Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym
November 28th, 2018
Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii limfocytów T i opracowywania szczepionek wektorowych. Główną zaletą tej metody jest to, że potrzebne są tylko niewielkie ilości krwi, co pozwala na wielokrotne pomiary z tej samej myszy. Ponadto w tej samej próbce można wykryć CTL specyficzne dla wirusa i transgenu.
Procedurę zademonstrują Jasmine Rinnofner, technik, i Annika Rossler, doktorantka. Pomiarem i analizą próbek zajmie się Zoltan Banki, post-doc. Aby rozpocząć, bezpiecznie przytrzymuj mysz zgodnie z protokołem tekstowym.
Zbierz 20 mikrolitrów krwi w probówce pokrytej EDTA z żyły ogonowej myszy. Podczas pracy ze splenocytami należy odizolować śledzionę i za pomocą tłoka strzykawki przecisnąć tkankę przez sitko komórkowe. Po wykonaniu lizy na erytrocytach policz komórki i dostosuj stężenie próbki.
Przygotuj i oznacz jedną probówkę Facs dla każdej próbki i przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny narządów lub 20 mikrolitrów krwi do probówki. Podczas pracy ze splenocytami należy odwirować zawiesinę narządów przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie przekręć rurkę wirowo, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.
Dla każdego kanału, który ma być używany, przygotuj również rurkę Facs na próbkę kompensacyjną. Przygotować jedną dodatkową próbkę jako niebarwioną próbę. Przygotuj probówkę z Facs z tetramerami w optymalnym rozcieńczeniu i wiruj do wymieszania.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczenia tetrameru do każdej próbki i zwiruj, aby wymieszać. Dodać bufor Facs bez tetramerów do kontrolek kompensacyjnych i próbki niebarwionej. Następnie inkubuj próbki w ciemnych warunkach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.
Podczas inkubacji próbek dodać bufor Facs do probówki. Następnie dodać przeciwciała do buforu zgodnie z rozcieńczeniami określonymi w tabeli 2 protokołu tekstowego i przemieszać roztwór. W oczekiwaniu na pytanie naukowe są kombinacje markerów, oprócz opisanej tutaj, które mogą być stosowane.
Upewnij się, że w panelu zawsze znajdują się przeciwciała przeciwko CD3 i CD8. Dla każdego kanału przygotuj probówkę z 200 mikrolitrami buforu Facs i dodaj jeden mikrolitr rozcieńczenia przeciwciała przeciwko CD8 w odpowiednim kolorze i wiruj do wymieszania. Następnie przechowuj rozcieńczenia przeciwciał zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby umyć próbki, dodać jeden mililitr buforu Facs do próbek i odwirować. Następnie wyrzuć supernatant i odcedź pozostały płyn ręcznikami papierowymi. Podczas pracy z krwią należy zachować ostrożność podczas spuszczania pozostałego płynu.
Przed lizą erytrocytów krew nie przykleja się do dna probówki. Alternatywnie możesz odessać supernatant. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdej osadki komórkowej i delikatnie wymieszaj.
Dodaj 50 mikrolitrów każdej mieszanki kompensacyjnej do odpowiedniej kontroli kompensacyjnej i 50 mikrolitrów buforu Facs do osadu komórkowego niebarwionej kontroli i delikatnie wiruj. Podczas pracy ze splenocytami należy umyć próbki po barwieniu przeciwciałami bezpośrednio jednym do dwóch mililitrów buforu Facs i odwirować przez pięć minut. Następnie wyrzuć supernatant i odcedź pozostały płyn na ręcznikach papierowych.
Dodaj 500 mikrolitrów buforu ACK do każdej próbki krwi i delikatnie wymieszaj. Następnie inkubować próbki w ciemności przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj jeden mililitr buforu Facs do próbek i odwiruj.
Następnie wyrzuć supernatant i odcedź pozostały płyn ręcznikami papierowymi. Właściwa liza erytrocytów jest kluczowym krokiem ułatwiającym pomiar Facs, dlatego gdy osad jest raczej mokry, powtórz lizę erytrocytów. Ponownie umyć próbki, jak opisano wcześniej.
Następnie wyrzuć supernatant i odcedź pozostały płyn na ręczniku papierowym. Przed utrwaleniem upewnij się, że komórki są dobrze zawieszone, aby zapobiec tworzeniu się grudek. Dodaj 150 do 300 mikrolitrów buforu utrwalającego Facs do każdej probówki i wiruj do wymieszania.
Następnie należy jak najszybciej przystąpić do pomiaru metodą cytometrii przepływowej. Najpierw zmierz kontrolki kompensacji i skoryguj je pod kątem nakładania się widma. Następnie ustaw bramki sekwencyjne, aby wybrać komórki CD3-dodatnie i CD8-dodatnie.
Brama na limfocytach za pomocą obszaru rozpraszania do przodu i na boki. Następnie, w populacji limfocytów, brama na pojedynczych komórkach za pomocą szerokości rozproszenia do przodu w funkcji obszaru. Użyj kanałów CD3 i CD8 do wykreślenia limfocytów jednokomórkowych.
Zidentyfikuj limfocyty T CD8-dodatnie, bramkując na komórkach CD3-dodatnich i CD8-dodatnich. Upewnij się, że ogniwa CD8-low są zawarte w bramkowaniu. Propagacja na komórkach CD3 / CD8-dodatnich jest krytycznym krokiem w tym protokole.
Ponieważ aktywacja komórek często prowadzi do regulacji w dół CD3 i / lub CD8, należy również uwzględnić komórki o niskim poziomie CD3 / CD8. Następnie wykreśl komórki CD8-dodatnie w porównaniu z komórkami tetramerowymi, bramkując na komórkach CD8-dodatnich / tetramerowo-dodatnich. Jeśli to możliwe, zapisz 20 000 komórek w bramce CD3-dodatniej i CD8-dodatniej dla każdej próbki.
Na koniec zapisz pomiary jako plik FCS. W tym protokole limfocyty T CD8 + specyficzne dla antygenu zostały ilościowo wykryte w próbkach krwi i tkanek. Po bramkowaniu komórek CD3-dodatnich i CD8-dodatnich zidentyfikowano komórki tetramerowo-dodatnie.
Dwa różne tetramery połączono w tej samej probówce w celu barwienia, co pozwoliło na jednoczesne ilościowe określenie dwóch różnych specyficzności CTL. Korzystając z tego protokołu, odpowiedzi limfocytów T tej samej myszy mogą być śledzone w czasie, ponieważ do każdego pomiaru potrzebne są tylko niewielkie ilości krwi. Dodatkowo można analizować fenotypy CTL specyficznych dla antygenu.
Podczas próby tej procedury ważne jest, aby unikać wydłużonego czasu inkubacji, ponieważ może to prowadzić do internalizacji receptorów komórek T. Od czasu odkrycia technologii tetramerów, barwienie tetramerów stało się podstawowym narzędziem do analizy limfocytów T i szerokiego zakresu zastosowań, które obejmują gromadzenie tetramerów. Świetlana przyszłość dla jasnych tetramerów.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę jakościowej eks-vivo detekcji antygenowo-specyficznych komórek CD8 + T przy użyciu małych próbek krwi lub pojedynczych zawiesin komórkowych z narządów. Jest szczególnie przydatny w badaniach dotyczących reakcji cytotoksycznych komórek T, takich jak szczepienia i immunoterapia nowotworów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Imunologia komórek T
- Immunoterapię nowotworową
- Szczepionki z nosicielami wirusowymi
Tło
- Antygenowo-specyficzne komórki CD8 + T odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach immunologicznych.
- Małe próbki krwi umożliwiają wielokrotne pomiary od tego samego podmiotu.
- Detekcja wirusowych i transgenowo-specyficznych CTL może być przeprowadzona jednocześnie.
- Technologia tetramerów poprawia analizę populacji komórek T.
Cel badania
- Zapewnić niezawodną metodę wykrywania antygenowo-specyficznych komórek CD8 + T.
- Ułatwić badanie odpowiedzi komórek T w czasie.
- Umożliwić jednoczesne ilościowe określenie różnych specyficzności CTL.
Stosowane metody
- Zbieranie próbek krwi od myszy i izolację śledzionocytów.
- Przygotowanie próbek z tetramerami i przeciwciałami do cytometrii przepływowej.
- Kroki inkubacji i płukania w celu zapewnienia odpowiedniego barwienia i lizy.
- Pomiar cytometrią przepływową w celu zidentyfikowania i ilościowego określenia komórek T pozytywnych na CD8.
Główne wyniki
- Udane wykrycie antygenowo-specyficznych komórek CD8 + T w próbkach krwi i tkanek.
- Identyfikacja komórek pozytywnych na CD3 i CD8 za pomocą barwienia tetramerami.
- Możliwość śledzenia odpowiedzi komórek T w czasie przy minimalnym objętości krwi.
- Osiągnięto jednoczesną analizę wielu specyficzności CTL.
Wnioski
- Ten protokół jest skuteczny w badaniu odpowiedzi komórek T w różnych kontekstach immunologicznych.
- Zezwala na szczegółową analizę antygenowo-specyficznych populacji komórek T.
- Przyszłe zastosowania mogą poszerzyć użycie technologii tetramerów w badaniach immunologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous quantification of anti-vector and anti-transgene-specific CD8+ T cells from minimal blood samples, supporting iterative monitoring of immune responses in vaccine development. By allowing repeated measurements from the same animal, it reduces animal usage and increases data density in preclinical immunogenicity studies. The method directly informs go/no-go decisions by de-risking target antigen selection and vector construct efficacy early in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying T-cell responses against both vector and transgene antigens in parallel.
- Operational Value: Uses only 20 microliters of blood per measurement, facilitating longitudinal tracking in the same mouse model.
- Predictive Value: Supports predictive confidence in antigen selection by distinguishing immune responses to the antigen of interest from anti-vector immunity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative flow cytometry outputs for antigen-specific CD8+ T-cell frequencies.
- Reproducibility: Includes compensation controls and unstained samples to ensure spectral overlap correction and assay consistency.
- Scalability: Compatible with high-throughput screening of multiple tetramer specificities in a single tube.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase T-cell profiling to preclinical validation by enabling phenotype analysis (e.g., activation status via CD43/CD44/CD62L).
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed immunogenicity stems from the transgene or vector components, informing construct optimization.
- Preclinical Model Relevance: Works with blood or spleen-derived single-cell suspensions, supporting flexible use across anatomical compartments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, specifically supporting early immune profiling after vaccination and prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct ex vivo quantification of antigen-specific TCR engagement without functional stimulation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts that allow comparison of immune responses across different vaccine constructs.
- Analytics: Provides tetramer-positive cell frequencies as a key metric for comparing conditions and tracking responses over time.
- Translational Research: Connects to preclinical work by permitting phenotypic characterization of antigen-specific CD8+ T cells to assess differentiation state.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunological profiling platform applicable across viral vector vaccine and immunotherapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by decoupling anti-vector from anti-transgene T-cell responses.
- Operational Value: Ensures standardization through defined tetramer dilutions, antibody panels, and erythrocyte lysis steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of immunogenic liabilities or suboptimal antigen expression.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying immune responses that may compromise vaccine efficacy or safety.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, compensation, and gating strategies for lymphocyte and T-cell subsets.
- Dependent on access to MHC I tetramers specific to viral vector and transgene epitopes, and compatible flow cytometer configuration.
- Necessitates standardized SOPs for blood collection, erythrocyte lysis, and antibody staining to maintain inter-experiment consistency.
- Must account for potential TCR internalization by avoiding prolonged tetramer incubation beyond 20 minutes at 37°C.
- Limited to murine models in the current protocol; adaptation to other species would require validation of cross-reactive reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Sample Collection
1:21
Staining Set-up
1:59
Tetramer Staining and Preparation of Antibodies
3:17
Staining of Samples
4:24
Lysis of Erythrocytes
5:09
Flow Cytometric Measurement and Analysis
6:53
Results: Quantification of Antigen-specific CD8+ T Cells in Mouse Blood of Lymphoid Organs
7:36
Conclusion
