Name: Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określania zaangażowania celu w przylegających komórkach. Technika CETSA umożliwia lokalizację przestrzenną bez odłączania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie infrastrukturalne ze strony Science for Life Laboratory i Karolinska Institutet. Autorzy doceniają również wkład i dyskusje z Michaelą Vallin, Magdaleną Otrocką i Thomasem Lundbäckiem.

1. Zasiewanie komórek
UWAGA: Aby uzyskać ogólny przegląd przepływu pracy, zobacz Rysunek 1. Szczegółowa lista materiałów i odczynników dostępna jest w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Przed wysiewem komórek należy wywiercić otwory standardowym wiertłem w ramie czarnych 384-dołkowych płytek do obrazowania, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod płytką w późniejszym etapie ogrzewania. Aby uniknąć przedostania się cząstek plastiku do studzienek na tym etapie i utrzymać sterylne warunki, należy uszczelnić płytki samoprzylepną folią aluminiową lub przykryć płytkę przed wierceniem w kapturze do hodowli tkankowych. Zazwyczaj wystarczą 3 otwory o średnicy 3,5 mm z każdej strony płytki (krótka krawędź).</li>
	<li>Przygotuj ławkę z przepływem laminarnym, czyszcząc ją 70% etanolem. Postępując zgodnie ze standardowymi technikami aseptycznej hodowli tkankowej, usuń pożywkę z kolby komórkowej lub naczynia. Przemyć komórki 5-10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodać 2 ml trypsyny do kolby. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek A-431. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 50 000 komórek/ml w pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Dozować 40 μl zawiesiny komórek (uzyskując końcową gęstość komórek 2 000 komórek na studzienkę) do każdej studzienki płytki testowej za pomocą dozownika odczynników luzem lub pipety wielokanałowej, w zależności od skali eksperymentu. Na krótko przesuwaj płytkę z boku na bok, aby równomiernie rozproszyć komórki na dnie płytki.</li>
	<li>Aby zminimalizować wpływ na krawędź płytki, pozwól komórkom osiąść na dnie płytki testowej przez 20 minut w temperaturze pokojowej z tyłu okapu z przepływem laminarnym. Następnie umieść talerz w plastikowym pojemniku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi, aby zapewnić wilgotną atmosferę. Przed użyciem przetrzyj plastikowy pojemnik 70% etanolem.</li>
	<li>Inkubować pudełko z płytką do oznaczania przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w konwencjonalnym inkubatorze nawilżanym. Monitoruj zbieganie się komórek do 50-75%, co ocenia się na podstawie oględzin pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
2. Leczenie złożone
<ol>
	<li>W dniu eksperymentu odessać pożywkę z każdej studzienki za pomocą podkładki do płytek. Umieść płytkę na podkładce do płyt i wybierz program aspiracji. Jeśli myjka do talerzy nie jest dostępna, płyn można usunąć, odwracając płytkę szybkim przekręceniem ręką nad tacą na śmieci lub zlewem. Całkowite usunięcie płynu jest niezbędne dla dobrej wydajności. Nadmiar płynu jest następnie usuwany przez przetarcie ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Dodać 30 μl związków rozcieńczonych do odpowiedniego stężenia w pożywce do hodowli komórkowych za pomocą automatycznego dozowania lub pipety wielokanałowej, w zależności od skali eksperymentu. Upewnij się, że dodano ujemną (DMSO) i dodatnią (znaną ligand) kontrolę do kilku studzienek na każdej płytce testowej. Ponieważ jest to test przesunięcia termicznego, konieczne jest, aby stężenie związku przekroczyło stałą dysocjacji, aby zaobserwować stabilizację białka. Tak więc przybliżone wytyczne dotyczące stężenia związków są 50-100 razy większe niż IC50, ale bardziej szczegółowe opisy stężeń związków można znaleźć w sekcji Dyskusja. 
	UWAGA: Tolerancja DMSO linii komórkowych powinna zostać przetestowana przed eksperymentem.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę testową poddaną działaniu związków chemicznych z oddychającą płytką i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze przez 30 minut.</li>
</ol>
3. Wyzwanie upału
<ol>
	<li>Najpierw ustaw łaźnię wodną na żądaną temperaturę. Należy pamiętać, że temperatura końcowa, która jest osiągana wewnątrz studzienek płytki testowej, może różnić się od temperatury końcowej w łaźni wodnej. Zbadaj wcześniej przesunięcie za pomocą atrapy płytki i termometru termoparowego. Zazwyczaj potrzeba 30 minut, aby kąpiel ustabilizowała się w żądanej temperaturze.</li>
	<li>W celu sprawdzenia, czy żądana temperatura została osiągnięta w studzienkach płytki testowej podczas etapu ogrzewania, należy przygotować nieuszczelnioną atrapę płytki zawierającą taką samą objętość pożywki jak płytka do oznaczania.</li>
	<li>Wyjąć płytki testowe z inkubatora. Zdjąć oddychającą uszczelkę i ponownie uszczelnić płytkę testową zawierającą komórki poddane działaniu związku szczelnie przylegającą folią aluminiową, aby upewnić się, że woda nie przedostanie się do studzienek podczas późniejszego ogrzewania w łaźni wodnej. Upewnij się, że wywiercone otwory w ramie płyty są dostępne.</li>
	<li>Umieścić płytkę do oznaczania i atrapę płytki w łaźni wodnej z dnem płytki skierowanym pod kątem w kierunku powierzchni wody, aby wypchnąć pozostałe powietrze spod płytek.</li>
	<li>Monitoruj temperaturę wewnątrz studzienek nowej atrapy płytki za pomocą termometru termoparowego.</li>
	<li>Podgrzewać płytkę do oznaczania w łaźni wodnej przez 3 minuty. Natychmiast przenieś test i atrapę płytki do innej łaźni wodnej z wodą o temperaturze pokojowej, aby ostygły przez 5 minut. Płytka testowa jest teraz gotowa do dalszej obróbki.</li>
</ol>
4. Fiksacja
<ol>
	<li>Dozować 10 μl 16% (w/v) paraformaldehydu (PFA) bezpośrednio na płytkę testową za pomocą dozownika odczynników luzem lub pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. 
	Uwaga: Niektóre utrwalacze są klasyfikowane jako rakotwórcze i należy przestrzegać instytucjonalnych przepisów bezpieczeństwa.</li>
	<li>Odessać roztwór PFA i przemyć komórki 300 μl PBS za pomocą myjki do płytek. Umieść płytkę na podkładce do płyt i wybierz program aspiracji. 
	UWAGA: Ta procedura została zoptymalizowana przy użyciu protokołu przelewu na myjce płyt, w którym płyn jest jednocześnie dozowany i usuwany. Jeśli myjka do płyt lub podobna procedura nie jest dostępna, etap mycia można alternatywnie wykonać ręcznie.</li>
	<li>Procedura mycia ręcznego: Usuń płyn ze studzienek, odwracając płytkę szybkim ręcznym przekręceniem nad tacą na odpady lub zlewem. Całkowite usunięcie płynu jest niezbędne dla dobrej wydajności. Dodać 80 μl PBS za pomocą pipety wielokanałowej i ponownie odwrócić płytkę, jak opisano powyżej, powtórzyć procedurę mycia dwa razy. Po ostatnim umyciu osusz talerz o czyste ręczniki papierowe, aby usunąć nadmiar płynu.</li>
</ol>
5. Przepuszczalność
<ol>
	<li>Dodać 20 μl 0,1% (v/v) NP-40 do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umyj komórki, stosując tę samą procedurę, jak opisaną powyżej (krok 4.2).</li>
	<li>Alternatywnie, w stosownych przypadkach, należy zastosować protokół odzyskiwania antygenu, np.:
	<ol>
		<li>Dodać 20 μl 1% SDS do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i myć zgodnie z tą samą procedurą opisaną powyżej (krok 4.2).</li>
		<li>Dodać 80 μl 10 mM glicyny o pH 7,2 i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór glicyny za pomocą myjki do płytek, umieszczając go na podkładce do płytek i wybierając protokół aspiracji. Patrz uwagi w ppkt 2.1 i 4.2, jeżeli podkładka do blach nie jest dostępna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Blokowanie
<ol>
	<li>Dodać 15 μl 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS do studzienek za pomocą dozownika odczynników zbiorczych lub pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C z uszczelką z folii aluminiowej.</li>
</ol>
7. Przeciwciało pierwotne
<ol>
	<li>Zassać roztwór blokujący za pomocą podkładki do płytek, umieszczając ją na podkładce płytki i wybierając protokół aspiracji. Patrz uwagi w ppkt 2.1 i 4.2, jeżeli podkładka do blach nie jest dostępna.</li>
	<li>Dodać 10 μl pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego odpowiednio w 1% (w/v) BSA w PBS do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C z uszczelką z folii aluminiowej.</li>
</ol>
8. Przeciwciało drugorzędowe
<ol>
	<li>Odessać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i umyć studzienki zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano powyżej (krok 4.2).</li>
	<li>Dodać 10 μl przeciwciała drugorzędowego Alexa 488 rozcieńczonego odpowiednio w 1% (w/v) BSA w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Uszczelnij płytę samoprzylepną uszczelką z folii aluminiowej, aby chronić ją przed światłem. 
	UWAGA: Chroń płytkę przed światłem podczas tego i kolejnych kroków.</li>
</ol>
9. Barwienie jądrowe i maska komórkowa
<ol>
	<li>Dodać 10 μl barwnika jądrowego rozcieńczonego do 0,05 mg/ml w PBS do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 10 minut.</li>
	<li>Odessać przeciwciało drugorzędowe i roztwór Hoechsta i umyć studzienki, stosując tę samą procedurę, jak opisano powyżej (krok 4.2).</li>
	<li>Dodać 10 μl maski komórkowej rozcieńczonej do 200 ng/ml w PBS do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Zassać roztwór maski komórkowej i umyć studzienki, stosując tę samą procedurę, jak opisano powyżej (krok 4.2).</li>
	<li>Dozować 60 μl PBS do wszystkich studzienek za pomocą myjki do płytek, dozownika odczynników luzem lub pipety wielokanałowej i uszczelnić płytki samoprzylepną folią aluminiową.</li>
</ol>
10. Akwizycja i analiza obrazu
<ol>
	<li>Rejestruj obrazy na imagerze o wysokiej zawartości przy użyciu 3 kanałów fluorescencyjnych: DAPI (387/447), GFP (472/520) i TexasRed (562/624). Zrób 4 zdjęcia na studnię za pomocą obiektywu 10X. Użyj automatycznego laserowego autofokusa i zastosuj binning 2 podczas akwizycji. Przechowuj obrazy jako 16-bitowe pliki tiff w skali szarości wraz z metadanymi.</li>
	<li>Analizuj obrazy za pomocą dostępnego oprogramowania. Zidentyfikuj granice komórek za pomocą algorytmu punktacji komórki z DAPI (jądro) i TexasRed (cytoplazma).</li>
	<li>Wyodrębnij średnią intensywność dla wszystkich uzyskanych długości fal w celu dalszej analizy danych.</li>
	<li>Oblicz współczynnik Z, aby zapewnić solidność testu.</li>
	<li>Obliczyć stabilizację procentową, stosując następujący wzór: 100*(1-(intensywność odwiertu – kontrola ujemna o średniej intensywności odwiertu)/(kontrola dodatnia o średniej intensywności – kontrola ujemna o średniej intensywności)). W tym przypadku kontrolą ujemną jest DMSO, a kontrolą pozytywną jest substancja odniesienia. Ponieważ maksymalna stabilizacja między związkami może się różnić i w rzeczywistości być większa niż kontrola pozytywna dla krzywych ITDRF, maksymalne i minimalne intensywności stabilizacji dla każdego związku są czasami stosowane zamiast wartości intensywności studzienek kontrolnych.</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R%26D+productivity+at+AstraZeneca%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li>
<li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165(2015).</li>
<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li>
<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+flow+of+medicines+be+improved%3F+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li>
<li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+validation+using+chemical+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li>
<li>Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li>
<li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091(2015).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Thermal+Shift+Assay%3A+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li>
<li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li>
<li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040(2016).</li>
<li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li>
<li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+%28CETSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li>
<li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAxelsson%2C+H+%22Assay+Guidance+Manual+%5BInternet%5D%22">Assay Guidance Manual [Internet]</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).</li>
<li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

Jak omówiono w sekcji wyników, procedura składa się z kilku kluczowych kroków. Po pierwsze, ważne jest, aby zidentyfikować wysokiej jakości odczynnik powinowactwa. Zalecamy przeprowadzenie badań przesiewowych małej biblioteki przeciwciał dla każdego pożądanego celu. Po wybraniu przeciwciała pierwszorzędowego ważne jest również, aby w razie potrzeby zweryfikować system pod kątem wielu różnych miejsc wiązania docelowego białka. Zdecydowanie zaleca się przeprowadzanie badań przesiewowych pod kątem związków, które zakłócają ...

Podczas opracowywania nowych leków lub sond chemicznych konieczne jest powiązanie obserwowanego efektu farmakologicznego lub odczytu funkcjonalnego z pomiarami zajętości lub zaangażowania celu w żywych komórkach1,2,3. Dane te są niezbędne zarówno do zapewnienia, że mała cząsteczka rzeczywiście osiągnie pożądany cel, jak i do walidacji biologicznej hipotezy stojącej za wyborem celu białka4,5. Ponadto podczas opracowywania leków wykorzystuje się systemy modelowe o coraz większej złożoności do wyboru i potwierdzenia związku wiodącego przed badaniami klinicznymi. Aby potwierdzić translację biologii w tych systemach przedklinicznych, kluczowe znaczenie mają metody śledzenia zaangażowania leku w cel i towarzysząca biologii w całym procesie rozwoju.
Tradycyjnie monitorowanie interakcji leku z celem było tradycyjnie trudne do monitorowania w żywych komórkach z niefunkcjonalizowanymi małymi cząsteczkami i białkami, zwłaszcza na poziomie pojedynczej komórki z rozdzielczością przestrzenną6,7. Jedną z najnowszych metod obserwacji interakcji między niezmodyfikowanymi lekami a białkami w żywych komórkach jest komórkowy test przesunięcia termicznego (CETSA), w którym określa się ilościowo indukowaną ligandem stabilizację natywnego białka w odpowiedzi na wyzwanie cieplne8,9,10. Osiąga się to poprzez ilościowe określenie pozostałego rozpuszczalnego białka po ekspozycji na wyzwanie cieplne. We wstępnym ujawnieniu CETSA, western blot został użyty do wykrywania. Aby umożliwić kampanie przesiewowe i klasyfikację większych zbiorów związków, wysiłki mające na celu zwiększenie przepustowości eksperymentów CETSA doprowadziły do opracowania kilku jednorodnych testów opartych na mikropłytkach10,11. Jednak jednym z ograniczeń tych metod jest to, że obecnie najlepiej nadają się one do leczenia związkami w zawiesinach komórkowych, a wykrywanie wymaga lizy komórek, co prowadzi do utraty informacji przestrzennych. CETSA może być stosowana eksperymentalnie jako indukowane przez ligand przesunięcie temperatury agregacji termicznej (Tagg) przy pojedynczym stężeniu małej cząsteczki lub stężeniu liganda niezbędnym do ustabilizowania białka w jednej temperaturze. To ostatnie określa się mianem izotermicznych odcisków palców odpowiedzi na dawkę (ITDRF), aby podkreślić zależność tych pomiarów od konkretnych warunków doświadczalnych.
Celem tego protokołu jest pomiar zaangażowania celu za pomocą CETSA w przylegających komórkach poprzez wykrywanie przeciwciał immunofluorescencyjnych (IF) za pomocą mikroskopii o wysokiej zawartości12. Procedura ta rozszerza oryginalną platformę CETSA, aby umożliwić jednokomórkową kwantyfikację zaangażowania docelowego z zachowaniem lokalizacji subkomórkowej. Warto zauważyć, że w przeciwieństwie do wielu poprzednich doniesień, w tej procedurze obróbka złożona jest przeprowadzana w żywych przylegających komórkach bez odrywania powierzchni lub mycia przed wyzwaniem cieplnym, zachowując w ten sposób ustaloną równowagę wiązania, którą zamierzamy zmierzyć13. Obecnie metoda jest zwalidowana dla jednego docelowego białka p38α (MAPK14) w kilku liniach komórkowych i mamy nadzieję, że dzieląc się tą procedurą, technika może być szeroko stosowana w całym topniejącym proteomie. Przewidujemy, że protokół ten będzie można dostosować na całym etapie opracowywania leków, począwszy od badań przesiewowych, poprzez klasyfikację trafień, aż po monitorowanie zaangażowania celu in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td>do odłączania komórek i subkulturowania</td></tr><tr><td>16% paraformaldehydu (PFA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>utrwalacz</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (H+L), Alexa Fluor 488 przeciwciało sprzężone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11008</td><td>przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>HCS CellMask Czerwone barwienie</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H32712</td><td>Barwienie cytoplazmy</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56741</td><td>do przepuszczalności</td></tr><tr><td>Barwienie Hoechst 33342</td><td>Barwienie jądrowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka (DMEM) - składnik</td><td>pożywki do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6429</td> o wysokiej zawartości glukozy</tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórkowych</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>składnik pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Corning, oddychająca uszczelka płytkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3345</td><td>do etapu inkubacji copound</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-p38 [E229]</td><td>Abcam</td><td>ab170099</td><td>przeciwciało pierwszorzędowe, LOT:GR305364-16</td></tr><tr><td>Falcon, czarne 384-dołkowe przezroczyste płytki obrazowe z dnem Płytki obrazowe</td><td>VWR</td><td>736-2044</td><td></td></tr><tr><td>Greiner, 384-dołkowe płytki polipropylenowe o małej objętości</td><td>VWR</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepna folia aluminiowa</td><td>VWR</td><td>30127790</td><td></td></tr><tr><td>Zrywalna uszczelka aluminiowa</td><td>Agilent</td><td>24210-001</td><td>dla PlateLoc</td></tr><tr><td>LY2228820</td><td>Selleckchem</td><td>S1494</td><td>p38 i alfa inhibitor</td></tr><tr><td>PH797804</td><td>Selleckchem</td><td>PH797804</td><td>inhibitor p38 i alfa</td></tr><tr><td>BIRB796</td><td>Selleckchem</td><td>S1574</td><td>p38 i alfa</td></tr><tr><td>inhibitor SB203580</td><td>Tocris</td><td>1202</td><td>p38 i alfa</td></tr><tr><td>AMG 548</td><td>Tocris</td><td>3920</td><td>p38 i alfa inhibitor</td></tr><tr><td>RWJ 67657</td><td>Tocris</td><td>2999</td><td>p38 i alfa; inhibitor</td></tr><tr><td>L-skepinonu</td><td>CBCS kolekcja</td><td></td><td>p38 i alfa</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>środek blokujący</td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td> <td>BDH</td><td>44244</td><td>stosowany w pobieraniu antygenu</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td>stosowana w komórkach</td></tr><tr><td>A-431</td><td>do</td> odzyskiwania antygenu <td>ATCC ATC-CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550</td><td>Labcyte</td><td></td><td>Do przygotowania płytek złożonych</td></tr><tr><td>Uszczelniacz do płyt</td><td>Agilent</td><td></td><td>PlateLoc</td></tr><tr><td>Dozownik odczynników luzem</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td>Multidrop Combi</td></tr><tr><td>Automated liquid obsługa</td> Platforma do obsługi cieczy <td>Agilent</td><td></td><td>Bravo; służy do przygotowania płytek złożonych</td></tr><tr><td>Myjka do płyt</td><td>Tecan</td><td></td><td>Hydrospeed Łaźnia</td></tr><tr><td>wodna</td><td>Julabo</td><td>TW12</td><td></td></tr><tr><td>Termopara</td><td>VWR</td><td></td><td>Termopara Termometr laboratoryjny</td></tr><tr><td>o wysokiej zawartości Urządzenia</td><td></td><td>molekularne</td><td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content System analizy</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Ilościowe określenie interakcji małych cząsteczek z ich zamierzonym celem białkowym jest kluczowe dla rozwoju leków, walidacji celów i walidacji sond chemicznych. Metody, które mierzą to zjawisko bez modyfikacji docelowego białka lub małej cząsteczki, są szczególnie cenne, choć stanowią wyzwanie techniczne. Test przesunięcia termicznego komórkowego (CETSA) jest jedną z technik monitorowania zaangażowania celu w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy adaptację oryginalnego protokołu CETSA, która pozwala na pomiary o wysokiej przepustowości przy jednoczesnym zachowaniu lokalizacji subkomórkowej na poziomie pojedynczej komórki. Uważamy, że protokół ten oferuje ważne postępy w zastosowaniu CETSA do dogłębnej charakterystyki interakcji związek-cel, szczególnie w heterogenicznych populacjach komórek.

Protokół przedstawiony na Rysunku 1 opisuje podstawowy schemat postępowania dla analiz CETSA na komórkach przylegających, z detekcją pozostałego rozpuszczalnego białka za pomocą obrazowania wysokotreściowego (high content imaging). Schemat ten można łatwo dostosować do wszystkich etapów opracowywania analizy poprzez modyfikację układu związków lub odczynników na płytce14. Poniżej szczegółowo opisano oczekiwane wyniki dla kilku przewidy...

Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii chemicznej i odkrywania leków. Na przykład, czy twój związek wiąże się z białkiem docelowym? Główną zaletą tej techniki jest to, że nie ma potrzeby odłączania przylegających komórek.A lokalizację przestrzenną można określić za pomocą obrazowania. Chociaż zastosowaliśmy tę metodę w liniach komórkowych, możliwe jest również zastosowanie tej metody do innych systemów komórkowych, takich jak kultury pierwotne i kokultury. Przed wysiewem komórek umieść czarne 384-dołkowe płytki do obrazowania w kapturze do hodowli tkankowych i przykryj płytki folią aluminiową przed użyciem standardowego wiertła, aby wykonać trzy otwory o średnicy 3,5 milimetra na obu końcach każdej płytki.Gdy płytki są gotowe, należy zastosować technikę aseptyczną, aby przemyć kulturę komórkową A-431 za pomocą 5 do 10 mililitrów PBS. I inkubuj komórki z dwoma mililitrami trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się oderwą. Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do 5 razy 10 do 4 komórek na mililitr w pożywce hodowlanej i zasiać 40 mikrolitrów komórek do każdego dołka każdej płytki testowej.Delikatnie potrząśnij każdą płytką z boku na bok po wysianiu, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek na dnie studzienki. Aby zminimalizować wpływ krawędzi płytki, pozwól komórkom osiąść na dnie płytek testowych przez 20 minut w temperaturze pokojowej z tyłu okapu z przepływem laminarnym przed umieszczeniem płytek w niestandardowej wilgotnej komorze na dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W dniu eksperymentu użyj podkładki do płytek, aby zassać pożywkę z każdej studzienki.I dodać 30 mikrolitrów interesującego związku o odpowiednim stężeniu doświadczalnym do odpowiednich studzienek doświadczalnych. Uszczelnić płytki testowe poddane działaniu związków za pomocą oddychających uszczelek płytowych. I włóż płytki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na 30 minut.Aby wystawić komórki na próbę cieplną, najpierw ustaw łaźnię wodną na odpowiednią temperaturę doświadczalną i umieść w kąpieli nieuszczelnioną atrapę płytki zawierającą taką samą objętość pożywki na studzienkę, jak płytkę testową, wraz z termometrem termoparowym do monitorowania temperatury w studzienkach. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury doświadczalnej należy zdjąć oddychającą uszczelkę z każdej płytki testowej i ponownie uszczelnić płytki szczelnie przylegającą folią aluminiową, aby upewnić się, że woda nie przedostanie się do studzienek podczas ich późniejszego ogrzewania w łaźni wodnej. Zapewnienie dostępu do wywierconych otworów w ramie płyty.Umieścić płytki testowe i nową atrapę płytki w łaźni wodnej, tak aby dno płytki było ustawione pod kątem w kierunku powierzchni wody, aby wypchnąć pozostałe powietrze spod płytek, i rozpocznij monitorowanie temperatury nowej płytki atrapy. Równomierne nagrzewanie płytki ma kluczowe znaczenie dla wydajności testu. Uważaj, aby umieścić płytkę w łaźni wodnej w taki sposób, aby pod spodem nie było uwięzionych pęcherzyków powietrza.Po trzech minutach natychmiast schłodzić płytki w drugiej łaźni wodnej z wodą o temperaturze pokojowej przez pięć minut przed ich analizą. Aby zobrazować komórki, najpierw dodaj 10 mikrolitrów 16% paraformaldehydu bezpośrednio do płytek testowych na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu utrwalania przemyć komórki 300 mikrolitrami PBS na myjce płytkowej i dodać 20 mikrolitrów 0,1% NP40 na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji umyć komórki, jak pokazano. I zablokuj komórki 15 mikrolitrami 1% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie użyj podkładki do płytki, aby zassać surowicę blokującą i dodać 10 mikrolitrów pierwotnego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do odpowiednich studzienek na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę 300 mikrolitrami PBS i oznaczyć komórki 10 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała wtórnego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. W celu barwienia jądrowego komórek dodaj 10 mikrolitrów odpowiedniego barwnika jądrowego do każdej studzienki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. I umyj komórki w PBS, jak pokazano.Oznacz komórki 10 mikrolitrami maski komórkowej na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie następuje ostatnie mycie PBS. Następnie dozuj 60 mikrolitrów świeżego PBS do każdej studzienki i uszczelnij płytki folią aluminiową do czasu obrazowania.Aby zobrazować komórki, należy przechwycić cztery obrazy na studzience na imagerze o wysokiej zawartości przy użyciu odpowiednich kanałów fluorescencyjnych pod 10-krotnym obiektywem za pomocą automatycznego laserowego autofokusa i zastosować binning podczas akwizycji. Następnie zapisz obrazy jako 16-bitowe pliki dot-tiff w skali szarości wraz z metadanymi. Rozpoznawanie przeciwciał nie powinno być zakłócone przez zmiany konformacyjne w białku docelowym, które mogą być wywołane przez wiązanie ligandów.Na przykład BIRB796 ma długi współczynnik odchyleń, a kwantyfikacja docelowego zaangażowania jest możliwa tylko poprzez zastosowanie etapu pobierania antygenu. Ten reprezentatywny eksperyment z krzywą agregacji termicznej dla komórek traktowanych pozytywnymi i ujemnymi związkami kontrolnymi ilustruje typowe zakresy stabilizacji białek po potraktowaniu komórek związkami w różnych temperaturach. Tutaj pokazano typowy izotermiczny eksperyment odcisku palca dawka-odpowiedź, aby wykazać reprezentatywne zakresy stabilizacji białka w odpowiedzi na różne dawki eksperymentalnego związku.Zastosowanie izotermicznych wyzwań cieplnych do badań przesiewowych związków w celu identyfikacji nowych spoiw białka docelowego pozwala na analizę dużej liczby związków w jednym stężeniu w tym samym czasie, przed izotermicznym odciskiem palca dawka-odpowiedź trafień w celu potwierdzenia stabilizacji białka docelowego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że dokładne warunki eksperymentalne, takie jak długość i temperatura wyzwania cieplnego, wpływają na obserwowaną siłę działania związków. Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być bardzo niebezpieczna.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak przestrzeganie instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa.

using-high-content-imaging-to-quantify-target-engagement-adherent

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.

Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

Ten protokół krok po kroku zawiera szczegółowy opis konfiguracji eksperymentu i analizy danych do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC oraz analizy adhezji leukocytów w przepływie fizjologicznym.

Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)

Tutaj opisujemy prostą i tanią metodę, która pozwala na ilościowe określenie komórek nowotworowych adhezji do kriosekcji węzłów chłonnych (LN). Komórki nowotworowe przylegające do LN są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej i potwierdzane metodą opartą na fluorescencji, dając wskaźnik adhezji, który ujawnia powinowactwo wiązania komórek nowotworowych do miąższu LN.

Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Poznaj metodę obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określania zaangażowania celu w przylegających komórkach. Technika CETSA umożliwia lokalizację przestrzenną bez odłączania komórek.

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Przeglądaj więcej filmów