osadzania próbek myszy okrężnicy do analiz histologicznych

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Ten zautomatyzowany protokół umożliwia przygotowanie histopatologiczne tkanek mysich za pomocą systemów robotycznych rutynowo stosowanych do przetwarzania i osadzania próbek ludzkich, co znacznie zwiększa jakość próbek. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zmniejsza liczbę zmiennych metodologicznych i poprawia standaryzację kroków proceduralnych. Procedurę zademonstruje Francesca Boggio.Francesca Boggio jest patologiem pracującym w moim laboratorium. Zacznij od użycia małej pęsety, aby przenieść utrwalone próbki tkanki mysiej okrężnicy z neutralnej buforowanej formaliny na płytkę roboczą do cięcia na szalce Petriego. Użyj sterylnego skalpela, aby pociąć okrężnicę na fragmenty o długości od 0,2 do 0,3 centymetra, a następnie za pomocą pęsety umieść jeden segment w każdej z trzech nieprzylegających do siebie plastikowych końcówek zorientowanej kasety z parafiną.Ostrożnie popchnij cztery krawędzie, aby zamknąć kasetę i włóż siatkę do plastikowej ramy nośnej. Następnie oznacz ramę nośną, aby zidentyfikować próbkę i przenieś kasetę do siatki. Na godzinę przed przetwarzaniem obróć automatyczny procesor.Gdy przyrząd wskaże, że parafina się stopiła, ręcznie włóż metalowy kosz do automatycznego procesora. Po włożeniu wszystkich kaset zamknij kosz i otwórz pokrywę retorty. Włóż kosz do dedykowanej obudowy procesora i zamknij pokrywę retorty.Za pomocą ekranu dotykowego na komputerze przyrządu zdefiniuj protokół roboczy, wybierając sekwencję roztworów, czas i temperaturę, które mają być wdrożone zgodnie ze schematem podanym w tabeli. Kliknij w ikonę dedykowanego komputera, aby przypisać protokół do retorty zawierającej koszyk kasety, a następnie kliknij przycisk start. Gdy przyrząd potwierdzi koniec protokołu dedykowaną ikoną i sygnałem alarmowym, otwórz pokrywę retorty i wyjmij kosz z procesora.Na godzinę przed zatopieniem tkanki włącz automatyczną zatapiaczkę i poczekaj, aż parafina całkowicie się rozpuści, zgodnie ze wskazaniami termometru do kąpieli parafinowej na urządzeniu. Ręcznie przenieś do 32 przetworzonych kaset z kosza procesora do stojaka do zatapiania i otwórz główną pokrywę zatapiacza. Użyj ekranu dotykowego, aby zasygnalizować systemowi robota, że stojak jest wkładany i otwórz pokrywę obudowy wlotu.Włóż do czterech stojaków do obudowy wlotu i zamknij pokrywę obudowy wlotu. Następnie użyj ekranu dotykowego, aby rozpocząć procedurę osadzania, jak wskazano w tabeli. Gdy przyrząd potwierdzi koniec protokołu za pomocą dedykowanej ikony, wyjmij stojak wylotowy i zamknij główną pokrywę osadzacza.Następnie przenieś osadzone bloki z regału do pudełka do przechowywania. Skracanie jelita grubego i ekspresja genów prozapalnych w okrężnicy są szeroko stosowanymi parametrami do oceny obecności siarczanu sodu dekstranu lub stanu zapalnego wywołanego przez DSS. Naciekanie komórek zapalnych do blaszki właściwej jelita jest również znacznie wzmocnione przez leczenie DSS.Barwienie H&E nieleczonych próbek przetworzonych przez automatyzację, jak wykazano, ujawnia mniej naciekających komórek zapalnych, zmian nabłonkowych i zmian w architekturze błony śluzowej w porównaniu z próbkami od zwierząt leczonych DSS. Jakość przygotowania i zatapiania tkanek mysich wykonywanych przez zautomatyzowane instrumenty może być dodatkowo potwierdzona przez barwienie immunohistochemiczne dla CD20 i barwienie trichromowe Mallory'ego. Warto zauważyć, że zautomatyzowane przetwarzanie próbek konsekwentnie pozwala na ocenę większej części parametrów histologicznych niż w przypadku próbek przetwarzanych metodą ręczną.Należy pamiętać, aby prawidłowo włożyć tkankę do siatki, aby poczekać, aż automatyczny procesor będzie gotowy i poczekać, aż parafina całkowicie się rozpuści. Metoda ta może być stosowana do przeprowadzania analizy histologicznej dowolnej tkanki mysjej, z jakością ludzkich próbek histologicznych, które zostaną wykorzystane w mysich modelach patologów człowieka. Technika ta okazała się już sukcesem w badaniu zapalenia tkanek zapalnych i będzie przydatna do badania modeli mysiego raka jelita grubego.Ponieważ niektóre odczynniki używane w tym protokole są niebezpieczne, należy pamiętać, aby podczas wykonywania tej procedury zawsze nosić rękawice ochronne, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny.

using-robotic-systems-to-process-embed-colonic-murine-samples-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje protokół generowania mysiego modelu ortotopowego ksenoprzeszczepu jelita grubego pochodzącego od pacjenta do badania progresji komórek raka jelita grubego u myszy bez otyłości z cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID). Ten mysi model pomaga w zrozumieniu wzorca wzrostu guza pierwotnego i przerzutów.

Generowanie mysiego modelu raka jelita grubego PDOX: badanie progresji raka jelita grubego w modelu mysim

Ten film demonstruje protokół wykonywania biopsji szczypty pod kontrolą kolonoskopu u myszy. Ta technika pomaga wizualnie analizować światło okrężnicy i pobierać próbki tkanek do szczegółowych badań.

Kolonoskopowa biopsja szczypty pod kontrolą w modelu mysim: technika wizualizacji i ekstrakcji próbek tkanek z okrężnicy myszy

W ciągu ostatnich kilku lat, endoskopy nowej generacji stały się ważnymi diagnostycznymi pomocami badawczymi do oceny mysiego zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół endoskopowej oceny stanu zapalnego i guzów jelita grubego u myszy, a także nowatorski system punktacji, który wykorzystuje identyfikatory dziesiętne do dokumentowania endoskopowego nasilenia zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego.

Elastyczna kolonoskopia u myszy w celu oceny ciężkości zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego przy użyciu zwalidowanego systemu punktacji endoskopowej

Opisano użycie prostego urządzenia do cięcia i 'zwijania' mysich jelit w celu szybkiego przygotowania całych przygotowań do montażu.

Proste urządzenie do szybkiego przygotowania całych wierzchowców jelita myszy

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Komórki macierzyste nabłonka jelitowego (ISC) są zmieszane z komórkami Panetha. Komórki te są zróżnicowanym potomstwem ISC, które wspiera ISC i zapewnia ochronę przeciwbakteryjną. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy transgeniczne warunkowe modele myszy, aby ustalić, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu nabłonka jelitowego.

Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox

Tutaj podajemy szczegółowy opis procedury wywoływania biopsji szczypanych pod kontrolą kolonoskopii u myszy i śledzenia zamykania ran w czasie rzeczywistym. Dodatkowo przedstawiono metody przygotowania tkanek do analiz histologicznych, immunohistochemicznych i molekularnych łożyska rany.

Wykonywanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Aby zbadać, jak jelito cienkie radzi sobie z cząstkami o różnych rozmiarach, zmodyfikowaliśmy ustaloną metodę in vivo, aby określić pasaż jelita cienkiego.

Badanie mechanowykrywania cząstek świetlnych w jesionym jelicie cienkim

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Opisujemy mysi model pooperacyjnej niedrożności jelit generowany przez manipulację jelitową. Funkcję pasażu pokarmowego, zmiany patologiczne i aktywację komórek odpornościowych oceniano 24 godziny po zabiegu.

Pooperacyjny model mysiej niedrożności jelit

Poznaj zautomatyzowany protokół przetwarzania tkanek myszy okrężnicy przy użyciu systemów robotycznych. Ta metoda poprawia jakość próbek i standaryzację procedur histopatologicznych.

Wykorzystanie systemów robotycznych do przetwarzania i osadzania próbek myszy okrężnicy do analiz histologicznych

Przeglądaj więcej filmów