Zoptymalizowany protokół Rhizobox do wizualizacji wzrostu korzeni i reakcji na zlokalizowane składniki odżywcze

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nauki o korzeniach i ryzosferze, takie jak to, jak korzenie reagują na zlokalizowane plamy składników odżywczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na powtarzalne, nieinwazyjne pomiary pojedynczego systemu korzeniowego w glebie, ale nie wymaga specjalistycznego sprzętu i jest stosunkowo niedroga. Zbierz części do Rhizoboxa do montażu.

Należą do nich przednie i tylne panele wykonane z przezroczystego akrylu o wymiarach około 40 centymetrów na 61 centymetrów. W tym miejscu na górze tylnego panelu znajdują się boczne i dolne przekładki. Przekładki są wyrównane z wcześniej wywierconymi otworami w panelach.

Wytnij odcinek poliestrowej wyściółki, który będzie przebiegał wzdłuż dna Rhizobox. Połóż wyściółkę na tylnym panelu bezpośrednio nad dolną przekładką, aby zapobiec wyciekom. Umieść górny panel na miejscu na podkładkach dystansowych, aby utrzymać wyściółkę na miejscu.

Teraz zdobądź sprzęt do złożenia Rhizoboxa. Użyj, dwóch podkładek i nakrętki sześciokątnej do każdego z wywierconych otworów. Umieść podkładkę na panelu przednim i dokręć przez nią do tylnego panelu.

Kolejna podkładka i nakrętka sześciokątna. Aby uniknąć utraty gleby, upewnij się, że wszystkie są bardzo dokręcone. Utwórz również dwie przekładki, aby utworzyć plastry zabiegowe i kontrolne.

Wykonaj je z arkuszy polietylenu o wysokiej gęstości i przykręć u góry, aby umożliwić tylko częściowe włożenie. W celu pozbawienia światła i redukcji ciepła przygotuj etui ochronne, które może zamknąć pudełko. Na koniec zbuduj ramę, aby zachęcić korzenie do wyrastania na tylnym panelu.

Ta rama z PVC utrzymuje pudełko pod kątem około 55 stopni. Przygotuj zhomogenizowaną mieszaninę ziemi polowej i piasku. Zacznij od dużej torby zawierającej mieszaninę substratów dla każdego Rhizoboxa.

Oznacz dwie małe torebki z zamkiem błyskawicznym w pudełku na plastry lecznicze i kontrolne. Użyj wagi i zważ 30 gramów podłoża z piasku glebowego. Przenieść substrat do worka kontrolnego.

W ten sam sposób dodaj 30 gramów substratu do worka zabiegowego. Następnie zważ jeden gram azotu oznaczonego jako źródło azotu 15 i dodaj go do worka zabiegowego. Dokładnie wymieszać podłoże i źródło azotu.

Pracuj z jednym Rhizoboxem i jego przekładkami do łat. Włóż dwie przekładki do Rhizobox, aż śruba uniemożliwi dalszy ruch. Zaznacz głębokość dolnej krawędzi przekładek z boku Rhizoboxa.

Następnie usuń przekładki, aby wykonać kolejne kroki. Za pomocą lejka napełnij Rhizobox z dużego worka z podłożem na zaznaczoną głębokość. Przesuwaj lejek do przodu i do tyłu powoli i równomiernie, aby równomiernie napełnić Rhizobox.

Gdy podłoże znajdzie się na zaznaczonej głębokości, włóż przekładki do pudełka. Powinny znajdować się pięć centymetrów od lewej i prawej strony pudełka. Kontynuuj napełnianie pudełka, aż podłoże znajdzie się około pięciu centymetrów od górnej części pudełka.

Następnie zorganizuj powolne nawadnianie podłoża w pudełku za pomocą 150 mililitrów wody z emiterami kroplowymi lub ręcznie. Pozwól mu odpocząć przez kilka godzin lub na noc, aby woda dyfundowała, a obszar wokół każdej przekładki był dokładnie zwilżony. W tym momencie usuń przekładki, aby pozostawić pustą wnękę na łaty.

Teraz przyklej przezroczystą folię na zewnątrz pudełka. Użyj przezroczystości, aby oznaczyć jedną łatkę jako leczenie, a drugą jako kontrolę. Następnie użyj lejka i przygotowanego podłoża kontrolnego, aby wypełnić plaster kontrolny.

Jest to oznaczona łatka kontrolna po jej wypełnieniu. W ten sam sposób należy przejść do wypełnienia plastra zabiegowego przygotowanym substratem zabiegowym. Po zakończeniu użyj markera permanentnego, aby prześledzić granicę każdej plamy na przezroczystej folii.

Następnie napełnij Rhizobox równomiernie pozostałym podłożem z dużej torby. Zakończ, obrysowując górną część podłoża na przezroczystości. Gdy pudełko będzie gotowe, przeszczep kiełkujące nasiona.

Najpierw użyj wąskiej szpatułki, aby wykopać dziurę w środku Rhizoboxa. Otwór powinien mieć głębokość 2,5 centymetra. Umieść kiełkujące nasiona w środku, upewniając się, że rodnik jest skierowany bezpośrednio w dół.

Prześledź położenie nasion na przezroczystości dołączonej do pudełka. Przykryj nasiona, a następnie podlej je do 50 mililitrów wody dejonizowanej. Następnie zamknij pudełko w etui, aby zapobiec interakcji światła z korzeniami podczas wzrostu.

Zabierz pudełko do przygotowanej do tego ramy. Umieść Rhizobox na ramie, aby pobudzić wzrost w kierunku tylnej ramy. Odzyskaj pudełko po każdych trzech do czterech dniach wzrostu roślin.

Po zdjęciu etui śledź widoczne korzenie rośliny, za każdym razem używając pisaka w innym kolorze. Podobnie jak w tym przykładzie, w tym kroku należy zachować spójność i systematyczność. Umieść zakryte pudełko na stojaku i upewnij się, że jest w pierwotnej orientacji.

W tym przypadku całkowita długość korzeni narysowanych na odwrocie 24 Rhizoboxów jest wykreślana w stosunku do długości korzeni zmierzonych za pomocą skanera i oprogramowania komputerowego. Podobny wykres dla prześledzonych wzorów korzeni z przodu pudełka pokazuje, że korzenie rosły preferencyjnie na tyłach pudełka. Spójne nachylenia na tym wykresie logarytmu całkowitej długości korzenia w funkcji dni wzrostu sugerują, że tempo wzrostu było podobne między różnymi pudełkami.

Poniżej znajdują się dane dotyczące gęstości długości korzeni dla jednego genotypu kukurydzy. Gęstość łaty kontrolnej jest mniejsza niż gęstość łatki poddanej działaniu azotu. W eksperymencie porównano gęstość długości korzeni dla sześciu oddzielnych genotypów kukurydzy.

We wszystkich przypadkach gęstość długości korzeni była większa w plastrze zabiegowym znakowanym azotem 15 w porównaniu z plastrem kontrolnym. Protokół ten można łączyć z innymi metodami, takimi jak sfigmografia lub hybrydyzacja in situ z fluorescencyjnym kwiatem, w celu wizualizacji przestrzennego rozkładu aktywności enzymów lub drobnoustrojów.