Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach
29 listopada 2018
Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii chemicznej i odkrywania leków. Na przykład, czy twój związek wiąże się z białkiem docelowym? Główną zaletą tej techniki jest to, że nie ma potrzeby odłączania przylegających komórek.
A lokalizację przestrzenną można określić za pomocą obrazowania. Chociaż zastosowaliśmy tę metodę w liniach komórkowych, możliwe jest również zastosowanie tej metody do innych systemów komórkowych, takich jak kultury pierwotne i kokultury. Przed wysiewem komórek umieść czarne 384-dołkowe płytki do obrazowania w kapturze do hodowli tkankowych i przykryj płytki folią aluminiową przed użyciem standardowego wiertła, aby wykonać trzy otwory o średnicy 3,5 milimetra na obu końcach każdej płytki.
Gdy płytki są gotowe, należy zastosować technikę aseptyczną, aby przemyć kulturę komórkową A-431 za pomocą 5 do 10 mililitrów PBS. I inkubuj komórki z dwoma mililitrami trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się oderwą. Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do 5 razy 10 do 4 komórek na mililitr w pożywce hodowlanej i zasiać 40 mikrolitrów komórek do każdego dołka każdej płytki testowej.
Delikatnie potrząśnij każdą płytką z boku na bok po wysianiu, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek na dnie studzienki. Aby zminimalizować wpływ krawędzi płytki, pozwól komórkom osiąść na dnie płytek testowych przez 20 minut w temperaturze pokojowej z tyłu okapu z przepływem laminarnym przed umieszczeniem płytek w niestandardowej wilgotnej komorze na dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W dniu eksperymentu użyj podkładki do płytek, aby zassać pożywkę z każdej studzienki.
I dodać 30 mikrolitrów interesującego związku o odpowiednim stężeniu doświadczalnym do odpowiednich studzienek doświadczalnych. Uszczelnić płytki testowe poddane działaniu związków za pomocą oddychających uszczelek płytowych. I włóż płytki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na 30 minut.
Aby wystawić komórki na próbę cieplną, najpierw ustaw łaźnię wodną na odpowiednią temperaturę doświadczalną i umieść w kąpieli nieuszczelnioną atrapę płytki zawierającą taką samą objętość pożywki na studzienkę, jak płytkę testową, wraz z termometrem termoparowym do monitorowania temperatury w studzienkach. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury doświadczalnej należy zdjąć oddychającą uszczelkę z każdej płytki testowej i ponownie uszczelnić płytki szczelnie przylegającą folią aluminiową, aby upewnić się, że woda nie przedostanie się do studzienek podczas ich późniejszego ogrzewania w łaźni wodnej. Zapewnienie dostępu do wywierconych otworów w ramie płyty.
Umieścić płytki testowe i nową atrapę płytki w łaźni wodnej, tak aby dno płytki było ustawione pod kątem w kierunku powierzchni wody, aby wypchnąć pozostałe powietrze spod płytek, i rozpocznij monitorowanie temperatury nowej płytki atrapy. Równomierne nagrzewanie płytki ma kluczowe znaczenie dla wydajności testu. Uważaj, aby umieścić płytkę w łaźni wodnej w taki sposób, aby pod spodem nie było uwięzionych pęcherzyków powietrza.
Po trzech minutach natychmiast schłodzić płytki w drugiej łaźni wodnej z wodą o temperaturze pokojowej przez pięć minut przed ich analizą. Aby zobrazować komórki, najpierw dodaj 10 mikrolitrów 16% paraformaldehydu bezpośrednio do płytek testowych na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu utrwalania przemyć komórki 300 mikrolitrami PBS na myjce płytkowej i dodać 20 mikrolitrów 0,1% NP40 na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji umyć komórki, jak pokazano. I zablokuj komórki 15 mikrolitrami 1% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie użyj podkładki do płytki, aby zassać surowicę blokującą i dodać 10 mikrolitrów pierwotnego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do odpowiednich studzienek na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę 300 mikrolitrami PBS i oznaczyć komórki 10 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała wtórnego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. W celu barwienia jądrowego komórek dodaj 10 mikrolitrów odpowiedniego barwnika jądrowego do każdej studzienki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. I umyj komórki w PBS, jak pokazano.
Oznacz komórki 10 mikrolitrami maski komórkowej na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie następuje ostatnie mycie PBS. Następnie dozuj 60 mikrolitrów świeżego PBS do każdej studzienki i uszczelnij płytki folią aluminiową do czasu obrazowania.
Aby zobrazować komórki, należy przechwycić cztery obrazy na studzience na imagerze o wysokiej zawartości przy użyciu odpowiednich kanałów fluorescencyjnych pod 10-krotnym obiektywem za pomocą automatycznego laserowego autofokusa i zastosować binning podczas akwizycji. Następnie zapisz obrazy jako 16-bitowe pliki dot-tiff w skali szarości wraz z metadanymi. Rozpoznawanie przeciwciał nie powinno być zakłócone przez zmiany konformacyjne w białku docelowym, które mogą być wywołane przez wiązanie ligandów.
Na przykład BIRB796 ma długi współczynnik odchyleń, a kwantyfikacja docelowego zaangażowania jest możliwa tylko poprzez zastosowanie etapu pobierania antygenu. Ten reprezentatywny eksperyment z krzywą agregacji termicznej dla komórek traktowanych pozytywnymi i ujemnymi związkami kontrolnymi ilustruje typowe zakresy stabilizacji białek po potraktowaniu komórek związkami w różnych temperaturach. Tutaj pokazano typowy izotermiczny eksperyment odcisku palca dawka-odpowiedź, aby wykazać reprezentatywne zakresy stabilizacji białka w odpowiedzi na różne dawki eksperymentalnego związku.
Zastosowanie izotermicznych wyzwań cieplnych do badań przesiewowych związków w celu identyfikacji nowych spoiw białka docelowego pozwala na analizę dużej liczby związków w jednym stężeniu w tym samym czasie, przed izotermicznym odciskiem palca dawka-odpowiedź trafień w celu potwierdzenia stabilizacji białka docelowego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że dokładne warunki eksperymentalne, takie jak długość i temperatura wyzwania cieplnego, wpływają na obserwowaną siłę działania związków. Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być bardzo niebezpieczna.
Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak przestrzeganie instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół pomiaru interakcji leku z celem przy użyciu wysoko zawartościowego obrazowań w mikroplatelowej adaptacji testu przesunięcia termicznego komórkowego (CETSA). Ta metoda jest kluczowa dla odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii chemicznej i odkrywaniu leków.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia chemiczna
- Odkrywanie leków
- Techniki obrazowania
Tło
- Interakcja leku z celem jest istotna dla skutecznego rozwoju leków.
- Test przesunięcia termicznego komórkowego (CETSA) jest cennym narzędziem w tym kontekście.
- Ta metoda umożliwia lokalizację przestrzenną poprzez obrazowań.
- Może być zastosowana do różnych układów komórkowych, w tym kultur pierwotnych i kokultur.
Cel badania
- Aby określić, czy związek wiąże się z białkiem docelowym.
- Aby zweryfikować sondy chemiczne w rozwoju leków.
- Aby zwiększyć zrozumienie interakcji leku z celem.
Zastosowane metody
- Wysoko zawartościowe obrazowań w formacie mikroplatel.
- Przygotowanie czarnych płytek do assay obrazowania 384-well.
- Użycie folii aluminiowej do zakrycia płytek podczas wysiewu komórek.
- Wiercenie otworów w płytkach dla odpowiedniego obsługiwania.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na skuteczne pomiary interakcji leku z celem.
- Dostarcza lokalizowania przestrzennego interakcji leków.
- Może być zastosowana do różnych typów komórek poza liniami komórkowymi.
- Ułatwia weryfikację sond chemicznych.
Wnioski
- Ten protokół jest znaczącym postępem w technikach odkrywania leków.
- Oferuje niezawodną metodę oceny interakcji leku z celem.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować bardziej złożone układy biologiczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying drug-target engagement in adherent cells is a pivotal inflection point for target validation and early drug discovery. High content imaging adaptation of CETSA enables direct, modification-free assessment of compound binding, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking in heterogeneous cell populations. This workflow advances portfolio triage by providing robust, spatially resolved engagement data at scale.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of compound-target binding in physiologically relevant adherent cells.
- Supports functional target validation without requiring protein or ligand modification.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing compound effects in heterogeneous cell populations.
- Provides quantitative engagement data to inform go/no-go decisions in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, plate-based readiness for screening compound libraries.
- Ensures assay reproducibility and standardization through automated imaging and analysis.
- Generates quantitative, spatially resolved readouts for robust compound evaluation.
- Enables scalable platform reuse across diverse cell systems, including primary and cocultures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns compound engagement data with disease-relevant cellular contexts when using primary or coculture systems.
- Supports translational continuity by bridging discovery findings to preclinical model validation.
- Reduces biological risk by confirming target engagement in complex, heterogeneous populations.
Pipeline & Workflow Integration
This high content CETSA workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and downstream screening.
- Discovery Biology: Provides direct evidence of target engagement, clarifying pathway relevance and reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Offers high-throughput, quantitative, and reproducible outputs for compound triage.
- Analytics: Enables statistical comparison of engagement across compounds, doses, and conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant systems by accommodating primary and coculture models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modification-free platform for repeated use across programs and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces late-stage attrition by confirming target engagement in relevant cell systems.
- Operational Value: Standardizes workflows and enables reproducible, high-throughput data generation.
- Strategic Value: Informs portfolio decisions with robust, quantitative engagement metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high content imaging and quantitative image analysis.
- Demands access to automated imaging platforms and compatible assay plates.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions and data analysis pipelines.
- Adaptable to various adherent cell systems, including primary and cocultures, with protocol optimization.
- Experimental parameters such as heat challenge duration and temperature must be empirically determined for each target.
