Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 ⁺ specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii limfocytów T i opracowywania szczepionek wektorowych. Główną zaletą tej metody jest to, że potrzebne są tylko niewielkie ilości krwi, co pozwala na wielokrotne pomiary z tej samej myszy. Ponadto w tej samej próbce można wykryć CTL specyficzne dla wirusa i transgenu.

Procedurę zademonstrują Jasmine Rinnofner, technik, i Annika Rossler, doktorantka. Pomiarem i analizą próbek zajmie się Zoltan Banki, post-doc. Aby rozpocząć, bezpiecznie przytrzymuj mysz zgodnie z protokołem tekstowym.

Zbierz 20 mikrolitrów krwi w probówce pokrytej EDTA z żyły ogonowej myszy. Podczas pracy ze splenocytami należy odizolować śledzionę i za pomocą tłoka strzykawki przecisnąć tkankę przez sitko komórkowe. Po wykonaniu lizy na erytrocytach policz komórki i dostosuj stężenie próbki.

Przygotuj i oznacz jedną probówkę Facs dla każdej próbki i przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny narządów lub 20 mikrolitrów krwi do probówki. Podczas pracy ze splenocytami należy odwirować zawiesinę narządów przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie przekręć rurkę wirowo, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.

Dla każdego kanału, który ma być używany, przygotuj również rurkę Facs na próbkę kompensacyjną. Przygotować jedną dodatkową próbkę jako niebarwioną próbę. Przygotuj probówkę z Facs z tetramerami w optymalnym rozcieńczeniu i wiruj do wymieszania.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczenia tetrameru do każdej próbki i zwiruj, aby wymieszać. Dodać bufor Facs bez tetramerów do kontrolek kompensacyjnych i próbki niebarwionej. Następnie inkubuj próbki w ciemnych warunkach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Podczas inkubacji próbek dodać bufor Facs do probówki. Następnie dodać przeciwciała do buforu zgodnie z rozcieńczeniami określonymi w tabeli 2 protokołu tekstowego i przemieszać roztwór. W oczekiwaniu na pytanie naukowe są kombinacje markerów, oprócz opisanej tutaj, które mogą być stosowane.

Upewnij się, że w panelu zawsze znajdują się przeciwciała przeciwko CD3 i CD8. Dla każdego kanału przygotuj probówkę z 200 mikrolitrami buforu Facs i dodaj jeden mikrolitr rozcieńczenia przeciwciała przeciwko CD8 w odpowiednim kolorze i wiruj do wymieszania. Następnie przechowuj rozcieńczenia przeciwciał zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby umyć próbki, dodać jeden mililitr buforu Facs do próbek i odwirować. Następnie wyrzuć supernatant i odcedź pozostały płyn ręcznikami papierowymi. Podczas pracy z krwią należy zachować ostrożność podczas spuszczania pozostałego płynu.

Przed lizą erytrocytów krew nie przykleja się do dna probówki. Alternatywnie możesz odessać supernatant. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdej osadki komórkowej i delikatnie wymieszaj.

Dodaj 50 mikrolitrów każdej mieszanki kompensacyjnej do odpowiedniej kontroli kompensacyjnej i 50 mikrolitrów buforu Facs do osadu komórkowego niebarwionej kontroli i delikatnie wiruj. Podczas pracy ze splenocytami należy umyć próbki po barwieniu przeciwciałami bezpośrednio jednym do dwóch mililitrów buforu Facs i odwirować przez pięć minut. Następnie wyrzuć supernatant i odcedź pozostały płyn na ręcznikach papierowych.

Dodaj 500 mikrolitrów buforu ACK do każdej próbki krwi i delikatnie wymieszaj. Następnie inkubować próbki w ciemności przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj jeden mililitr buforu Facs do próbek i odwiruj.

Następnie wyrzuć supernatant i odcedź pozostały płyn ręcznikami papierowymi. Właściwa liza erytrocytów jest kluczowym krokiem ułatwiającym pomiar Facs, dlatego gdy osad jest raczej mokry, powtórz lizę erytrocytów. Ponownie umyć próbki, jak opisano wcześniej.

Następnie wyrzuć supernatant i odcedź pozostały płyn na ręczniku papierowym. Przed utrwaleniem upewnij się, że komórki są dobrze zawieszone, aby zapobiec tworzeniu się grudek. Dodaj 150 do 300 mikrolitrów buforu utrwalającego Facs do każdej probówki i wiruj do wymieszania.

Następnie należy jak najszybciej przystąpić do pomiaru metodą cytometrii przepływowej. Najpierw zmierz kontrolki kompensacji i skoryguj je pod kątem nakładania się widma. Następnie ustaw bramki sekwencyjne, aby wybrać komórki CD3-dodatnie i CD8-dodatnie.

Brama na limfocytach za pomocą obszaru rozpraszania do przodu i na boki. Następnie, w populacji limfocytów, brama na pojedynczych komórkach za pomocą szerokości rozproszenia do przodu w funkcji obszaru. Użyj kanałów CD3 i CD8 do wykreślenia limfocytów jednokomórkowych.

Zidentyfikuj limfocyty T CD8-dodatnie, bramkując na komórkach CD3-dodatnich i CD8-dodatnich. Upewnij się, że ogniwa CD8-low są zawarte w bramkowaniu. Propagacja na komórkach CD3 / CD8-dodatnich jest krytycznym krokiem w tym protokole.

Ponieważ aktywacja komórek często prowadzi do regulacji w dół CD3 i / lub CD8, należy również uwzględnić komórki o niskim poziomie CD3 / CD8. Następnie wykreśl komórki CD8-dodatnie w porównaniu z komórkami tetramerowymi, bramkując na komórkach CD8-dodatnich / tetramerowo-dodatnich. Jeśli to możliwe, zapisz 20 000 komórek w bramce CD3-dodatniej i CD8-dodatniej dla każdej próbki.

Na koniec zapisz pomiary jako plik FCS. W tym protokole limfocyty T CD8 + specyficzne dla antygenu zostały ilościowo wykryte w próbkach krwi i tkanek. Po bramkowaniu komórek CD3-dodatnich i CD8-dodatnich zidentyfikowano komórki tetramerowo-dodatnie.

Dwa różne tetramery połączono w tej samej probówce w celu barwienia, co pozwoliło na jednoczesne ilościowe określenie dwóch różnych specyficzności CTL. Korzystając z tego protokołu, odpowiedzi limfocytów T tej samej myszy mogą być śledzone w czasie, ponieważ do każdego pomiaru potrzebne są tylko niewielkie ilości krwi. Dodatkowo można analizować fenotypy CTL specyficznych dla antygenu.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby unikać wydłużonego czasu inkubacji, ponieważ może to prowadzić do internalizacji receptorów komórek T. Od czasu odkrycia technologii tetramerów, barwienie tetramerów stało się podstawowym narzędziem do analizy limfocytów T i szerokiego zakresu zastosowań, które obejmują gromadzenie tetramerów. Świetlana przyszłość dla jasnych tetramerów.