Name: Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę izolacji i sekwencjonowania zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Protokół obejmuje kontrolę jakości próbek o niskiej zawartości RNA dla sekwencjonowania NGS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni Panu Clausowi Busowi i Pani Ricie Rosendahl z iNANO za ich pomoc techniczną. Specjalne podziękowania dla dr Daniela Otzena za umożliwienie nam częstego korzystania z jego ultrawirówki. Badanie to było wspierane przez Duński Fundusz Innowacyjny (projekt MUSTER).

UWAGA: Pożywka do hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych (pożywka MSC) jest przygotowywana wcześniej, jak wskazano w Tabeli Materiałów.
1. Hodowla komórkowa
UWAGA: Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste można uzyskać ze szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej lub z innych źródeł11. Alternatywnie, hMSC można kupić za pośrednictwem dostawcy. BMSC użyte w tym protokole pochodziły ze szpiku kostnego pacjentów i zostały zakupione od firmy.
<ol>
	<li>Rozmrozić 1 x 106 BMSC w kolbie T175 zawierającej 20 ml pożywki MSC. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wymieniać pożywkę co 2-3 dni aż do uzyskania 80% zgrywu.</li>
	<li>Umyj komórki 5 ml 1x PBS i wyrzuć PBS.</li>
	<li>Odłączyć komórki, dodając 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubując komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Postukać w boki kolby, aby ułatwić oderwanie.</li>
	<li>Dodaj 15 ml pożywki MSC, aby dezaktywować trypsynę, odłącz komórki od powierzchni i pipetuj w górę iw dół, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
	<li>Zbierz komórki do probówki o pojemności 50 ml i wiruj przez 5 minut przy 300 x g, aby osadzać komórki.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki MSC i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: Pierwotne MSCs ludzkiego szpiku kostnego przy 80% zbiegu w kolbie T175 to około 2 x 106 komórek.</li>
	<li>Płytkę hMSC w ilości 2 000 komórek/cm2 w świeżych pożywkach MSC w 5 kolbach T175. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wymieniać pożywkę co 2-3 dni, aż do uzyskania 5 kolb z 90% zlewającymi się kolbami T175.</li>
</ol>
2. Kolekcja EV i biomolekuł związanych z RNA
UWAGA: Pożywka do pobierania EV jest przygotowywana wcześniej (Dulbecco's Modified Eagle's Medium [DMEM] z 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] i 1% penicyliny/streptomycyny [P/S]). Pożywki do zbierania EV to normalne pożywki MSC, ale przygotowane z komercyjnym FBS (Tabela Materiałów) zubożona w EV. Ma to na celu uniknięcie zanieczyszczenia bydlęcego exRNA przez FBS, który zwykle zawiera exRNA związane z EV, rybonukleoproteinami i lipoproteinami. Do przygotowania małej biblioteki RNA wymagane są exRNA pochodzące z 5 konfluentnych kolb MSC, aby umożliwić budowę biblioteki.
<ol>
	<li>Przemyć komórki 3x 20 ml PBS na kolbę T175. Dodać 20 ml pożywki do zbierania EV na zlewającą się kolbę T175 MSC i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
	<li>Zebrać pożywkę i odwirować ją przez 10 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant i odwirowywać pożywkę przez 20 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant i odwirowywać pożywkę przez 30 minut w temperaturze 15 500 x g i temperaturze 4 °C. Następnie zbierz supernatant.</li>
	<li>Przenieść pożywkę do probówek ultrawirówek i granulować exRNA przez 90 minut w temperaturze 100 000 x g i temperaturze 4 °C. Stosowany jest tutaj wirnik o stałym kącie nachylenia, a pelet jest zakotwiczony z boku rury. Zaznacz bok pokrywki i narysuj okrąg po stronie tuby, w którym spodziewany jest granulek.</li>
	<li>Usuń sklarowany osad, osusz wnętrze probówki, odwracając probówkę na bibułze chłonnym i użyj małych kawałków papieru chłonnego, aby usunąć płyn z wnętrza probówki bez dotykania dna probówki. Zawiesić osad w 200 μl PBS, wirując przez 30 s i pipetując w górę iw dół 20 razy.</li>
	<li>Oceń EV i biomolekuły za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: EV i biomolekuły można oceniać za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), dynamicznego rozpraszania światła (DLS) lub transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)12.</li>
	<li>Przechowuj EV i biomolekuły w temperaturze -80 °C do czasu dalszych eksperymentów. 
	UWAGA: Jeśli EV mają być używane do badań funkcjonalnych, należy dodać 20% glicerolu, aby chronić je przed pęknięciem. W razie potrzeby komórki można pobrać przy użyciu standardowych procedur.</li>
</ol>
3. EV i biomolekuły związane z RNA zbiór zróżnicowanych komórek
UWAGA: EV i biomolekuły związane z RNA mogą być również pobierane z pożywki do hodowli komórkowych, podczas gdy komórki przechodzą różnicowanie. Przykład przedstawiony w protokole opisuje różnicowanie osteoblastyczne i zbieranie exRNA w 0 i 7 dniu różnicowania. Jeżeli rozróżnienie nie jest wymagane, należy pominąć sekcję 3 i przejść do sekcji 4.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do różnicowania osteoblastycznego (DMEM z 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glicerofosforanu, 10 nM deksametazonu, 50 μM askorbiniano-2-fosforanu i 10 mM 1,25-witaminy-D3) świeżą za każdym razem.</li>
	<li>Gdy MSCs osiągną 80% zlewu, zmień pożywkę MSC na osteoblastyczne pożywki różnicujące.</li>
	<li>Uzupełnij pożywkę różnicowania osteoblastycznego po 2-3 dniach.</li>
	<li>W 5 dniu różnicowania usunąć pożywkę i przemyć komórki 3x 20 ml PBS na kolbę T175.</li>
	<li>Dodać 20 ml pożywki do zbierania EV zawierającej 10 mM β-glicerofosforanu, 10 nM deksametazonu, 50 μM askorbiniano-2-fosforanu i 10 mM 1,25-witaminy D3 do zlewającej się kolby T175 MSC. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin, aby zapewnić ciągłe różnicowanie podczas zbierania EV i biomolekuł.</li>
	<li>Zbierz pożywkę w dniu 7 i przystąp do izolowania EV i biomolekuł, jak opisano w krokach 2.2-2.6.</li>
	<li>Do kontroli jakości, komórki nasienne w 96 lub 6 dołkach w celu oceny różnicowania za pomocą odpowiednio testu aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) lub ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). 
	UWAGA: Rycina 3 jest przykładem pokazującym osteogenne różnicowanie komórek.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA i kontrola jakości
<ol>
	<li>Próbki z kroku 2.8 rozmrozić na lodzie. Ekstrahuj RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA (tabela materiałów).</li>
	<li>Odeluj RNA z kolumny znajdującej się w zestawie do izolacji RNA (tabela materiałów) w 100 μl wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Zagęścić RNA przez wytrącanie etanolu, dodając 1 μl glikogenu, 10 μl 2 M pH 5,5 octanu sodu i 250 μl wstępnie schłodzonego 99% etanolu do 100 μl oczyszczonego RNA.</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze -20 °C przez noc w celu wytrącenia RNA. Osadzać RNA przez wirowanie przez 20 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Granulka jest biała w wyniku współstrącania z glikogenem.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć osad RNA 1 ml 75% etanolu. Ponownie osadzać RNA przez 5 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń etanol i pozostaw pokrywę probówki RNA otwartą na 5-10 minut, aby wysuszyć osad RNA na powietrzu. Zawiesić osad RNA w 7 μl wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Sprawdź jakość i stężenie RNA za pomocą maszyny do elektroforezy kapilarnej opartej na chipie, aby wykryć RNA zgodnie z protokołem producenta przed budową biblioteki. 
	UWAGA: Reprezentatywny rozkład wielkości RNA jest pokazany w Rysunek 4.</li>
	<li>W razie potrzeby wyekstrahuj komórkowe RNA za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania (tabela materiałów).</li>
</ol>
5. Budowa biblioteki i kontrola jakości
UWAGA: Małe biblioteki RNA są konstruowane przy użyciu komercyjnych zestawów (Tabela Materiałów) z dostosowaniami ze względu na niski poziom wejścia RNA. Budowa biblioteki odbywa się na bloku chłodzonym.
<ol>
	<li>Schłodzić blok grzewczy dla 0,2 ml probówek PCR na lodzie i odpipetować 5 μl RNA z kroku 4.6 do 0,2 ml probówek PCR wolnych od RNaz na schłodzonym bloku.</li>
	<li>Rozcieńczyć adaptery 3' (1:10) w wodzie wolnej od RNaz w 0,2 ml probówce do PCR bez RNaz. Dodać 0,5 μl rozcieńczonego łącznika i wymieszać z 5 μl RNA, pipetując w górę i w dół 8x, a następnie krótko odwirować, aby zebrać cały płyn na dnie probówki.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę RNA i adaptera 3' w temperaturze 70 °C przez 2 minuty w nagrzanym termocyklerze, a następnie umieścić próbkę z powrotem na schłodzonym bloku.</li>
	<li>Dodać 1 μl buforu ligacyjnego, 0,5 μl inhibitora RNazy i 0,5 μl ligazy T4 RNA (mutant delecji) do mieszaniny RNA i adaptora 3'. Wymieszać pipetując 8x w górę i w dół i krótko odwirować.</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę w nagrzanym termocyklerze.</li>
	<li>Dodać 0,5 μl roztworu zatrzymującego do probówki z probówką z probówką pozostającą w termocyklerze, mieszać pipetując w górę i w dół 8x i kontynuować inkubację w temperaturze 28 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć adaptery 5' (1:10) w wodzie wolnej od RNaz w 0,2 ml probówce do PCR bez RNaz. Dodać 0,5 μl adaptera 5' do oddzielnej probówki PCR o pojemności 0,2 ml bez RNaz, podgrzewać adapter 5' w temperaturze 70 °C przez 2 minuty w podgrzanym termocyklerze, a następnie umieścić próbkę na schłodzonym bloku.</li>
	<li>Dodaj 0,5 μl 10 nM ATP, 0,5 μl ligazy T4 RNA do rurki adaptera 5', wymieszaj pipetując w górę iw dół 8x i krótko odwiruj, aby zebrać wszystkie płyny na dnie. 
	UWAGA: Trzymaj adapter 5' na chłodzonym bloku tak długo, jak to możliwe.</li>
	<li>Dodać 1,5 μl mieszaniny adaptera 5' do próbki z kroku 5.6 i bardzo delikatnie wymieszać, pipetując 8x powoli. Inkubować próbkę w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę w nagrzanym termocyklerze.</li>
	<li>Rozcieńczyć starter RT w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od RNaz w probówce PCR o pojemności 0,2 ml bez RNaz. Dodać 0,5 μl rozcieńczonego startera RT do próbki z kroku 5.9, bardzo delikatnie wymieszać, pipetując powoli w górę i w dół 8 razy i krótko odwirować.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 70 °C przez 2 minuty w nagrzanym termocyklerze, a następnie umieścić próbkę na schłodzonym bloku.</li>
	<li>Dodaj 1 μl 5x buforu pierwszej nici, 0,5 μl 12,5 mM mieszanki dNTP, 0,5 μl 100 mM ditiotreitolu (DTT), 0,5 μl inhibitora RNazy i 0,5 μl odwrotnej transkryptazy. Mieszaj bardzo delikatnie, pipetując 8 razy w górę i w dół powoli i krótko odwiruj.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę w nagrzanym termocyklerze w celu uzyskania cDNA.</li>
	<li>Do cDNA dodać 4,25 μl ultraczystej wody, 12,5 μl mieszanki PCR, 1 μl startera indeksowego i 1 μl startera uniwersalnego. Wymieszać pipetując 8x w górę i w dół i krótko odwirować.</li>
	<li>Umieścić próbkę w termocyklerze i ustawić cykler w następujący sposób: 98 °C przez 30 s; 15 cykli po 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 15 s; i zakończyć cykl w temperaturze 72 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Przygotowaną bibliotekę można przechowywać w temperaturze -20 °C przez tydzień.</li>
	<li>Oczyść bibliotekę RNA, oddzielając bibliotekę na żelu DNA i przecinając żel (ekstrakcja żelu) między 140 pz a 160 pz i eluując bibliotekę z żelu zgodnie z protokołem podanym przez zestaw do budowy biblioteki. 
	UWAGA: W tym badaniu biblioteka przygotowana z kroku 5.15 jest ładowana do komercyjnego żelu (Tabela materiałów), a biblioteka o stężeniu od 140 pz do 160 pz jest oczyszczana przez automatyczny frakcjonator wielkości DNA (Tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Skoncentruj i umyj bibliotekę od kroku 5.16 za pomocą kolumnowego zestawu do oczyszczania PCR (tabela materiałów), a na koniec wymyj bibliotekę w 10 μl wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Załaduj 1 μl oczyszczonej biblioteki na chip DNA (Tabela materiałów), aby sprawdzić rozmiar biblioteki zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Rozcieńczyć 1 μl oczyszczonej biblioteki (1:1000) w 10 mM pH 8,0 Tris-HCl z 0,05% polisorbatem 20 i określić ilościowo bibliotekę za pomocą qPCR przy użyciu komercyjnego zestawu do kwantyfikacji biblioteki w celu ilościowego określenia stężenia biblioteki przy użyciu wzorców DNA zawartych w zestawie.</li>
	<li>Pula równych ilości bibliotek zgodnie z wymaganiami maszyny sekwencjonującej i sekwencjonowania w systemie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. 
	UWAGA: Budowa biblioteki komórkowego RNA może być wykonana przy użyciu tych samych zestawów, postępując zgodnie ze standardowym protokołem zestawów.</li>
</ol>
6. Rurociąg bioinformatyczny
UWAGA: To jest wewnętrzny potok, a używane tutaj programy są wymienione w Tabeli Materiałów. 
<ol>
	<li>Przycinanie odczytów o niskiej jakości i usuwanie sekwencji adapterów z odczytów nieprzetworzonych.</li>
	<li>Mapuj czyste odczyty na różne rodzaje RNA.
	<ol>
		<li>Adnotuj tRNA, dopuszczając dwie niezgodności, ponieważ silnie zmodyfikowane sekwencje tRNA powodują częste błędne włączenie zasad przez odwrotną transkryptazę.</li>
		<li>Adnotuj miRNA, mapując na ludzkie miRNA z miRBazy v21, co pozwala na zerowe niezgodności. Ponieważ miRNA podlegają nieszablonowym dodatkom końca 3' A i U, sekwencje, które nie mapują, są przycinane do 3' do trzech A i / lub T ntów, po czym odczyty są mapowane na ludzkie miRNA i inne miRNA z miRBazy v21, co pozwala na zerowe niedopasowania.</li>
		<li>Przypisz do innych odpowiednich małych RNA (snRNA, snoRNA, piRNA i Y RNA), dopuszczając jedno niedopasowanie.</li>
		<li>Zmapuj pozostałe niezmapowane odczyty na długie zestawy danych RNA (rRNA, inne RNA z Rfam i mRNA), aby ocenić degradację.</li>
		<li>Opisz sekwencje do ludzkiego genomu.</li>
		<li>Opisz sekwencje do genomów bakteryjnych.</li>
		<li>Normalizuj ekspresję miRNA za pomocą następującego wzoru: liczba miRNA / całkowita liczba wszystkich zmapowanych miRNA) x 106.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity%2C+function+and+applications+of+RNA+in+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).</li>
<li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs%3A+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184(2013).</li>
<li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+circulating+non-coding+RNAs+-+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances%2C+challenges%2C+and+opportunities+in+extracellular+RNA+biology%3A+insights+from+the+NIH+exRNA+Strategic+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop.</a> JCI Insight. 3 (7), (2018).</li>
<li>Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+cell-cell+communication+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119(2013).</li>
<li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292(2014).</li>
<li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li>
<li>Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018).</li>
<li>NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018).</li>
<li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Potential+of+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Their+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).</li>
<li>Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+-+current+trends+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective.</a> Bioscience Reports. 35 (2), (2015).</li>
<li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Methods+of+Choice+for+Extracellular+Vesicles+%28EVs%29+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li>
<li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomal-miRNAs+are+critical+factors+for+inducing+anti-proliferation+signalling+to+A2780+and+SKOV-3+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 38498(2016).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Asghar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomonas+sp+is+a+Novel+Cell+Culture+Contaminant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół sekwencjonowania exRNA nowej generacji, który umożliwia różnicową analizę ekspresji z próbek o niskiej wartości wejściowej. Przestrzeganie określonego protokołu izolacji EV i exRNA jest ważne, ponieważ nawet niewielkie zmiany (tj. etap ultrawirowania lub zmiana typu wirnika) mogą wpływać na transkryptom i poziomy miRNA13,14. Tak więc, niezależnie od tego, w jaki sposób exRNA jest izolowane, ważne jest, aby zastosować tę samą proce...

Zewnątrzkomórkowe i krążące RNA (exRNA) są obecne w różnych płynach ustrojowych i są odporne na RNazy1,2. Ich duża liczebność, stabilność i łatwość dostępności są atrakcyjne dla oceny klinicznej jako markery diagnostyczne i prognostyczne 3. Sposób transportu exRNA obejmuje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), asocjację z lipoproteinami (takimi jak lipoproteiny o dużej gęstości; HDL) i kompleksy rybonukleoproteinowe (np. z kompleksami Argonaute2)4.
Podzbiór exRNA to mikroRNA (miRNA), które są małymi niekodującymi RNA o wielkości około 22 nt, które regulują potranskrypcyjną ekspresję genów. Ex-miRNA są zaangażowane w komunikację komórka-komórka i regulację homeostazy komórki5. Na przykład HDL dostarcza ex-miR-223 do komórek śródbłonka w celu stłumienia międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej 1 (ICAM-1) i stanu zapalnego6. Co ciekawe, miR-223 jest również transportowany przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z leukocytów do komórek raka płuc, programując je tak, aby przybrały bardziej inwazyjny fenotyp7. Tak więc transkryptom ex-miRNA z różnych płynów ustrojowych i pożywki do hodowli komórkowych znacznie poprawi nasze zrozumienie sygnalizacji ex-miRNA.
Sekwencjonowanie małych RNA (sekwencjonowanie małych RNA) to potężne narzędzie, które może być użyte do zrozumienia transkryptomiki małych RNA. Nie tylko można porównywać różne próbki między znanymi RNA o różnej ekspresji, ale można również wykrywać i charakteryzować nowe małe RNA. W związku z tym jest to również solidna metoda identyfikacji miRNA o zróżnicowanej ekspresji w różnych warunkach. Jednak jedną z przeszkód związanych z sekwencją małych RNA jest trudność w generowaniu małych bibliotek sekwencyjnych RNA z płynów wejściowych o niskim poziomie exRNA, takich jak płyny mózgowo-rdzeniowe, ślina, mocz, mleko, surowica i pożywki hodowlane. Protokół TruSeq Small RNA Library Prep firmy Illumina wymaga około 1 μg wysokiej jakości całkowitego RNA, a protokół NEBNext Small RNA Library Prep Set firmy New England Biolabs wymaga 100 ng-1 μg RNA8,9. Często całkowite RNA z tych próbek są poniżej granicy wykrywalności dla konwencjonalnych spektrofotometrów UV-vis.
Ex-miRNA pochodzące z płynów ustrojowych są potencjalnie dobrymi markerami prognostycznymi i diagnostycznymi. Jednak w celu zbadania efektów funkcjonalnych lub określenia pochodzenia określonych ex-miRNA, często zamiast tego stosuje się systemy hodowli komórkowych. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) były intensywnie badane, ponieważ ich EV są zaangażowane w łagodzenie wielu chorób, w tym zawału mięśnia sercowego, choroby Alzheimera i choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi10. Tutaj pokazujemy oczyszczanie ex-miRNA z MSC pochodzących ze szpiku kostnego (BMSC) oraz konkretne kroki stosowane w celu optymalizacji budowy małej biblioteki RNA, sekwencjonowania i analizy danych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-012</td><td>Komórki użyte w tym protokole zostały zakupione od ATCC</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Określany jako mezenchymalne podłoże wzrostu komórek macierzystych (pożywka MSC)</td></tr> <tr><td>Zubożone w egzosomy FBS</td><td>Gibco</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka zbierająca ExRNA: MSCGM, ale z FBS zastąpionym przez FBS zubożony w egzosomy FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>T175 Kolba</td><td>Sarstedt</td><td>833,912</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelka z poliwęglanu z zespołem nakrętki</td><td>Beckman Redlica</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td><td></td><td></td><td>Zastosowany tutaj</td></tr><tr><td>rotor NucleoCounter</td><td>Chemometec</td><td>NC-3000</td><td>Licznik komórek</td></tr> <tr>i <td>beta;-glicerofosforan</td><td>Calbiochem</td><td>35675</td><td>Składniki pożywki różnicującej osteogennej</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td>Składniki pożywki różnicowania osteogennego</td></tr><tr><td>2-fosfo-L-askorbinowy&nbsp; kwasowa sól trisodowa</td><td>Sigma</td><td>49752-10G</td><td>Składniki osteogennej pożywki różnicującej</td></tr><tr><td>1&alfa;,25-Dihydroksywitamina&nbsp; D3</td><td>Sigma</td><td>D1530-1MG</td><td>Składniki pożywki do różnicowania osteogennego</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>zestaw do oczyszczania miRNA i całkowitego RNA dla kroku 4.8</td></tr><tr><td>Zestaw Agilent RNA 6000 Pico</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1514</td><td>Maszyna do elektroforezy kapilarnej na bazie chipów i chipy do analizy RNA i DNA</td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>Maszyna do elektroforezy kapilarnej na bazie chipów i chipy do analizy RNA i DNA</td></tr><tr><td>Zestaw DNA Agilent o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Maszyna do elektroforezy kapilarnej na bazie chipów i chipy do analizy RNA i DNA</td></tr><tr><td>Zestawy kwantyfikacyjne biblioteki KAPA</td><td>Roche</td><td>KK4824</td><td>Zestaw do kwantyfikacji biblioteki</td></tr><tr><td>TruSeq Small RNA Zestaw do przygotowania biblioteki -Zestaw A (24 rxns) (Zestaw A: indeksy 1-12)</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td>Mały zestaw preparacyjny biblioteki RNA używany w tym protokole - używany w kroku 5</td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td>Automatyczny ekstraktor żelu DNA używany w tym protokole; można również przeprowadzić ekstrakcję ręczną</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR MinElute Oczyszczanie</td> PCR <td>Qiagen</td><td>28004</td><td>w kroku 5.17</td></tr><tr><td>FASTX_Toolkit</td><td>Laboratorium</td><td></td> Cold Spring Harbor <td>Przycinanie odczytów niskiej jakości w kroku 6</td></tr><tr><td>cutadapt</td><td></td><td></td><td>Demontaż adaptera w kroku 6</td></tr><tr><td>Mapowanie muszki</td><td></td><td></td><td>czystych odczytów w kroku 6</td></tr><tr><td>Samtools</td><td></td><td></td><td>Aby utworzyć profil wyrażenia w kroku 6</td></tr><tr><td>Bedtools</td><td></td><td></td><td>Aby utworzyć profil wyrażenia w kroku 6</td></tr></tbody></table>

izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikrorna z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Zewnątrzkomórkowe i krążące RNA (exRNA) są wytwarzane przez wiele typów komórek ciała i występują w wielu płynach ustrojowych, takich jak ślina, osocze, surowica, mleko i mocz. Jednym z podzbiorów tych RNA są regulatory posttranskrypcyjne – mikroRNA (miRNA). Aby wyznaczyć miRNA wytwarzane przez określone typy komórek, można zastosować systemy hodowli in vitro do zbierania i profilowania exRNA pochodzących z jednego podzbioru komórek. Czynniki wydzielane przez mezenchymalne komórki macierzyste biorą udział w łagodzeniu wielu chorób i są tutaj wykorzystywane jako system modelowy in vitro. W artykule opisano proces pobierania, oczyszczania małych RNA i generowania biblioteki w celu sekwencjonowania zewnątrzkomórkowych miRNA. ExRNA z pożywek hodowlanych różnią się od komórkowego RNA tym, że są próbkami wejściowymi o niskiej zawartości RNA, co wymaga zoptymalizowanych procedur. Protokół ten stanowi kompleksowy przewodnik po sekwencjonowaniu małych exRNA z pożywek hodowlanych, pokazując punkty kontrolne kontroli jakości na każdym etapie oczyszczania i sekwencjonowania exRNA.

Metoda opisana w niniejszym protokole została zoptymalizowana pod kątem izolacji exRNA z hodowli MSC do sekwencjonowania nowej generacji. Ogólny schemat procesu przedstawiono na Rysunku 1 po lewej stronie, natomiast odpowiadające mu punkty kontroli jakości znajdują się po prawej stronie.
Przedstawiono morfologię komórek w dniu zbioru dla komórek niezróżnicowanych (Rycina 3A</str...

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Jest to pierwsza praca, która odnosi się do problemów technicznych w sekwencjonowaniu małych RNA pochodzących z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych komórek. Próbki NGS wymagają rygorystycznego przygotowania i kontroli jakości. Ze względu na charakter pojazdów elektrycznych, proces kontroli jakości próbek pojazdów elektrycznych odbiega od normy.Zaletą tego protokołu są kroki kontroli jakości dla początkujących użytkowników. Procedurę zademonstruje Junyi Su, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Na początek umieść ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste w ilości 2 000 komórek na centymetr kwadratowy w świeżych pożywkach MSC w pięciu kolbach T175.Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla i wymieniaj pożywkę co dwa do trzech dni, aż uzyskasz pięć kolb z 90% zlewającymi się komórkami. Następnie umyj komórki trzykrotnie 20 mililitrami PBS na kolbę. Dodaj 20 mililitrów pożywki do zbierania EV do każdej kolby.I inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Zebrać pożywkę i odwirować ją przez 10 minut w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza. Następnie zebrać supernatant i odwirowa

isolating-sequencing-analyzing-extracellular-micrornas-from-human

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Obecność stabilnych mikroRNA (miRNA) w egzosomach wzbudziła ogromne zainteresowanie jako nowy sposób komunikacji międzykomórkowej, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako biomarkery i jako droga do interwencji terapeutycznej. Tutaj demonstrujemy oczyszczanie egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych, a następnie ilościowy PCR w celu identyfikacji transportowanych miRNA.

Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Opisane tutaj jest użycie metody amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji do analizy poziomów metylacji elementów LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka. Wykazano również ultrawirowanie, popularną procedurę oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płodowej surowicy bydlęcej.

Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka

Protokół opisuje izolację, hodowlę i profilowanie komórek śródbłonka z ludzkiej tętnicy krezkowej. Dodatkowo opracowano metodę przygotowania tętnicy człowieka do transkryptomiki przestrzennej. Proteomika, transkryptomika i testy funkcjonalne mogą być wykonywane na izolowanych komórkach. Protokół ten można zastosować do każdej tętnicy średniej lub dużej wielkości.

Izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę izolacji i sekwencjonowania zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Protokół obejmuje kontrolę jakości próbek o niskiej zawartości RNA dla sekwencjonowania NGS.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów