System BW Reporter do badania oddziaływań receptor-ligand
7 stycznia 2019
Ten protokół opisuje, jak ustanowić system reporterowy, który może być używany do identyfikacji i ilościowego określania interakcji receptor-ligand.
Shalom.System BW Reporter umożliwia badanie oddziaływań receptor-ligand. Jest to niezwykle przydatne w przypadkach, gdy ligand określonego receptora jest nieznany lub w przypadkach, gdy eksperymenty z endogennym ligandem są technicznie trudne. Metoda ta jest czuła i specyficzna dla pojedynczego receptora, łatwa w obsłudze i powtarzalna.
Procedurę zademonstruje Shira Kahlon, adiunkt w moim laboratorium. Dzień przed transfekcją połóż na płytce 10 płytek z 10 mililitrami 100 000 komórek BW5147 i uzupełnij RPMI. Następnie umieść 100 mikrogramów plazmidu pcDNA3 w probówce.
Dodać octan sodu o pH 5,3 do probówki. Następnie dodaj 2,5 objętości 100% etanolu do mieszaniny plazmidów. Następnie inkubuj mieszaninę plazmidów przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
24 godziny po posianiu komórek BW zbierz komórki w dwóch 50-mililitrowych probówkach. Następnie odwirować komórki w stężeniu 515 g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić peleton RPMI bez dodatków i powtórzyć wirowanie.
Ponownie zawiesić powstały pellet w 1 mililitrze RPMI bez dodatków. Przenieś zawieszony pellet do 4-centymetrowej kołdry na lodzie. Odwirować plazmid, który został poddany wytrącaniu etanolu.
Następnie umyj plazmid jednym mililitrem 70% etanolu. I powtarzaj wirowanie przez kolejne 20 minut. Usuń cały etanol i pozwól granulkom częściowo wyschnąć.
Następnie ponownie zawiesić granulat w 100 mikrolitrach podgrzanego RPMI, bez dodatków. Następnie dodaj ponownie zawieszony plazmid do komórek w cuvet. Inkubować komórki na lodzie przez pięć minut.
Następnie należy elektroporować ogniwa. Następnie przenieś elektroporowane ogniwa do 50-mililitrowej rurki. Dodać 50 mililitrów kompletnej pożywki do probówki i wirować przez pięć minut, w temperaturze 515 g.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 mililitrach kompletnego podłoża. Następnie umieść komórki w 24-dołkowych szalkach hodowlanych i inkubuj komórki przez 48 godzin. Następnie dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża, uzupełniony 10 miligramami na mililitr G418 do każdej studzienki.
48 godzin później wyrzuć jeden mililitr górnej objętości każdej studzienki. Następnie dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki uzupełnionej pięcioma miligramami na mililitr G418 do każdej studzienki. Użyj 50 000 transfekowanych komórek BW z pożądanymi celami w jednym dołku na 96-dołkowej płytce.
Inkubować płytkę przez 48 godzin. Następnie zamroź talerz w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pokryj płytkę ELISA przeciwciałem anty-mysim IL-2.
Umieścić 05 mikrogramów anty-mysiej IL-2 w objętości 50 mikrolitrów PBS w każdym dołku. Inkubować pokrytą płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj krótkiego okresu inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby rozmrozić zamrożone komórki BW, które były wcześniej inkubowane ze swoimi celami.
Następnie odwirować płytkę i przenieść 100 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki do wstępnie pokrytej płytki ELISA. I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie dodaj biotynę anty-mysią IL-2 do płytki ELISA.
Następnie, po inkubacji i umyciu, dodać do płytki streptawidynę sprzężoną z HRP. Po inkubacji i przemyciu dodać 100 mikrolitrów roztworu substratu TMB do każdego dołka płytki ELISA. Na koniec odczytaj płytkę ELISA przy 650 nanometrach.
W tym przykładzie komórki PBL były wstępnie inkubowane z różnymi przeciwciałami anty-CD20. A następnie współinkubowane z transfekowanymi komórkami BW, które wyrażają receptory Fc CD16, przed analizą za pomocą testu ELISA. Po analizie za pomocą testu ELISA wyniki określono ilościowo.
Poziomy gęstości optycznej zostały przeliczone na stężenia IL-2 u myszy, w oparciu o krzywą standardową. W dodatkowym eksperymencie różne dawki przeciwciał anty-CD20 były wstępnie inkubowane z komórkami CLL. A następnie inkubowany z transfekowanymi komórkami BW.
Cząstka składa się z czterech głównych części. Klonowanie, transfekcja komórek BW, aktywacja i test ELISA. Każda z części powinna być weryfikowana niezależnie.
Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty z komórkami, które wyrażają endogenne receptory, takie jak zabijanie kwasów komórkami NK w celu zbadania interakcji z receptorami komórek NK. Wykorzystaliśmy ten system do odkrycia nowych ligandów receptorów komórek NK. Na przykład hemaglutynina jest ligandem NKp46, a PVL jest ligandem TG.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje system raportowy BW, będący czułą i specyficzną metodą badania oddziaływań receptor-ligand, szczególnie w sytuacjach, gdy ligand jest nieznany lub trudny do analizy. System wykorzystuje mysie komórki BW5147 przetransfekowane chimerycznym konstruktem receptora, co umożliwia ilościowe określenie aktywacji receptora poprzez pomiar sekrecji interleukiny-2 (IL-2) wykrywanej metodą ELISA. Takie podejście ułatwia analizę aktywacji receptora przez różne ligandy, w tym przeciwciała oraz cząsteczki powierzchniowe komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Wprowadzenie
- Oddziaływania receptor-ligand są fundamentalne dla wielu procesów biologicznych.
- Bezpośrednie eksperymenty z natywnymi receptorami i ligandami mogą być trudne ze względu na nieznane ligandy lub trudności techniczne.
- Systemy reporterowe mogą zapewnić czułe i specyficzne wykrywanie aktywacji receptorów.
- Do pomiaru poziomów aktywacji receptorów niezbędne są analizy ilościowe.
Cel badania
- Opracowanie i zademonstrowanie systemu reporterowego do wykrywania oddziaływań receptor-ligand.
- Umożliwienie kwantyfikacji aktywacji receptora nawet w przypadku, gdy ligand nie jest znany.
- Zapewnienie powtarzalnej i łatwej w obsłudze metody do badań receptorów.
Zastosowane metody
- Klonowanie domeny zewnątrzkomórkowej specyficznego receptora połączonej z mysim CD3ζ.
- Transfekcja mysich komórek BW5147 konstruktem chimerycznego receptora za pomocą elektroporacji.
- Selekcja transfekowanych komórek przy użyciu antybiotyku G418.
- Inkubacja transfekowanych komórek BW z komórkami docelowymi lub przeciwciałami.
- Pomiar wydzielanego mysiego IL-2 metodą ELISA jako wskaźnik aktywacji receptora.
Główne wyniki
- System reporterowy skutecznie wykrywa aktywację specyficznych receptorów przez różne ligandy.
- Ilościowy pomiar sekrecji IL-2 koreluje z poziomami aktywacji receptorów.
- System został wykorzystany do badania aktywacji ludzkich receptorów Fcγ przez przeciwciała anty-CD20 na komórkach CLL.
- Wyniki można zestandaryzować, przekształcając gęstość optyczną na stężenie IL-2 przy użyciu krzywych standardowych.
Wnioski
- System reporterowy BW jest niezawodnym narzędziem do analizy oddziaływań receptor-ligand.
- Znajduje on zastosowanie nawet w sytuacjach, gdy ligand jest nieznany lub trudny do wykorzystania eksperymentalnie.
- Metoda ta jest czuła, swoista i pozwala na ilościową analizę aktywacji receptora.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
System raportujący BW umożliwia czułą, ilościową analizę oddziaływań receptor-ligand, nawet w sytuacjach, gdy ligand jest nieznany lub trudny do analizy technicznej. Możliwość ta eliminuje krytyczne wąskie gardło w początkowej fazie odkrywania i walidacji celu, zapewniając odtwarzalną i skalowalną platformę do badań funkcjonalnej aktywacji receptorów. System wspiera redukcję ryzyka w całym portfolio i przyspiesza potwierdzenie mechanizmów działania w kluczowych punktach zwrotnych rozwoju leków biologicznych i przeciwciał.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną aktywacji receptora przez różnorodne ligandy, w tym nieznane.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolowanie zdarzeń aktywacji specyficznych dla receptora.
- Ułatwia szybką selekcję potencjalnych celów na podstawie ilościowych profili aktywacji.
- Zapewnia ustandaryzowany odczyt do weryfikacji hipotez dotyczących szlaków sygnałowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki oparte na metodzie ELISA dla późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Wspiera standaryzację testów i powtarzalność międzylaboratoryjną w badaniach nad receptorami i ligandami.
- Umożliwia skalowalną ocenę kandydatów na ligandy opartych na przeciwciałach lub komórkach.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do wiarygodnej oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane o aktywacji receptorów z terapiami przeciwciałami lub terapiami komórkowymi istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację funkcjonalnego zaangażowania receptorów.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów na leki biologiczne w oparciu o ilościowe progi aktywacji.
- Umożliwia opracowanie biomarkerów translacyjnych, gdy aktywacja receptorów jest kluczowym punktem końcowym.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ten system reporterowy sprawdza się na każdym etapie, od wczesnego odkrywania, przez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, stanowiąc platformę wielokrotnego użytku do funkcjonalnych badań interakcji receptor-ligand.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie aktywacji receptorów w odpowiedzi na ligandy kandydackie.
- Przesiewanie: Oferuje zestandaryzowane, ilościowe wyniki ELISA do porównywania skuteczności i swoistości ligandów.
- Analityka: Umożliwia przeliczenie gęstości optycznej na stężenie IL-2 w celu przeprowadzenia rzetelnej analizy statystycznej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z badaniami przedklinicznymi poprzez walidację funkcjonalnego zaangażowania celów terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia modularny, adaptowalny system dla różnorodnych badań nad receptorami i ligandami w ramach wielu programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne testy aktywacji receptorów.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu wczesnego przesiewu funkcjonalnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki biologiczne i przeciwciała.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w klonowaniu molekularnym i transfekcji komórek w celu generowania receptorów chimerycznych.
- Wymaga dostępu do aparatury do testów ELISA oraz infrastruktury analitycznej do uzyskiwania odczytów ilościowych.
- Wymaga standaryzacji warunków testowych i potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych typów receptorów i źródeł ligandów, w tym przeciwciał i cząsteczek powierzchni komórki.
- Uzyskanie wiarygodnych wyników jest zależne od niezależnej weryfikacji każdego elementu procedury.
