Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Jest to pierwsza praca, która odnosi się do problemów technicznych w sekwencjonowaniu małych RNA pochodzących z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych komórek. Próbki NGS wymagają rygorystycznego przygotowania i kontroli jakości. Ze względu na charakter pojazdów elektrycznych, proces kontroli jakości próbek pojazdów elektrycznych odbiega od normy.

Zaletą tego protokołu są kroki kontroli jakości dla początkujących użytkowników. Procedurę zademonstruje Junyi Su, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Na początek umieść ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste w ilości 2 000 komórek na centymetr kwadratowy w świeżych pożywkach MSC w pięciu kolbach T175.

Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla i wymieniaj pożywkę co dwa do trzech dni, aż uzyskasz pięć kolb z 90% zlewającymi się komórkami. Następnie umyj komórki trzykrotnie 20 mililitrami PBS na kolbę. Dodaj 20 mililitrów pożywki do zbierania EV do każdej kolby.

I inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Zebrać pożywkę i odwirować ją przez 10 minut w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza. Następnie zebrać supernatant i odwirować pożywkę przez 20 minut w temperaturze 2 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

Ponownie zebrać supernatant i odwirować pożywkę przez 30 minut w temperaturze 15, 500 g i czterech stopniach Celsjusza. Zbierz supernatant po raz ostatni. Następnie przenieś pożywkę do probówek ultrawirówek.

Zastosowano tutaj wirnik o stałym kącie 60Ti, a pellet zostanie zakotwiczony z boku rury. Zaznacz stronę pokrywki, w której spodziewana jest granulka, i narysuj okrąg po stronie tuby, w której spodziewana jest granulka. I osadzaj exRNA przez 90 minut w temperaturze 100 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

Po ostatnim odwirowaniu usunąć supernatant. Użyj małych kawałków chłonnego papieru, aby wysuszyć wnętrze tubki bez dotykania dna tuby. A następnie odwróć rurkę na chłonnym papierze.

Aby ponownie zawiesić osad, dodaj 200 mikrolitrów PBS do każdej probówki i wiruj probówkę przez 30 sekund. Pipetować w górę i w dół 20 razy. Następnie oceń pęcherzyki zewnątrzkomórkowe i inne biomolekuły za pomocą analizy śledzenia nanocząstek.

I przechowuj granulat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszych eksperymentów. Po rozmrożeniu próbek użyj zestawu do izolacji RNA, aby wyekstrahować RNA zgodnie z protokołem producenta. Eluować RNA z kolumny znajdującej się w zestawie do izolacji RNA w 100 mikrolitrach wody wolnej od RNAzy.

Aby zagęścić RNA poprzez wytrącanie etanolu, dodaj jeden mikrolitr glikogenu, 10 mikrolitrów dwumolowego octanu sodu o pH 5,5 i 250 mikrolitrów wstępnie schłodzonego 99% etanolu do 100 mikrolitrów oczyszczonego RNA. Następnie inkubuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc, aby wytrącić RNA. Aby osadzać RNA, wirować przez 20 minut w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

Następnie usuń supernatant i przemyj osad RNA jednym mililitrem 75% etanolu. Wirować ponownie przez pięć minut w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać granulowany RNA. Usuń etanol i pozostaw pokrywkę probówki RNA otwartą na pięć do 10 minut, aby wysuszyć osad RNA na powietrzu.

Ponownie zawiesić osad RNA w siedmiu mikrolitrach wody wolnej od RNAzy i użyć maszyny do elektroforezy kapilarnej na bazie chipów, aby wykryć jakość i stężenie RNA. Aby rozpocząć budowę biblioteki, należy pipetować pięć mikrolitrów RNA do wstępnie schłodzonej 0,2-mililitrowej probówki do PCR. Następnie rozcieńczyć adaptery 3' w wodzie wolnej od RNAzów w stosunku objętościowym 1 do 10.

Dodaj 0,5 mikrolitra rozcieńczonego łącznika do probówki RNA i odpipetuj mieszaninę osiem razy w górę iw dół. Odwirować na krótko, aby zebrać cały płyn na dnie probówki. Inkubować mieszaninę adaptera RNA w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie minuty w podgrzanym termocyklerze.

A następnie umieść próbkę z powrotem na schłodzonym bloku. Następnie dodaj jeden mikrolitr buforu ligacyjnego, 0,5 mikrolitra inhibitora RNAzy i 0,5 mikrolitra ligazy RNA T4 do mieszaniny adaptera RNA. Pipetować w górę i w dół osiem razy i krótko odwirować.

Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez godzinę w nagrzanym termocyklerze. Następnie dodaj 0,5 mikrolitra roztworu zatrzymującego do probówki z próbką, tak aby probówka pozostała w termocyklerze. Pipetować w górę i w dół osiem razy i kontynuować inkubację w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Rozcieńczyć adaptery 5' w wodzie wolnej od RNAzy w stosunku objętościowym 1 do 10. Dodaj 0,5 mikrolitra rozcieńczonego adaptera do oddzielnej 0,2-mililitrowej probówki do PCR. Podgrzej adapter 5' w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

A następnie umieść próbkę na schłodzonym bloku. Dodaj 0,5 mikrolitra 10-nanomolowego ATP i 0,5 mikrolitra ligazy RNA T4 do rurki adaptera 5'. Pipetować w górę i w dół osiem razy.

I krótko odwirować, aby zebrać wszystkie płyny na dno. Następnie dodaj 1,5 mikrolitra mieszaniny adaptera 5' do próbki RNA. Odpipetować osiem razy bardzo delikatnie i inkubować próbkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez godzinę.

Aby uzyskać cDNA, rozcieńczyć starter odwrotnej transkryptazy w wodzie wolnej od RNAzy w stosunku objętościowym 1 do 10. Dodać 0,5 mikrolitra rozcieńczonego startera do próbki RNA, bardzo delikatnie pipetować osiem razy i krótko odwirować. Następnie inkubuj mieszaninę RNA i startera w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie minuty w podgrzanym termocyklerze.

A następnie umieść próbkę na schłodzonym bloku. Następnie dodaj jeden mikrolitr 5X First Nici Buffer, 0,5 mikrolitra 12,5-milimolowej mieszaniny DNTP, 0,5 mikrolitra 100-milimolowej DTT, 0,5 mikrolitra inhibitora RNAzy i 0,5 mikrolitra odwrotnej transkryptazy do probówki z próbką. Odpipetować osiem razy bardzo delikatnie.

I krótko odwirować. Inkubować próbkę w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę w nagrzanym termocyklerze. Następnie dodaj 4,25 mikrolitra ultraczystej wody, 12,5 mikrolitra mieszanki PCR, jeden mikrolitr startera indeksowego i jeden mikrolitr uniwersalnego startera do próbki cDNA.

Pipetować w górę i w dół osiem razy i krótko odwirować. Na koniec umieść próbkę w termocyklerze i ustaw cykler zgodnie z rękopisem. Aby oczyścić bibliotekę RNA, użyj automatycznego frakcjonatora wielkości DNA, aby wymyć prążki między 140 a 160 parami zasad.

Uruchom wyodrębnioną bibliotekę na kolumnowym zestawie do oczyszczania PCR i eluuj bibliotekę w 10 mikrolitrach wody wolnej od RNAzy. Aby sprawdzić rozmiar biblioteki, załaduj jeden mikrolitr oczyszczonej biblioteki na chip DNA i postępuj zgodnie z protokołem producenta. Aby określić ilościowo stężenie w bibliotece, najpierw rozcieńczyć jeden mikrolitr oczyszczonej biblioteki w 10-milimolowym pH 8,0 Tris-Hcl z 0,05% polisorbatem 20 w stosunku jeden do 1 000 objętości.

Następnie uruchom QPCR przy użyciu standardów DNA z zestawu do kwantyfikacji w bibliotece komercyjnej. Na koniec połącz równe ilości bibliotek zgodnie z wymaganiami maszyny sekwencjonującej i sekwencjonuj w systemie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Elektroferogram zewnątrzkomórkowych RNA obejmował szeroki zakres RNA.

Natomiast komórkowe RNA wykazywało bardzo wyraźne szczyty, odpowiadające 5StRNA, 5,8SrRNA, 18SrRNA i 28SrRNA. Uzyskana w ten sposób jakość obu bibliotek była wysoka i porównywalna. Rozkład długości obu bibliotek wykazał pojedynczy pik przy 22 nukleotydach, z korelacjami z mikroRNA.

W przeciwieństwie do tego, biblioteki z zewnątrzkomórkowych RNA były bardziej heterogeniczne i zawierały dwa dodatkowe piki, które korelują z tRNA, połówkami i fragmentami lub piRNA. 65% odczytów z komórkowego RNA zostało zmapowanych do ludzkich mikroRNA, a każdy z pozostałych małych RNA stanowił niewielką część zmapowanych odczytów. Dla porównania, tylko 8% zewnątrzkomórkowych RNA pasowało do ludzkich mikroRNA.

Najliczniejszym małym RNA, do którego zmapowano odczyty, były tRNA, a niedopasowane odczyty zostały później dopasowane do sekwencji bakteryjnych. Porównanie z genomem bydła sugerowało, że FBS nie był źródłem zakażenia. W związku z tym zewnątrzkomórkowe RNA wykazują nietypowy profil w porównaniu z normalnym komórkowym RNA.

Przygotowanie biblioteki jest kluczową częścią tego protokołu. Mieszanie należy wykonywać bardzo delikatnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Metoda ta może być również wykorzystana do zbadania profilu exRNA z innych rodzajów komórek, co pomaga w badaniu funkcji exRNA.