Name: Fluorescencyjne barwienie srebrem białek w żelach poliakryloamidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Poznaj nową metodę fluorescencyjnego barwienia srebrem białek w żelach poliakryloamidowych z wykorzystaniem sondy fluorogennej. Ta technika oferuje lepszą czułość i specyficzność niż tradycyjne metody barwienia srebrem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Patrickowi Chanowi z Ming Wai Lau Centre for Reparative Medicine, Karolinska Institutet, za jego wsparcie techniczne. S. X. jest wdzięczny za wsparcie ze strony Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (grant nr 2017-06344).

1. Przygotowanie żelu
Uwaga: Demonstracja odbywa się zgodnie ze standardowym protokołem, aby przygotować żel do barwienia krótko po SDS-PAGE12. W skrócie poniższe kroki opisują przygotowanie próbek i elektroforezę żelową.
<ol>
	<li>Wykonaj SDS-PAGE z 4% - 12% żelami białkowymi Bis-Tris (1 mm, 15-dołkowymi) przy użyciu mini zbiornika żelowego wypełnionego buforem kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES).</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki mieszaniną wody destylowanej, buforu dodecylosiarczanu litu (LDS) i środka redukującego próbkę.</li>
	<li>Załaduj pierwszą linię podwójną ilością bulionu (10 μl), a następnie normalną ilością bulionu (5 μl), a następnie serią dwukrotnych rozcieńczeń wywaru (13 rozcieńczeń, od 2x do 8192x).</li>
	<li>Uruchom żel przy stałym napięciu 200 V przez 30 minut.</li>
</ol>
2. Utrwalenie żelu
<ol>
	<li>Po elektroforezie zanurzyć żele w 100 ml roztworu 40% etanolu/10% kwasu octowego na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej 2x (każdy przez 30 min) lub na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj żele po 3 x 10 min w ultraczystej wodzie w czystym pojemniku. Etap mycia ma kluczowe znaczenie. Jeśli kwas z roztworu utrwalającego nie zostanie prawidłowo usunięty na etapie wywoływania fluorogenicznego, nadmiar TPE-4TA zostanie aktywowany przez kwas i doprowadzi do silnej fluorescencji tła w żelu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworu AgNO3 i impregnacja żelu srebrem 
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór AgNO3 (0,0001%) do impregnacji, najpierw rozpuść 0,01 g AgNO3 w 10 ml ultraczystej wody, aby przygotować 0,1% roztwór podstawowy AgNO3. Następnie dodaj 100 μl 0,1% roztworu podstawowego AgNO3 do 100 ml ultraczystej wody, aby uzyskać roztwór roboczy. 
	Uwaga: Roztwór AgNO3 należy przechowywać w ciemności przed użyciem.</li>
	<li>Zaimpregnować żel 100 ml roztworu roboczego srebra przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min w szczelnie zamkniętym szklanym pojemniku. Bardzo ważne jest, aby impregnację srebrem wykonać pod wyciągiem, chronionym przed światłem folią aluminiową.</li>
	<li>Umyj żel ultraczystą wodą (około 100 ml) w czystym pojemniku przez 2 x 60 s.</li>
</ol>
4. Fluorogenny rozwój żelu
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór podstawowy barwnika (0,1 mM), dodaj 3,0 mg barwnika TPE-4TA w 50 ml ultraczystej wody. Sonikować roztwór przez kilka minut i dodać trochę roztworu NaOH (na przykład 1 M), aby pomóc rozpuścić barwnik.</li>
	<li>Sprawdź fluorescencję roztworu pod lampą UV 365 nm, aby upewnić się, że cząsteczka barwnika jest całkowicie rozpuszczona. Tylko roztwory słabe lub nieemisyjne wskazują na pełne rozpuszczenie. 
	Uwaga: Barwnik TPE-4TA został zsyntetyzowany zgodnie z protokołem niedawno zgłoszonym przez Xie i wsp.10 Rozwiązanie TPE-4TA jest bardzo stabilne i może być trzymane w ciemności przez wiele miesięcy.</li>
	<li>Aby przygotować 100 ml fluorogenicznego roztworu rozwijającego (10 μM), dodaj 10 ml roztworu podstawowego TPE-4TA do 90 ml ultraczystej wody. Sprawdzić pH roztworu za pomocą pH-metru i dostroić je do 7-9 za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (1 μM).</li>
	<li>Przenieść żel do czystego i zamykanego pojemnika ze 100 ml fluorogenicznego roztworu rozwijającego. Upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony w roztworze. Zamknij pojemnik. Przykryj go przed światłem i potrząśnij przez noc na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, etap inkubacji można również skrócić do około ~2 godzin, podgrzewając roztwór do wywoływania AIE do 80 °C w celu barwienia, a następnie pozostawiając go w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
5. Odbarwienie i obrazowanie
<ol>
	<li>Przenieść żel do czystego pojemnika i odbarwić go w 100 ml 10% etanolu przez 30 min. 
	Uwaga: Do mycia żelu można użyć samej wody. Jednak bardziej efektywne czasowo jest użycie 10% roztworu etanolu do odbarwiania. Pomoże to skrócić proces odbarwiania z godzin do 30 minut.</li>
	<li>Płucz żel w ultraczystej wodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Zobrazuj żel w kanale 365 nm lub kanale 302 nm za pomocą maszyny do dokumentacji żelu.</li>
</ol>

<ol><li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="https://proteomesci.biomedcentral.com/articles/10.1186/1477-5956-8-23">Highlights on the capacities of &#34;Gel-based&#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li>
<li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li>
<li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics%3A+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li>
<li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye%2C+calconcarboxylic+acid%2C+as+a+silver-ion+sensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li>
<li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).</li>
<li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li>
<li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%3A+a+general+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li>
<li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+Ag%2B-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li>
<li>Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Złożono wniosek patentowy na to fluorescencyjne barwienie srebra.

Przedstawiono nowatorską metodę barwienia srebrem fluorescencyjnym białek w żelach poliakrylamidowych. Ta strategia integruje konwencjonalne plamy srebrne i plamy fluorescencyjne. Barwienie wykorzystuje selektywne wiązanie jonów srebra z białkami, tak jak w przypadku innych barwień srebrem, ale wykorzystuje bardzo czułą fluorogenną sondę srebra TPE-4TA do oświetlenia białek związanych ze srebrem. Ponieważ sonda fluorogeniczna TPE-4TA może wykrywać jony srebra o dość niskim stężeniu w zak...

Wiele metod barwienia zostało wykorzystanych do wizualizacji białek po elektroforezie żelowej, na przykład przy użyciu barwników kolorymetrycznych, takich jak Coomassie Brilliant Blue, srebrnego barwienia, fluorescencji lub radioaktywnego znakowania1,2,3,4. Barwienie srebrem jest uważane za jedną z najbardziej czułych technik wykrywania białek, wymagającą prostych i tanich odczynników. Można go podzielić na dwie główne rodziny: amoniakalny barwnik srebra i barwnik azotanu srebra5,6. W metodzie alkalicznego srebra amoniakologicznego kompleks srebro-diamina jest wytwarzany z amoniakiem i wodorotlenkiem sodu i redukowany do srebra metalicznego podczas rozwoju przy użyciu kwaśnego roztworu formaldehydu. Barwnik skutecznie akomoduje się do białek zasadowych, ale wykazuje obniżoną wydajność dla białek kwaśnych i obojętnych, a ponadto jest ograniczony do klasycznych systemów elektroforetycznych glicyny i tauryny. Dla porównania, barwienie azotanem srebra wykorzystuje wysokie biopowinowactwo jonów srebra do białek, głównie grup sulfhydrylowych i karboksylowych z łańcuchów bocznych, i ma tendencję do bardziej efektywnego barwienia kwaśnych białek7. Po związaniu jonów srebra stosuje się roztwór rozwijający (zwykle wykonany z roztworu węglanu metalu zawierającego formaldehyd i tiosiarczan sodu) w celu redukcji jonów srebra do metalicznych ziaren srebra, które tworzą kolor od brązowego do ciemnego, aby uwidocznić prążki białkowe.
Chociaż barwienie srebrem jest dobrze znane ze swojej wszechstronności i wysokiej czułości od czasu jego rozwoju w latach siedemdziesiątych8, metoda ta jest często uważana za trudną. Metody barwienia srebrzem mają ograniczone czasowo etapy i wykazują niską powtarzalność. Ponieważ kolor plamy srebra zwykle nie jest jednorodny i zależy od etapu redukcji, który jest trudny do kontrolowania, barwienie srebra nie jest metodą ilościową, a zatem nie jest zalecane do badania porównawczego żelu i kwantyfikacji białka9. Metody zoptymalizowane pod względem czułości mogą wykorzystywać aldehydy, które mogą również zapewnić bardziej jednolite barwienie10. Odbywa się to jednak kosztem dalszej analizy ze względu na sieciowanie białek przez aldehydy. Szybkie protokoły najczęściej łączą lub skracają kroki w celu skrócenia czasu, co negatywnie wpływa na odtwarzalność i jednolitość stain5. W rezultacie istnieje wiele wariantów barwienia srebrem w barwieniu żelem białkowym, z których każdy jest zoptymalizowany pod kątem określonych wymagań; Na przykład prostota, czułość lub szybkość odzysku peptydów do dalszej analizy. Atrybuty te mogą również mieć na siebie wpływ, a spełnienie wszystkich wymagań w jednym protokole może być trudne.
W tej pracy wprowadzamy nową metodę barwienia srebrem fluorescencyjnym do wykrywania białek w żelu poliakrylamidowym. W tej metodzie używamy sondy fluorogenicznej do jonów srebra, TPE-4TA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), do wizualizacji białek impregnowanych srebrem<klasa sup="xref">11. TPE-4TA został zaprojektowany zgodnie z zasadą emisji indukowanej agregacją (AIE). Jest nieemisyjny po rozpuszczeniu w roztworze wodnym, ale jest wysoce emisyjny w obecności jonów srebra. Zastępując rozwój chromogeniczny w tradycyjnych barwiech srebra etapem wywoływania fluorescencyjnego, metoda fluorescencyjnego srebra umożliwia solidne barwienie białek ogółem o zredukowanym tle.
Ponadto, fluorescencyjne zabarwienie srebra wykazało dobry dynamiczny zakres liniowy do kwantyfikacji białek, który jest porównywalny z powszechnie stosowanym barwnikiem rubinowym SYPRO i nieosiągalny z tradycyjnymi srebrnymi plamami. Żel może być obrazowany na powszechnie stosowanych systemach dokumentacji żelu za pomocą lampy ultrafioletowej (długość fali wzbudzenia: kanał 302/365 nm; emisja: ~490 - 530 nm) w wielu laboratoriach biologicznych.

<table><tbody><tr><td> Bufor do próbek LDS (4X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td> 4-12% żele białkowe Bis-Tris, 1,0 mm, 15-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Prefabrykowany żelowy</td></tr><tr><td>środek redukujący próbki (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0004</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Zasilacz 300 W (230 VAC)</td> <td>Sprzęt Thermo Fisher Scientific</td><td>PS0301</td><td></td></tr><tr><td>Niebarwiona drabinka białkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Próbka</td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31630-25G-R</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Bragg i spółka</td><td>42520J</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Kwas octowy</td><td>J.T. Baker</td><td>103201A</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Synteza Milli-Q A10</td><td>Merk-Provides</td><td></td> <td>18,2 M&Omega;. </td></tr><tr><td>System dokumentacji żelu wodnego cm (model c600)</td><td>Azure biosystems-Equipment</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencyjne barwienie srebrem białek w żelach poliakryloamidowych

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Barwienie srebrem jest techniką kolorymetryczną szeroko stosowaną do wizualizacji pasm białkowych w żelach poliakrylamidowych po elektroforezie w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Klasyczne barwienie srebrem ma pewne wady, takie jak wysokie barwienie tła, słaby odzysk białka, niska odtwarzalność, wąski liniowy zakres dynamiki do oznaczania ilościowego i ograniczona kompatybilność ze spektrometrią mas (MS). Teraz, przy użyciu fluorogenicznej sondy Ag+, TPE-4TA, opracowaliśmy metodę fluorescencyjnego barwienia srebrem do wizualizacji całkowitego białka w żelach poliakrylamidowych. Ta nowa bejca pozwala uniknąć kłopotliwego etapu redukcji srebra w tradycyjnych srebrnych plamach. Co więcej, fluorescencyjne barwienie srebra wykazuje dobrą odtwarzalność, czułość i liniową kwantyfikację w wykrywaniu białek, co czyni ją użytecznym i praktycznym barwnikiem w żelu białkowym.

Prążki białkowe wybarwione fluorescencyjnym barwnikiem srebrowym wykazują intensywną zieloną fluorescencję pod wpływem lampy UV o długości fali 365 nm. Wszystkie 14 prążków białkowych (10 - 20 kDa), od góry dołu, było wyraźnie widocznych, co dobrze korelowało z 14 czerwonymi prążkami wybarwionymi barwnikiem SYPRO Ruby (Rycina 2)10.
W odniesieniu do ilościowego wykrywania biał...

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół opisujący nową technikę barwienia fluorescencyjnego do całkowitego wykrywania białek w żelach poliakrylamidowych. Protokół wykorzystuje specyficzną dla jonów srebra sondę fluorescencyjną, która wykrywa kompleksy białkowe Ag + i eliminuje pewne ograniczenia tradycyjnych chromogennych barwników srebra.

Fluorescencyjne barwienie srebrem białek w żelach poliakryloamidowych

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Jest to nowatorska metoda barwienia żelem, która wykorzystuje fluorogeniczną sondę srebra do przekształcenia tradycyjnego barwienia srebra w fluorescencyjne barwienie srebrem. Metoda ta wykazała lepszą wydajność w porównaniu z konwencjonalnym barwieniem azotanem srebra i barwieniem rubinowym SYPRO przy użyciu prostego i nieskomplikowanego protokołu bez aldehydów. Procedurę zademonstruje Alex Wong, asystent naukowy z mojego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, rozcieńczyć próbki białek roztworem zawierającym wodę destylowaną, bufor LDS i środek redukujący próbkę. Skonfiguruj mini zbiornik żelu wypełniony buforem MES, aby wykonać SDS-PAGE z 4-12%żelem białkowym Bis-Tris. Załaduj studzienki przygotowaną próbką białka, a następnie uruchom żel przy stałym napięciu 200 woltów przez 30 minut.Po elektroforezie zanurzyć żel w 100-mililitrowym roztworze zawierającym etanol i kwas octowy na wytrząsarce orbitalnej i inkubować dwukrotnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wytrząsając z prędkością 50 obr./min. Następnie umyj żel trzykrotnie ultraczystą wodą w czystym pojemniku, przy czym każde mycie trwa 10 minut. Najpierw rozpuść 0,01 grama azotanu srebra w 10 mililitrach ultraczystej wody, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 0,1%Dodaj 100 mikrolitrów roztworu podstawowego do 100 mililitrów ultraczystej wody, aby uzyskać roztwór roboczy azotanu srebra.W dygestorium zanurzyć żel w 100 mililitrach roztworu roboczego azotanu srebra w szczelnie zamkniętej szklanej komorze. Użyj folii aluminiowej, aby chronić żel przed światłem podczas impregnacji i inkubuj przez godzinę, wstrząsając z prędkością 50 obr./min na wytrząsarce orbitalnej. Następnie umyj żel dwukrotnie ultraczystą wodą w czystym pojemniku, przy czym każde mycie przy użyciu około 100 mililitrów wody trwa 60 sekund.Ważne jest, aby używać ultraczystej wody do czyszczenia żelu po etapie impregnacji srebrem, aby zminimalizować plamy tła. Najpierw dodaj 50 mililitrów ultraczystej wody do trzech miligramów barwnika TPE-4TA. Sonikuj roztwór przez trzy minuty i dodaj pięć mikrolitrów jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu pomiędzy każdą sesją sonikacji, aby pomóc rozpuścić barwnik, zwykle do trzech razy.Następnie sprawdź fluorescencję roztworu pod lampą UV 365 nanometrów, aby upewnić się, że barwnik jest całkowicie rozpuszczony. Tylko słabe lub nieemisyjne roztwory wskazują na całkowite rozpuszczenie. Aby przygotować fluorogeniczny roztwór wywołujący, dodaj 10 mililitrów roztworu podstawowego TPE-4TA do 90 mililitrów ultraczystej wody.Użyj pH-metru, aby sprawdzić pH roztworu. Dostosuj roztwór do pH między 7 a 9, używając rozcieńczonego roztworu wodorotlenku sodu lub kwasu octowego, jeśli pH jest poza zakresem. Następnie przenieś żel do czystego i zamykanego pojemnika ze 100 mililitrami fluorogenicznego roztworu rozwijającego i upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony.Zamknij pojemnik i przykryj go, aby chronić go przed światłem. Wstrząsnąć pojemnikiem przez noc na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min i w temperaturze pokojowej. Przenieś żel do czystego pojemnika i odplam go w 100 mililitrach 10% etanolu na 30 minut.Następnie płucz żel w ultraczystej wodzie przez pięć minut. Żel może być wizualizowany na stacjonarnym transiluminatorze lub zobrazowany na maszynie do dokumentacji żelu w kanale 365 nanometrów lub kanale 302 nanometrów. W tym badaniu zastosowano nowatorską metodę barwienia srebrem fluorescencyjnym do barwienia białek w żelach poliakrylamidowych.Pasma białkowe wybarwione fluorescencyjnym srebrnym barwnikiem wykazują intensywną zieleń pod 365-nanometrową lampą UV. Wszystkie 14 prążków białkowych jest wyraźnie widocznych i dobrze koreluje z czerwonymi prążkami wybarwionymi barwnikiem SYPRO Ruby. Ta fluorescencyjna metoda barwienia srebrem wydaje się mieć wysoką rozdzielczość.W przypadku niektórych pasm białkowych czułość fluorescencyjnego barwnika srebrnego jest również nieco lepsza niż fluorescencyjnego barwienia SYPRO Ruby. W szczególności wydajność tego barwienia uległa poprawie w przypadku pasm białkowych od 10 do 40 kilodaltonów, co wskazuje, że nowa metoda jest szczególnie przydatna do wykrywania białek o niskiej masie cząsteczkowej. Jak widać, dane sugerują również, że fluorescencyjne barwienie srebra daje dobrą i jednolitą liniowość dla wszystkich 14 białek w stosunkowo szerokim zakresie kwantyfikacji białek.Podczas gdy barwienie azotanem srebra dawało wysoki poziom sygnału tła i zniekształcone piki, fluorescencyjne barwienie srebra wykryło pasma z dobrym kontrastem i równomiernym rozkładem intensywności porównywalnym z barwieniem rubinowym SYPRO we wszystkich 14 białkach. Etapy mycia są ważne, ponieważ ograniczają resztkowy roztwór utrwalający, który zakłóca impregnację srebrem lub rozwój fluoru. Podczas stosowania azotanu srebra należy unikać kontaktu ze skórą.Natychmiast wyczyść wszelkie rozlane płyny. Nosić odzież ochronną i rękawice ochronne i utylizować wraz z odpadami chemicznymi.

fluorescent-silver-staining-of-proteins-in-polyacrylamide-gels

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Po rozdzieleniu metodami elektroforetycznymi białka w żelu można wykryć za pomocą kilku metod barwienia. W niniejszym filmie zaprezentowano barwienie białek błękitem Coomassie, barwienie srebrem, SYPRO Orange oraz SYPRO Ruby.

Barwienie białek w żelach

Zaprezentowano prostą i specyficzną metodę fluorescencyjnego znakowania oraz zwiększonej detekcji białek powierzchniowych komórek bez konieczności przeprowadzenia etapu frakcjonowania. Różnice w zawartości białek powierzchniowych komórek analizowano przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej (2-D) oraz technologii Ettan™ DIGE.

Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Niniejszy film ma na celu spopularyzowanie protokołu barwienia koloidalnego Coomassie G-250 według Kanga et al., służącego do wykrywania średnio 4 ng białka w żelach. Barwienie zostaje zakończone w ciągu 2 godzin i nie wymaga dużego nakładu pracy. Rutynowo stosujemy protokół Kanga do celów analitycznych w proteomice opartej na żelach.

Szybkie i czułe barwienie białek w żelach poliakrylamidowych koloidalnym barwnikiem Coomassie G-250

W tym filmie demonstrujemy metodę barwienia srebrem żeli poliakrylamidowych do wizualizacji całkowitego białka za pomocą sond fluorogenicznych.

Barwienie srebrem fluorescencyjnym: technika wizualizacji białka całkowitego w żelach poliakrylamidowych

W tym filmie demonstrujemy procedurę łączonego barwienia alcian niebieskim i srebrnym siarczanowych glikozaminoglikanu oligosacharydów. Ta połączona technika barwienia znacznie wzmacnia pasma polimerów glikozaminoglikanu o różnej długości w żelach poliakrylamidowych.

Barwienie srebrem siarczanowanych glikozaminoglikanów: metoda barwienia do wizualizacji siarczanowych glikozaminoglikanów w żelach poliakryloamidowych

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Tutaj przedstawiamy prosty i tani protokół barwienia srebrem, który wymaga tylko trzech odczynników i 7 minut przetwarzania, i jest odpowiedni do szybkiego generowania wysokiej jakości danych SSR w analizie genetycznej.

Szybki protokół barwienia srebrem umożliwiający proste i skuteczne wykrywanie markerów SSR przy użyciu niedenaturującego żelu poliakrylamidowego

Tutaj prezentujemy czułą, szybką i dyskryminującą metodę barwienia po żelu do obrazowania RNA oznaczonych aptamerami RNA Mango I, II, III lub IV, przy użyciu natywnych lub denaturujących żeli do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Po uruchomieniu standardowych żeli PAGE, RNA znakowane mango można łatwo wybarwić TO1-Biotyną, a następnie przeanalizować za pomocą powszechnie dostępnych czytników fluorescencji.

Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu

Ten raport opisuje techniki izolacji i oczyszczania siarczanowych glikozaminoglikanów (GAG) z próbek biologicznych oraz metodę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w celu przybliżenia ich wielkości. GAG przyczyniają się do budowy tkanek i wpływają na procesy sygnalizacyjne poprzez oddziaływanie elektrostatyczne z białkami. Długość polimeru GAG przyczynia się do ich powinowactwa do pokrewnych ligandów.

Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem

Poznaj nową metodę fluorescencyjnego barwienia srebrem białek w żelach poliakryloamidowych z wykorzystaniem sondy fluorogennej. Ta technika oferuje lepszą czułość i specyficzność niż tradycyjne metody barwienia srebrem.

Fluorescencyjne barwienie srebrem białek w żelach poliakryloamidowych

Przeglądaj więcej filmów