Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Ze względu na wysoką skuteczność, metoda ta może przyczynić się do dalszego rozwoju indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (IPSC) jako narzędzia do badania chorób ludzkich i opracowywania nowych terapii komórkami macierzystymi. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość generowania wysokiej jakości wolnych od integracji IPSC z pierwotnych ludzkich fibroblastów, w tym trudnych do przeprogramowania, związanych z chorobą, starzejących się i starzejących się fibroblastów. Powodzenie tej metody zależy od optymalnej skuteczności transfekcji RNA fibroblastów.

Dostosowanie pH buforu transfekcyjnego jest kluczową procedurą, aby to osiągnąć. Na początek przygotuj bufor do transfekcji, używając 500 mililitrów i 100 mililitrów wstępnie podgrzanych butelek o temperaturze pokojowej świeżej zredukowanej pożywki surowicy. Zmierz podstawowe pH pożywki w butelce o pojemności 500 mililitrów, wkładając szklaną elektrodę pH-metru do buforu i odczekaj do jednej minuty przed odczytaniem pH.

Aby dostosować pH, dodaj trzy do czterech mililitrów jednego molowego wodorotlenku sodu do 500-mililitrowej butelki. Zamknij butelkę i dobrze wymieszaj. Po odczekaniu pięciu minut otwórz butelkę i włóż elektrodę pH-metru do buforu.

Poczekaj, aż odczyt na pH-metrze ustabilizuje się. Kontynuuj dodawanie małych objętości jednego molowego wodorotlenku sodu, aż pH osiągnie 8,15 do 8,17, upewniając się, że pH-metr został kilkakrotnie skalibrowany podczas procesu. Użyj systemu filtracji próżniowej o wielkości 0,22 mikrometra, aby przefiltrować, wysterylizować bufor transfekcyjny.

Podzielić wysterylizowany bufor na pięć mililitrowych probówek z minimalną przestrzenią powietrzną. Sprawdź, czy fibroblasty, które mają zostać przeprogramowane, mają zbieżność od 40% do 60%. Przenieś cztery mililitry DPBS do 15-mililitrowej stożkowej probówki i dodaj 100 mikrolitrów rekombinowanej ludzkiej lamininy 521.

Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Dodaj jeden mililitr na studzienkę rozcieńczonej rekombinowanej ludzkiej lamininy 521 do trzech dołków sześciodołkowej płytki. Inkubuj tę powlekaną płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Podczas tej inkubacji ogrzej sześć mililitrów pożywki ekspansywującej fibroblasty i cztery mililitry pożywki galwanicznej do 37 stopni Celsjusza. Uzupełnić pożywkę galwaniczną zasadowym FGF o końcowym stężeniu 100 nanogramów na mililitr i B18R o końcowym stężeniu 200 nanogramów na mililitr. Ostrożnie odessaj zużytą pożywkę z fibroblastów, które mają zbieżność od 40% do 60%.

Przepłucz komórki pięcioma mililitrami DPBS. Dodaj trzy mililitry trypsyny EDTA i delikatnie kołysz płytką, aby pokryć komórki trypsyną EDTA. Odessać nadmiar płynu, pozostawiając około 500 mikrolitrów trypsyny, i inkubować fibroblasty przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po wyjęciu płytki z inkubatora należy mocno, ale ostrożnie postukać w bok płytki, aby usunąć komórki. Obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy zostały odłączone. Dodaj pięć mililitrów pożywki ekspansującej fibroblasty do oderwanych komórek, aby zneutralizować EDTA trypsyny.

Zbierz komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i dobrze je wymieszaj. Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie odpipetuj 12 000 komórek do czterech mililitrów wcześniej przygotowanego, wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego. Po wyjęciu powlekanej płytki z inkubatora, należy odessać rozcieńczoną lamininę 521 z dołków, upewniając się, że powierzchnia studzienek nie wysycha.

Delikatnie zawiesić ponownie komórki znajdujące się w podłożu galwanicznym i dodać jeden mililitr zawiesiny komórek do każdej powlekanej studzienki. Umieść posiane komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych z trzema gazami o niskim poziomie tlenu lub tlenu ustawionym na 5%, a następnie delikatnie, ale dokładnie rozproszyj komórki, naprzemiennie ruchem w górę, w dół, a następnie w lewo w prawo i powtórz ruchy jeszcze dwa razy, uważając, aby nie zawirować płytki. Inkubuj komórki przez noc.

W międzyczasie dodaj cztery mililitry pożywki do 15-mililitrowej stożkowej rurki i umieść ją w inkubatorze o niskim O dwa z poluzowaną nasadką, aby zrównoważyć przez noc. Co najmniej godzinę przed transfekcją wyjąć zrównoważoną pożywkę przeprogramowującą z inkubatora o niskiej zawartości O dwóch. Dodaj bFGF do końcowego stężenia 100 nanogramów na mililitr i B18R do końcowego stężenia 200 nanogramów na mililitr i dobrze wymieszaj.

Pracując pojedynczo, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć zużyte podłoże. I zastąp go jednym mililitrem medium do przeprogramowania, uzupełnionym o bFGF i B18R. Przenieść płytkę z komórkami z powrotem do inkubatora o niskiej zawartości tlenu.

Aby rozpocząć transfekcję fibroblastów, należy najpierw zrównoważyć podwielokrotność buforu do transfekcji przez około jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń pojedynczą 33-mikrolitrową porcję zmodyfikowanych mRNA i 14-mikrolitrową porcję naśladowców MIRNA z ujemnych 80 stopni Celsjusza i podgrzej je do temperatury pokojowej przez około trzy do pięciu minut, aż do rozmrożenia. Zakręć je krótko w mikrofuge.

Ogrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej przez około trzy do pięciu minut. Odwróć probówkę dwa do trzech razy, aby wymieszać odczynnik i krótko go odwirować w mikrofudze. Przenieś 279 mikrolitrów buforu transfekcyjnego o temperaturze pokojowej do probówki wirówkowej wolnej od RNA i dodaj 31 mikrolitrów odczynnika do transfekcji.

Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Dodać 132 mikrolitry buforu transfekcyjnego o temperaturze pokojowej do 33 mikrolitrowej porcji zmodyfikowanego MRNA i delikatnie odpipetować do wymieszania. Dodać 102,6 mikrolitra buforu transfekcyjnego o temperaturze pokojowej do 14 mikrolitrów podwielokrotności naśladowców MIRNA i delikatnie odpipetować do wymieszania.

Aby przygotować mieszaninę transfekcyjną zmodyfikowanego MRNA, dodać 165 mikrolitrów buforu transfekcyjnego o pojemności 310 mikrolitrów, mieszaninę odczynników do transfekcji do 165 mikrolitrów buforu transfekcyjnego, zmodyfikowaną mieszaninę MRNA. Odpipetować do mieszania. Aby przygotować mieszaninę transfekcyjną naśladowców MIRNA, dodaj 116,6 mikrolitrów 310 mikrolitrów buforu transfekcyjnego, mieszankę odczynników do transfekcji do 116,6 mikrolitra buforu transfekcyjnego, mieszankę mimiczną MIRNA.

Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić połączenie buforu transfekcji ze zmodyfikowanymi mRNA i mimikami MIRNA. Wyjąć płytkę z komórkami z inkubatora o niskiej zawartości tlenu. Kroplowo w każdym dołku dodać 100 mikrolitrów na studzienkę mieszanki transfekcyjnej zawierającej skompleksowane, zmodyfikowane MRNA.

Delikatnie, ale dokładnie porusz płytkę ruchem w górę, w dół, a następnie w lewo w prawo, aby rozproszyć kompleksy transfekcji. Dodaj 66,7 mikrolitrów na studzienkę mieszanki transfekcyjnej zawierającej skompleksowane naśladownictwo MIRNA kroplami w każdym dołku. Delikatnie, ale dokładnie porusz płytkę ruchem w górę, w dół, a następnie w lewo w prawo, aby rozproszyć kompleksy transfekcji.

Umieścić płytkę z transfekowanymi komórkami w inkubatorze trójgazowym o niskiej zawartości tlenu. Rozproszyć kompleksy transfekcyjne, delikatnie, ale dokładnie mieszając płytkę ruchem w górę, w dół, a następnie w lewo w prawo. Inkubować transfekowane komórki w inkubatorze przez 16 do 20 godzin przed zmianą pożywki następnego dnia.

Dodaj cztery mililitry pożywki przeprogramowującej do 15-mililitrowej stożkowej rurki i umieść ją w inkubatorze o niskim O dwa z poluzowaną nasadką, aby zrównoważyć przez noc. Następnego ranka należy zastąpić pożywkę zawierającą transfekcję świeżą, wstępnie zrównoważoną pożywką uzupełnioną bFGF i B18R i kontynuować schemat transfekcji opisany w protokole. Po udanym posiewie w studzience z sześciodołkową płytką w celu przeprogramowania, fibroblasty wydawały się bardzo rzadkie.

24 godziny po pierwszej udanej transfekcji fibroblasty straciły kształt wrzeciona i przyjęły bardziej zaokrągloną morfologię. Podczas pierwszych trzech transfekcji gęstość komórek stopniowo i konsekwentnie rosła, z widocznym wybuchem proliferacji, który nastąpił między siódmym a ósmym dniem. Do 10 dnia komórki wydawały się w dużej mierze zlewające się.

Pierwsze kolonie IPSC pojawiły się już w 11 dniu. Między 15 a 17 dniami kolonie IPSC stały się duże i oczywiste oraz wyraźnie różniły się od otaczających i całkowicie przeprogramowanych fibroblastów. Barwienie immunologiczne markera pluripotencji TRA-1-60 potwierdziło wysoką skuteczność przeprogramowywania.

Nieoptymalna gęstość posiewu jest najczęstszą przyczyną zmniejszonej wydajności przeprogramowania w tym protokole. Jeśli gęstość posiewu była zbyt niska, pojawiały się duże bezkomórkowe plamy barona i kolonie IPSC nie tworzyły się. Po przejściu rozcieńczania przeprogramowanych komórek, IPSC rosły jako pojedyncze kolonie i były łatwe do odróżnienia od fibroblastów.

Były luźno upakowane, a poszczególne komórki miały stosunkowo dużą powierzchnię cytoplazmatyczną. W ciągu czterech do siedmiu dni IPSC rozmnożyły się i utworzyły charakterystyczną, ciasno upakowaną kolonię o określonych krawędziach. Poszczególne komórki w kolonii wykazywały dużą frakcję jądrową z wydatnymi jąderkami.

Po przeprogramowaniu fibroblastów pacjenta, powstałe IPSC mogą zostać zróżnicowane w różne komórki somatyczne w celu wyjaśnienia mechanizmów wywołujących chorobę lub opracowania nowych terapii regeneracyjnych opartych na komórkach.