Name: Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Poznaj metodę przeprogramowania ludzkich fibroblastów w iPSC przy użyciu modyfikowanych mRNA i mikroRNA. Protokół zapewnia wysoką wydajność bez integracji wektorów i umożliwia generowanie komórek macierzystych do badań chorób oraz terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od National Institutes of Health (T32AR007411-33) oraz University of Colorado Skin Diseases Research Core Center (P30AR057212). Dziękujemy również Partnerstwu Badawczemu Epidermolysis Bullosa (EB), Fundacji Badań Medycznych EB, Cure EB Charity, Dystroficznemu Stowarzyszeniu Badawczemu Epidermolizy Pęcherzowego Oddzielania Serca (DEBRA) International, Funduszowi Vlinderkindje Fundacji Króla Baudouina oraz Funduszowi Gates Frontiers.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMO2-Associated+Clonal+T+Cell+Proliferation+in+Two+Patients+after+Gene+Therapy+for+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1.</a> Science. 302 (5644), 415-419 (2003).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li>
<li>Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-specific+microRNAs+promote+induced+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency.</a> Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Kogut, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA-based+reprogramming+of+human+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical+acceleration+of+nuclear+reprogramming+by+chromatin+remodeling+with+the+transactivation+domain+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD.</a> Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li>
<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis+of+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51943(2014).</li>
</ol>

I.K. i G.B. są współtwórcami zgłoszenia patentowego pt. "Metody i kompozycje do przeprogramowania komórek", nr zgłoszenia PCT. PCT/US2016/063258.

Protokół ten opisuje klinicznie istotną, nieintegrującą metodę opartą na RNA, która pozwala na przeprogramowanie normalnych i związanych z chorobą ludzkich linii fibroblastów w iPSC z bardzo wysoką wydajnością. Do tej pory każda ludzka linia fibroblastów, którą próbowaliśmy przeprogramować za pomocą opisanego protokołu, przyniosła zadowalającą liczbę wysokiej jakości iPSC do dalszych zastosowań. Powstałe w ten sposób iPSC mogą być natychmiast przenoszone i namnażane w warunkach hodowli bez karmienia.
Jakość fibroblastów do przeprogramowania:
Powodzenie przeprogramowania jest w dużym stopniu uzależnione od jakości początkowych fibroblastów. Idealnie byłoby, gdyby przeprogramowanie zostało zainicjowane przy użyciu fibroblastów o najniższym dostępnym pasażu, aby osiągnąć najwyższą wydajność. Skuteczność przeprogramowania jest najlepsza w przypadku fibroblastów pasażujących 2–4. Przeprogramowanie może nadal działać w przypadku fibroblastów o wysokim pasażu (pasaż 5-8), nawet starczych, choć ze zmniejszoną wydajnością. Czasami fibroblasty o niskim pasażu są niedostępne lub próbki pacjentów mają mutację genetyczną, która uniemożliwia zdrowy wzrost. W takim przypadku może być wymagana optymalizacja początkowej gęstości poszycia. Przeprogramowanie uszkodzonych linii fibroblastów jest zwykle związane ze zwiększoną śmiercią komórek podczas transfekcji RNA. W rezultacie, komórki w studni przeprogramowywania będą wydawać się rzadkie w ciągu 10-14 dni przeprogramowania. W studni widoczne będą również duże obszary bezkomórkowe. W takim przypadku protokół przeprogramowania będzie musiał zostać ponownie zainicjowany z wyższą początkową liczbą początkową fibroblastów. Posiewanie 3,000 komórek wejściowych na dołek naczynia o formacie 6-dołkowym działa konsekwentnie dla większości linii fibroblastów dla dorosłych. Jednak zwiększenie liczby posiewów do 5 000–10 000 (50 000 dla linii starczych) może pomóc w poprawie przeprogramowania próbek związanych z chorobą, jak opisano w naszej poprzedniej publikacji8. I odwrotnie, komórki, które zbyt wcześnie osiągają konfluencję, mogą być również odporne na przeprogramowanie. Jeśli komórki poddawane transfekcjom z przeprogramowaniem RNA proliferują zbyt szybko (jak to czasami ma miejsce w przypadku pierwotnych fibroblastów noworodków), zainicjuj przeprogramowanie za pomocą 500 fibroblastów na studzienkę 6-dołkowej płytkio formacie 8.
Postępowanie z buforem transfekcyjnym:
pH buforu transfekcyjnego (pożywka o obniżonej surowicy dostosowana do pH 8,2) ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia optymalnej wydajności transfekcji wymaganej dla tego protokołu przeprogramowania. Z tego powodu zaleca się podjęcie kilku środków ostrożności dotyczących obchodzenia się z buforem do transfekcji. Odkryliśmy, że nawet krótka ekspozycja buforu transfekcyjnego na powietrze atmosferyczne wpływa na pH buforu. Dlatego bufor transfekcyjny powinien być podzielony na porcje do pojemnika z zakrętką z minimalną przestrzenią powietrzną (używamy probówek stożkowych z nakrętką o pojemności 5 lub 15 ml). Aby jeszcze bardziej zminimalizować narażenie na działanie powietrza, należy użyć każdej podwielokrotności bufora transfekcyjnego na maksymalnie dwie transfekcje. Wreszcie, ponieważ temperatura wpływa na pH, bardzo ważne jest, aby bufor transfekcyjny był zrównoważony z RT w celu złożenia kompleksów transfekcyjnych. Zaleca się, aby nie podgrzewać buforu do transfekcji do temperatury 37 °C.
Pasażowanie iPSC:
Podczas gdy wiele wcześniej opublikowanych protokołów zaleca wybór pojedynczych kolonii iPSC pod koniec przeprogramowania, może to być trudne do osiągnięcia, gdy wydajność przeprogramowania jest bardzo wysoka lub jeśli kolonie grupują się razem, jak to często ma miejsce w naszym protokole. Dlatego, jeśli kolonie iPSC znajdują się w bliskiej odległości od siebie, zalecamy najpierw przejście komórek w celu rozprowadzenia przeprogramowanych iPSC przed ręcznym pobraniem kolonii. Wykonanie tego wczesnego kroku przejścia ma kilka zalet. Rozproszenie kolonii daje im więcej miejsca do wzrostu, dając znacznie większe kolonie do zbierania, niż można było osiągnąć w oryginalnej studni. To znacznie poprawia wskaźnik sukcesu w ustanowieniu linii iPSC z wybranego klonu. Odkryliśmy również, że dodatkowy czas hodowli z fibroblastami, choć w rozcieńczonym stosunku, wydaje się poprawiać średnią jakość pobranych kolonii iPSC. Nie w pełni przeprogramowane fibroblasty mogą dostarczać wspierających czynników parakrynnych, które nadal pomagają w tworzeniu iPSC i ułatwiają bezpośrednie przejście do warunków hodowli komórkowych bez karmienia. Fibroblasty mają na szczęście niekorzystny wzrost selektywny w porównaniu z iPSC, gdy są hodowane w mTeSR1. Dlatego zanieczyszczająca populacja komórek fibroblastów jest szybko rozcieńczana do znikomych ilości w ciągu 3-4 pasaży.
Inhibitory ROCK, takie jak Y-27632, są często stosowane do rutynowych hodowli ludzkich iPSC. Odkryliśmy, że częste i/lub przedłużone hodowle niektórych linii iPSC z Y-27632 mogą mieć szkodliwy wpływ na ogólną jakość. W przypadku stosowania metody pasażowania brył, takiej jak EDTA, Y-27632 nie jest konieczny do utrzymania żywotności iPSC po rozszczepieniu. Całkowicie wyeliminowaliśmy uzupełnianie pożywek Y-27632 dla wszystkich izolacji, ekspansji lub rutynowych hodowli iPSC.
Ograniczenia protokołu:
Jednym z ograniczeń opisanego podejścia do przeprogramowania opartego na RNA jest początkowy koszt i złożoność związana z przygotowaniem odczynników do przeprogramowywania. Chociaż procedury przygotowawcze do generowania odczynników mRNA są rutynowe i zostały już wcześniej opisane (PCR, transkrypcja in vitro , leczenie DNazą, capping, defosforylacja, oczyszczanie), łącznie produkcja odczynników mRNA jest stosunkowo długim i nietrywialnym procesem. Innym poważnym wyzwaniem dla tego protokołu jest konieczność transfekcji komórek co 48 godzin, co zwiększa pracochłonność protokołu przeprogramowywania. Względy te mogą być zaporowe, jeśli pożądane jest przeprogramowanie tylko kilku próbek pacjentów. Jeśli jednak głównym czynnikiem branym pod uwagę jest generowanie klinicznie istotnych iPSC lub osiągnięcie bardzo wysokiej wydajności przeprogramowywania, opisane podejście do przeprogramowania oparte na RNA jest idealne.
Podsumowując, opisana metoda przeprogramowania opartego na RNA o wysokiej wydajności opiera się na zoptymalizowanej wydajności transfekcji typu komórki somatycznej, która ma zostać przeprogramowana, jak opisano w naszej poprzedniej publikacji8. Protokół transfekcji RNA przedstawiony w tym badaniu jest wysoce dostosowany do ludzkich pierwotnych fibroblastów, ale potencjalnie może być dostosowany do innych typów komórek w celu poprawy wydajności przeprogramowania różnych komórek somatycznych.

Przeprogramowanie komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) wymaga rozszerzonej ekspresji podstawowego zestawu czynników transkrypcyjnych, które są ważne dla utrzymania pluripotencji1,2. Podczas wytwarzania iPSC do zastosowań klinicznych ważne jest, aby obciążenie mutacyjne w komórkach wejściowych zostało zminimalizowane podczas przetwarzania, a wydajność wytwarzania iPSC była utrzymywana na stosunkowo wysokim poziomie we wszystkich próbkach pacjentów. Jednak większość metod przeprogramowywania, w tym protokoły bez integracji, cierpi z powodu bardzo niskiej wydajności przeprogramowywania, co ogranicza kliniczną użyteczność tych podejść3. Niska wydajność przeprogramowania może również sprzyjać selektywnemu przeprogramowywaniu komórek zawierających wcześniej istniejące mutacje, zwiększając obciążenie mutacyjne w powstałych iPSC. Ponadto wszystkie metody przeprogramowania oparte na DNA, takie jak podejścia oparte na lentiwirusie i episomalnych, cierpią z powodu obaw dotyczących bezpieczeństwa, że DNA może losowo zintegrować się z genomem i stworzyć okazję do szkodliwej mutagenezy insercyjnej i niepożądanej (potencjalnie onkogennej) ekspresji genów pluripotencji w dalszych pochodnych tkankowych4.
Obiecującym podejściem do osiągnięcia efektywnej indukcji pluripotencji w komórkach somatycznych i zmniejszenia obciążenia mutacjami w powstałych iPSC jest użycie syntetycznych RNA przekaźnikowych zawierających zmodyfikowane zasady nukleotydowe (zmodyfikowane mRNA) do przeprogramowania5. Skuteczność zmodyfikowanych podejść do przeprogramowania opartych na mRNA można dodatkowo zwiększyć poprzez dodanie mikroRNA (miRNA) specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ESC)-367/302s3, które, jak wykazano, przeprogramowują komórki somatyczne ze zwiększoną wydajnością6,7. Jednak nawet po dodaniu miRNAs-367/302, zmodyfikowane podejście do przeprogramowania oparte na mRNA często zawodzi podczas aplikacji do świeżo wyizolowanych komórek pacjenta3. Aby rozwiązać niespójności tego zmodyfikowanego podejścia opartego na mRNA, niedawno opisaliśmy zoptymalizowaną, wolną od integracji strategię, która indukuje pluripotencję w ludzkich pierwotnych fibroblastach z wysokim wskaźnikiem sukcesu i wykorzystuje zarówno zmodyfikowane mRNA kodujące czynniki przeprogramowujące, jak i dojrzałe mimiki miRNA-367/3028. W naszej metodzie zmodyfikowany koktajl mRNA reprogramowania obejmuje zmodyfikowaną wersję OCT4 połączoną z domeną transaktywacji MyoD (zwaną M3O) 9 i pięcioma innymi czynnikami przeprogramowania (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A i NANOG). Połączenie zmodyfikowanego mRNA kodującego czynniki pluripotencji z mimikami miRNA wydaje się mieć synergiczny wpływ na wydajność przeprogramowania w tym protokole. Dodatkowe optymalizacje schematu transfekcji RNA, wysiewu komórek i warunków hodowli były również konieczne, aby zwiększyć efektywność przeprogramowania podejścia do ultra-wysokiego poziomu8.
W przeciwieństwie do wielu innych protokołów, nasze podejście do przeprogramowania zazwyczaj wymaga tylko kilku tysięcy fibroblastów wejściowych. Ponadto wiele powszechnych strategii nieintegrujących wykorzystujących plazmidy episomalne, wirusa Sendai lub samoreplikujące się RNA obejmuje rozległe pasażowanie w celu rozcieńczenia wektora przeprogramowania w wygenerowanych iPSC. I odwrotnie, zmodyfikowane mRNA i dojrzałe mimiki miRNA mają krótki okres półtrwania i są szybko eliminowane z komórek. Podsumowując, łączny czas hodowli komórkowej między pobraniem próbek od pacjenta a wytworzeniem użytecznych iPSC jest w tym podejściu minimalny, co skutecznie ogranicza akumulację mutacji w powstałych iPSC i poprawia opłacalność.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół krok po kroku, który pozwala osiągnąć wysoką skuteczność przeprogramowania dorosłych ludzkich fibroblastów na iPSC przy użyciu naszego kombinatorycznego zmodyfikowanego podejścia opartego na mRNA/miRNA8. Ten protokół przeprogramowania oparty na RNA zapewnia prostą, opłacalną i solidną metodę generowania niewymagających integracji iPSC do badań i potencjalnych zastosowań klinicznych. Ponadto ma zastosowanie do przeprogramowywania różnych linii fibroblastów, w tym trudnych do przeprogramowania, związanych z chorobą, starzejących się i starzejących się fibroblastów. Schemat protokołu przeprogramowania ludzkich fibroblastów pokazano na rysunku 1. Protokół szczegółowo opisuje metodę przeprogramowania trzech dołków dorosłych dorosłych fibroblastów pierwotnych na płytce o formacie 6-dołkowym. Dwie studzienki zazwyczaj dają wystarczającą liczbę wysokiej jakości kolonii iPSC. W wielu przypadkach potrzebna jest tylko jedna studnia, a trzecia studnia może być wykorzystana do analizy wydajności przeprogramowania. W razie potrzeby liczbę odwiertów można zwiększyć.

<table><tbody><tr><td>Plasmid templates for PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_KLF4</td><td>Addgene</td><td>26815</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_SOX2</td><td>Addgene</td><td>26817</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_c-MYC</td><td>Addgene</td><td>26818</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_LIN28A</td><td>Addgene</td><td>26819</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_hM3O</td><td>Addgene</td><td>112638</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_hNANOG</td><td>Addgene</td><td>112639</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_mWasabi</td><td>Addgene</td><td>112640</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana transkrypcja mRNA in vitro i mimimika miRNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Podkład (zamawiany jako ultramer, skala 4nmol)</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA(</td><td></td></tr><tr><td>ARCA Cap) 3&acute;-0-Me-m7G(5')ppp(5')G&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600850-51</td><td></td></tr><tr><td>5-metylocytydyno-5'-trifosforan</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza antarktyczna</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Zestaw</td> <td>do transkrypcjiThermoFisher Scientific</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Pseudourydyno-5'-trifosforan</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy Riboguard</td><td>Lucigen</td><td>RG90910K</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Koncentrator</td><td>ZymoResearch</td><td>R1019</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000684</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000715</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000717</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000718</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-367-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000719</td><td></td></tr><tr><td>Woda (bez nukleaz, nie traktowana DEPC)</td><td>Fisher</td><td>AM9937</td><td>Służy do rozcieńczania zmodyfikowanych mRNA i miRNA naśladuje</td></tr> <tr><td>Hodowla i przeprogramowanie fibroblastów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,1% Żelatyna w technologiach H2O</td><td>StemCell technologies</td><td>#07903</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GV Sterylny system filtracji próżniowej</td><td>EMD Millipore SCGVU05RE</td><td></td><td>Służy do sterylizacji buforu transfekcyjnego i 0,5 mM EDTA w DPBS</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki (poddane działaniu kultur tkankowych)</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Bydło płodowe Serum</td><td>Fisher</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>FGF Basic</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>phg0263</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Suplement glutaminy stosowany do przygotowania pożywek</td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie FBS</td><td>Gibco Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum KnockOut</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine RNAiMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778500</td><td>Protokół jest zoptymalizowany pod kątem odczynnika do transfekcji Lipofectamine RNAiMax</td></tr><tr><td>MEM ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medium o zredukowanej surowicy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Pożywkę o obniżonej surowicy, użyj do wytworzenia buforu transfekcyjnego, dostosowując pH do 8,2, 500 ml</td></tr><tr><td>Pożywki o obniżonej surowicy Opti-MEM I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Pożywki o obniżonej surowicy, użyj do przygotowania buforu transfekcyjnego poprzez dostosowanie pH do 8,2, 100 ml</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Przygotuj 1 M roztwór, rozcieńczając w wodzie wolnej od nukleaz i użyj do regulacji pH</td></tr><tr><td>Woda (bez nukleaz, nie poddawana działaniu DEPC)</td><td>Fisher</td><td>AM9932&nbsp;</td><td>Służy do rozcieńczania NaOH i mycia pH-metru</td></tr><tr><td>Pióro/Paciorkowiec/Grzybobój</td><td>GE Healthcare</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A29248</td><td>Dostarczany w stężeniu 100 &mikro; g/ml, użyj jako matrycy do procedury przeprogramowania</td></tr><tr><td>Sulbecco's phosphate-buffered sol (DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25% Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>2520056</td><td></td></tr><tr><td>Wirus krowianki B18R (CF)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34-8185-86</td><td></td></tr><tr><td> kultura iPSC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matryca z kwalifikacją hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) do hodowli iPSC</td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M roztwór podstawowy</td><td>K& D Medyczny&nbsp;</td><td>RGF-3130</td><td>Rozcieńczyć do 0,5 mM w DPBS, filtrować sterylizować i stosować do pasażowania iPSC</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>Pożywka z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), zapewnia przewagę wzrostu iPSC nad fibroblastami</td></tr><tr><td><silnymi>przeciwciałami i wykrywaniem</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królik anty mysz (sprzężony z HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td></td></tr><tr><td>Tra-1-60 (mysz anty człowiek)</td><td>Stemgent</td><td>09-0010</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (30%)</td><td>LabChem</td><td>LC154301</td><td>Rozcieńczyć do 3% albuminą</td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej PBS (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>Salin buforowany fosforanem (PBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.02</td><td>Dostarczany jako 10x, rozcieńczony do 1x</td></tr><tr><td>VECTOR Zestaw substratów peroksydazy NovaRED</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td></td></tr><tr><td>Special Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opis</td><td></td><td></td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td><td></td> bezpieczeństwa biologicznego</tr><tr><td>Regularny inkubator</td><td></td><td></td> do hodowli tkankowych z nawilżaną <td>wilgotnością Kalibruj CO2 za pomocą miernika cyfrowego, fyrytu lub odpowiednika. Wyrównać inkubator do 5% CO2, 37 stopni C.</td></tr><tr><td>Trójgazowy nawilżany inkubator</td><td></td><td></td> do hodowli tkankowych <td>Skalibruj CO2 za pomocą miernika cyfrowego, fyrytu lub odpowiednika. Wyrównać inkubator do 5% CO2, 5% O2, 37 &deg;C. Stosować do procedury przeprogramowywania.</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td>Musi mieć rozdzielczość do dwóch miejsc po przecinku. Jeśli to możliwe, wyznacz do pracy z RNA.</td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td>odwrócony</td><td>Mikroskop skonfigurowany do wizualizacji EGFP w celu monitorowania wydajności transfekcji.</td></tr></tbody></table>

oparte na rna przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) okazały się cennym narzędziem do badania rozwoju i chorób człowieka. Dalszy rozwój iPSC jako terapii regeneracyjnej wymaga bezpiecznego, solidnego i celowego protokołu przeprogramowania. W tym miejscu przedstawiamy klinicznie istotny protokół krok po kroku do niezwykle skutecznego przeprogramowania ludzkich fibroblastów skóry na iPSC przy użyciu podejścia nieintegrującego. Rdzeń protokołu składa się z ekspresji czynników pluripotencji (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, fuzja OCT4-MyoD) z transkrybowanych in vitro informacyjnych RNA syntetyzowanych ze zmodyfikowanymi nukleotydami (zmodyfikowanymi mRNA). Przeprogramowane zmodyfikowane mRNA są transfekowane do pierwotnych fibroblastów co 48 godzin wraz z dojrzałymi embrionalnymi mikroRNA-367/302 specyficznymi dla embrionalnych komórek macierzystych przez dwa tygodnie. Powstałe w ten sposób kolonie iPSC można następnie wyizolować i bezpośrednio rozprowadzać w warunkach wolnych od karmienia. Aby zmaksymalizować wydajność i spójność naszego protokołu przeprogramowania próbek fibroblastów, zoptymalizowaliśmy różne parametry, w tym schemat transfekcji RNA, czas transfekcji, warunki hodowli i gęstość wysiewu. Co ważne, nasza metoda pozwala na uzyskanie wysokiej jakości iPSC z większości źródeł fibroblastów, w tym trudnych do przeprogramowania próbek chorych, starszych i/lub starczych.

Zazwyczaj mija około 5–6 tygodni od rozpoczęcia reprogramowania fibroblastów do zamrożenia pierwszych fiolek iPSC (Rysunek 1). Protokół reprogramowania można ogólnie podzielić na dwie fazy. Faza 1 obejmuje hodowlę fibroblastów oraz siedem transfekcji, przy czym koktajl RNA do reprogramowania podaje się co 48 h. Faza 2 obejmuje izolację, ekspansję i charakterystykę kolonii iPSC.
Przed rozpoczęciem protokołu należy upewnić się, że fibroblasty przeznaczone do przeprogramowania są dobrej jakości. Zdrowe fibroblasty powinny mieć kształt wrzecionowaty, być bipolarne i refrakcyjne, a ich czas podwojenia powinien wynosić około 24 h. Do dnia 0 250 000 komórek wysianych w dniu -2 do szalki 10 cm powinny osiągnąć 40–60% konfluencji (Rycina 1, dzień 0) i dać około 6–10 x 105 komórek. W przypadku komórek proliferujących wolniej można zastosować rekompensację poprzez wysianie ich z większą gęstością w dniu -2 oraz w dniu 0 przed przeprogramowaniem.
Fibroblasty po wysianiu do dołka płytki 6-dołkowej w celu reprogramowania powinny być bardzo rzadkie (Rycina 2, dzień 1). Dwadzieścia cztery godziny po pierwszej transfekcji fibroblasty utracą swój wrzecionowaty kształt i przyjmą bardziej zaokrągloną morfologię (Rycina 2, dzień 2), która zostanie utrzymana przez pozostały czas reprogramowania. Zielona fluorescencja z mRNA mWasabi powinna być minimalnie zauważalna w dniu 2. i stopniowo zwiększać swoją jasność, stając się wyraźnie widoczną do dnia 4. Możliwość wykrycia fluorescencji mWasabi może zależeć od czułości mikroskopu i konfiguracji sprzętu. Gęstość komórek będzie stopniowo i konsekwentnie wzrastać podczas pierwszych trzech transfekcji (dni 1–6), z wyraźnym gwałtownym wzrostem proliferacji między dniem 7. a 8. Komórki powinny być w znacznym stopniu konfluentne do 10. dnia (Rycina 2, dzień 10). Pierwsze kolonie iPSC mogą pojawić się już w dniu 11. (Rycina 2, dzień 11); jednak kolonie mogą nie być zauważalne aż do 18. dnia. Zazwyczaj między 15. a 18. dniem pojawią się duże i wyraźne kolonie iPSC, które są wyraźnie odróżnialne od otaczających je, niepełnie reprogramowanych fibroblastów (Rycina 2, dzień 15 oraz Rycina 3, dzień 17). W celu oceny wydajności reprogramowania można przeprowadzić immunobarwienie na marker pluripotencji TRA-1-60 (Rycina 3, dzień 17, TRA-1-60). W naszym doświadczeniu większość linii fibroblastów daje setki kolonii na reprogramowany dołek (Rycina 3, wstawka B).
Nieoptymalna gęstość wysiewu jest najczęstszą przyczyną obniżonej wydajności reprogramowania w naszym protokole i często wiąże się z fibroblastami, które są chorobowe, senescencyjne i/lub pochodzą z wysokich pasaży. Jeśli gęstość wysiewu jest zbyt niska, pod koniec reprogramowania wystąpią duże acelularne, puste obszary (Rycina 4C), a kolonie iPSC mogą nie powstać (Rycina 4D). Przeprogramowane komórki powinny być bardzo konfluentne do 14. dnia (porównaj Rycina 4A i 4B z Rycina 2, dzień 14). Podobnie, jeśli komórki zostaną wysiane zbyt gęsto lub będą namnażać się zbyt szybko, wydajność reprogramowania drastycznie spada.
Aby zachować homogeniczność iPSC pochodzących od pacjentów, ważne jest namnażanie linii komórkowych z pojedynczej kolonii. Ponieważ wydajność reprogramowania w naszym protokole jest bardzo wysoka, sąsiednie kolonie iPSC mogą formować się w bliskim sąsiedztwie i wrastać w siebie (Rycina 3, dni 15–17). Utrudnia to czasem mechaniczne oddzielenie pojedynczej kolonii w celu ekspansji klonalnej. Stwierdziliśmy, że pomocne jest najpierw pasażowanie przeprogramowanej studni i rozcieńczenie zawiesiny na większej powierzchni hodowli. Dobrym stosunkiem pasażowania jest równomierne rozdzielenie zawartości jednej studni z płytki 6-dołkowej na całą płytkę 6-dołkową.
Po pasażu z rozcieńczeniem iPSC rosną w postaci kolonii, które są łatwo odróżnialne od fibroblastów (Rycina 5, dzień 18). Początkowo kolonie iPSC mogą być luźno upakowane, a poszczególne komórki mają stosunkowo duży obszar cytoplazmy. W ciągu 4–7 dni iPSC proliferują i tworzą charakterystyczne, gęsto upakowane kolonie o wyraźnych krawędziach. Poszczególne komórki wewnątrz kolonii mają dużą frakcję jądrową z wyraźnymi jąderkami (Rycina 5, dzień 22). W każdym dołku powinno powstać wiele kolonii, a do dalszej ekspansji należy wybierać wyłącznie te o klasycznej morfologii iPSC.
<img alt="Harmonogram reprogramowania fibroblastów; schemat procesu hodowli iPSC; fazy ekspansji komórek macierzystych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprogramowanie ludzkich fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs). Przedstawiono schematyczny protokół reprogramowania ludzkich fibroblastów. Fibroblasty są najpierw pasażowane przy niskiej gęstości do dołka płytki 6-dołkowej, po czym wykonuje się siedem transfekcji w odstępach 48 h. Po każdej transfekcji, po upływie 16–20 h, następuje wymiana pożywki. Reprogramowane iPSCs są pasażowane po raz pierwszy około 18 dnia, a klonalne kolonie są pobierane do 26 dnia. Zazwyczaj linie iPSC pochodzące z fibroblastów mogą zostać zamrożone do długoterminowego przechowywania do 38 dnia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost hodowli komórkowej, oś czasu; zmiany morfologiczne; obrazy mikroskopowe; codzienna progresja, różnicowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy codzienne z każdego dnia reprogramowania. Fibroblasty powinny osiągnąć konfluencję na poziomie około 40–60% w momencie pasażowania w celu rozpoczęcia reprogramowania (dzień 0, komórki wysiewane są do szalki 10 cm). Pierwsza transfekcja (T1) odbywa się w dniu 1., a w tym momencie komórki powinny być rozmieszczone bardzo rzadko. Następnego dnia (dzień 2) powinna stać się widoczna bardziej zaokrąglona morfologia. Gęstość komórek będzie nadal wzrastać w trakcie całego protokołu, a skupiska iPSC zaczną pojawiać się już w dniu 11 (obwiedzione czerwonym okręgiem). Do 15. dnia kolonie iPSC będą duże i posiadać wyraźne granice. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces różnicowania komórek na obrazach mikroskopowych w dniach 15-17; wyniki barwienia TRA-1-60." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Tworzenie kolonii po transfekcjach zmodyfikowanymi mRNA reprogramującymi i mimetykami miRNA. Zdjęcia przy małym powiększeniu reprezentatywnego procesu reprogramowania wykonano w dniach 15–17. Po ostatniej transfekcji reprogramowane iPSC tworzą wyraźne kolonie o zdefiniowanych granicach, które zwiększają swój rozmiar i zagęszczają się, stając się wyraźnie odróżnialnymi od otaczających je niepełnie reprogramowanych fibroblastów. Immunobarwienie markerem pluripotencji TRA-1-60 wskazuje na obecność iPSC (wstawka A) i może być wykorzystane do obliczenia wydajności reprogramowania poprzez zliczenie wszystkich kolonii w jednej studzience (wstawka B, przykłady kolonii możliwych do policzenia zakreślone na zielono). Pasek skali = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces różnicowania komórek; obrazy mikroskopowe, analiza z 14. i 17. dnia, wynik barwienia TRA-1-60." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy suboptymalnej gęstości wysiewu dla reprogramowania. (A, B) Przykłady fibroblastów o zbyt niskiej gęstości w 14. dniu reprogramowania (por. Rycina 2, dzień 14). (C) Obraz przy niskim powiększeniu w 17. dniu reprogramowania z zaznaczonym na czerwono dużym, pustym obszarem. (D) Ten sam otwór płytki został utrwalony i zabarwiony pod kątem TRA-1-60, aby potwierdzić ogólnie niską wydajność reprogramowania wynikającą z niskiej gęstości komórek. Paski skali = 200 µm (A, B) oraz 1 mm (C, D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Postęp wzrostu komórek; obrazy mikroskopowe z dni 18-22; badanie różnicowania komórek; zawiera pasek skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy iPSC po pierwszym pasażowaniu. Po zakończeniu transfekcji zmodyfikowanymi mRNA reprogramującymi i mimetykami miRNA, przeprogramowane komórki poddaje się pasażowaniu między 17. a 20. dniem. iPSC wykazują przewagę wzrostu w pożywce dla PSC i szybko wypierają fibroblasty, które zostały niepełnie przeprogramowane. Początkowo iPSC tworzą kolonie, które mogą wydawać się luźne i mieć słabo zdefiniowane brzegi. W ciągu kilku dni komórki gwałtownie proliferują i przyjmują charakterystyczną morfologię gęsto upakowanych komórek o wysokim stosunku jądra do cytoplazmy, tworząc zwarte kolonie o wyraźnych granicach. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Ze względu na wysoką skuteczność, metoda ta może przyczynić się do dalszego rozwoju indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (IPSC) jako narzędzia do badania chorób ludzkich i opracowywania nowych terapii komórkami macierzystymi. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość generowania wysokiej jakości wolnych od integracji IPSC z pierwotnych ludzkich fibroblastów, w tym trudnych do przeprogramowania, związanych z chorobą, starzejących się i starzejących się fibroblastów. Powodzenie tej metody zależy od optymalnej skuteczności transfekcji RNA fibroblastów.Dostosowanie pH buforu transfekcyjnego jest kluczową procedurą, aby to osiągnąć. Na początek przygotuj bufor do transfekcji, używając 500 mililitrów i 100 mililitrów wstępnie podgrzanych butelek o temperaturze pokojowej świeżej zredukowanej pożywki surowicy. Zmierz podstawowe pH pożywki w butelce o pojemności 500 mililitrów, wkładając szklaną elektrodę pH-metru do buforu i odczekaj do jednej minuty przed odczytaniem pH.Aby dostosować pH, dodaj trzy do czterech mililitrów jednego molowego wodorotlenku sodu do 500-mililitrowej butelki. Zamknij butelkę i dobrze wymieszaj. Po odczekaniu pięciu minut otwórz butelkę i włóż elektrodę pH-metru do buforu.Poczekaj, aż odczyt na pH-metrze ustabilizuje się. Kontynuuj dodawanie małych objętości jednego molowego wodorotlenku sodu, aż pH osiągnie 8,15 do 8,17, upewniając się, że pH-metr został kilkakrotnie skalibrowany podczas procesu. Użyj systemu filtracji próżniowej o wielkości 0,22 mikrometra, aby przefiltrować, wysterylizować bufor transfekcyjny.Podzielić wysterylizowany bufor na pięć mililitrowych probówek z minimalną przestrzenią powietrzną. Sprawdź, czy fibroblasty, które mają zostać przeprogramowane, mają zbieżność od 40% do 60%. Przenieś cztery mililitry DPBS do 15-mililitrowej stożkowej probówki i dodaj 100 mikrolitrów rekombinowanej ludzkiej lamininy 521.Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Dodaj jeden mililitr na studzienkę rozcieńczonej rekombinowanej ludzkiej lamininy 521 do trzech dołków sześciodołkowej płytki. Inkubuj tę powlekaną płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Podczas tej inkubacji ogrzej sześć mililitrów pożywki ekspansywującej fibroblasty i cztery mililitry pożywki galwanicznej do 37 stopni Celsjusza. Uzupełnić pożywkę galwaniczną zasadowym FGF o końcowym stężeniu 100 nanogramów na mililitr i B18R o końcowym stężeniu 200 nanogramów na mililitr. Ostrożnie odessaj zużytą pożywkę z fibroblastów, które mają zbieżność od 40% do 60%.Przepłucz komórki pięcioma mililitrami DPBS. Dodaj trzy mililitry trypsyny EDTA i delikatnie kołysz płytką, aby pokryć komórki trypsyną EDTA. Odessać nadmiar płynu, pozostawiając około 500 mikrolitrów trypsyny, i inkubować fibroblasty przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po wyjęciu płytki z inkubatora należy mocno, ale ostrożnie postukać w bok płytki, aby usunąć komórki. Obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy zostały odłączone. Dodaj pięć mililitrów pożywki ekspansującej fibroblasty do oderwanych komórek, aby zneutralizować EDTA trypsyny.Zbierz komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i dobrze je wymieszaj. Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie odpipetuj 12 000 komórek do czterech mililitrów wcześniej przygotowanego, wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego. Po wyjęciu powlekanej płytki z inkubatora, należy odessać rozcieńczoną lamininę 521 z dołków, upewniając się, że powierzchnia studzienek nie wysycha.Delikatnie zawiesić ponownie komórki znajdujące się w podłożu galwanicznym i dodać jeden mililitr zawiesiny komórek do każdej powlekanej studzienki. Umieść posiane komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych z trzema gazami o niskim poziomie tlenu lub tlenu ustawionym na 5%, a następnie delikatnie, ale dokładnie rozproszyj komórki, naprzemiennie ruchem w górę, w dół, a następnie w lewo w prawo i powtórz ruchy jeszcze dwa razy, uważając, aby nie zawirować płytki. Inkubuj komórki przez noc.W międzyczasie dodaj cztery mililitry pożywki do 15-mililitrowej stożkowej rurki i umieść ją w inkubatorze o niskim O dwa z poluzowaną nasadką, aby zrównoważyć przez noc. Co najmniej godzinę przed transfekcją wyjąć zrównoważoną pożywkę przeprogramowującą z inkubatora o niskiej zawartości O dwóch. Dodaj bFGF do końcowego stężenia 100 nanogramów na mililitr i B18R do końcowego stężenia 200 nanogramów na mililitr i dobrze wymieszaj.Pracując pojedynczo, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć zużyte podłoże. I zastąp go jednym mililitrem medium do przeprogramowania, uzupełnionym o bFGF i B18R. Przenieść płytkę z komórkami z powrotem do inkubatora o niskiej zawartości tlenu.Aby rozpocząć transfekcję fibroblastów, należy najpierw zrównoważyć podwielokrotność buforu do transfekcji przez około jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń pojedynczą 33-mikrolitrową porcję zmodyfikowanych mRNA i 14-mikrolitrową porcję naśladowców MIRNA z ujemnych 80 stopni Celsjusza i podgrzej je do temperatury pokojowej przez około trzy do pięciu minut, aż do rozmrożenia. Zakręć je krótko w mikrofuge.Ogrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej przez około trzy do pięciu minut. Odwróć probówkę dwa do trzech razy, aby wymieszać odczynnik i krótko go odwirować w mikrofudze. Przenieś 279 mikrolitrów buforu transfekcyjnego o temperaturze pokojowej do probówki wirówkowej wolnej od RNA i dodaj 31 mikrolitrów odczynnika do transfekcji.Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Dodać 132 mikrolitry buforu transfekcyjnego o temperaturze pokojowej do 33 mikrolitrowej porcji zmodyfikowanego MRNA i delikatnie odpipetować do wymieszania. Dodać 102,6 mikrolitra buforu transfekcyjnego o temperaturze pokojowej do 14 mikrolitrów podwielokrotności naśladowców MIRNA i delikatnie odpipetować do wymieszania.Aby przygotować mieszaninę transfekcyjną zmodyfikowanego MRNA, dodać 165 mikrolitrów buforu transfekcyjnego o pojemności 310 mikrolitrów, mieszaninę odczynników do transfekcji do 165 mikrolitrów buforu transfekcyjnego, zmodyfikowaną mieszaninę MRNA. Odpipetować do mieszania. Aby przygotować mieszaninę transfekcyjną naśladowców MIRNA, dodaj 116,6 mikrolitrów 310 mikrolitrów buforu transfekcyjnego, mieszankę odczynników do transfekcji do 116,6 mikrolitra buforu transfekcyjnego, mieszankę mimiczną MIRNA.Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić połączenie buforu transfekcji ze zmodyfikowanymi mRNA i mimikami MIRNA. Wyjąć płytkę z komórkami z inkubatora o niskiej zawartości tlenu. Kroplowo w każdym dołku dodać 100 mikrolitrów na studzienkę mieszanki transfekcyjnej zawierającej skompleksowane, zmodyfikowane MRNA.Delikatnie, ale dokładnie porusz płytkę ruchem w górę, w dół, a następnie w lewo w prawo, aby rozproszyć kompleksy transfekcji. Dodaj 66,7 mikrolitrów na studzienkę mieszanki transfekcyjnej zawierającej skompleksowane naśladownictwo MIRNA kroplami w każdym dołku. Delikatnie, ale dokładnie porusz płytkę ruchem w górę, w dół, a następnie w lewo w prawo, aby rozproszyć kompleksy transfekcji.Umieścić płytkę z transfekowanymi komórkami w inkubatorze trójgazowym o niskiej zawartości tlenu. Rozproszyć kompleksy transfekcyjne, delikatnie, ale dokładnie mieszając płytkę ruchem w górę, w dół, a następnie w lewo w prawo. Inkubować transfekowane komórki w inkubatorze przez 16 do 20 godzin przed zmianą pożywki następnego dnia.Dodaj cztery mililitry pożywki przeprogramowującej do 15-mililitrowej stożkowej rurki i umieść ją w inkubatorze o niskim O dwa z poluzowaną nasadką, aby zrównoważyć przez noc. Następnego ranka należy zastąpić pożywkę zawierającą transfekcję świeżą, wstępnie zrównoważoną pożywką uzupełnioną bFGF i B18R i kontynuować schemat transfekcji opisany w protokole. Po udanym posiewie w studzience z sześciodołkową płytką w celu przeprogramowania, fibroblasty wydawały się bardzo rzadkie.24 godziny po pierwszej udanej transfekcji fibroblasty straciły kształt wrzeciona i przyjęły bardziej zaokrągloną morfologię. Podczas pierwszych trzech transfekcji gęstość komórek stopniowo i konsekwentnie rosła, z widocznym wybuchem proliferacji, który nastąpił między siódmym a ósmym dniem. Do 10 dnia komórki wydawały się w dużej mierze zlewające się.Pierwsze kolonie IPSC pojawiły się już w 11 dniu. Między 15 a 17 dniami kolonie IPSC stały się duże i oczywiste oraz wyraźnie różniły się od otaczających i całkowicie przeprogramowanych fibroblastów. Barwienie immunologiczne markera pluripotencji TRA-1-60 potwierdziło wysoką skuteczność przeprogramowywania.Nieoptymalna gęstość posiewu jest najczęstszą przyczyną zmniejszonej wydajności przeprogramowania w tym protokole. Jeśli gęstość posiewu była zbyt niska, pojawiały się duże bezkomórkowe plamy barona i kolonie IPSC nie tworzyły się. Po przejściu rozcieńczania przeprogramowanych komórek, IPSC rosły jako pojedyncze kolonie i były łatwe do odróżnienia od fibroblastów.Były luźno upakowane, a poszczególne komórki miały stosunkowo dużą powierzchnię cytoplazmatyczną. W ciągu czterech do siedmiu dni IPSC rozmnożyły się i utworzyły charakterystyczną, ciasno upakowaną kolonię o określonych krawędziach. Poszczególne komórki w kolonii wykazywały dużą frakcję jądrową z wydatnymi jąderkami.Po przeprogramowaniu fibroblastów pacjenta, powstałe IPSC mogą zostać zróżnicowane w różne komórki somatyczne w celu wyjaśnienia mechanizmów wywołujących chorobę lub opracowania nowych terapii regeneracyjnych opartych na komórkach.

rna-based-reprogramming-human-primary-fibroblasts-into-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Poznaj metodę przeprogramowania ludzkich fibroblastów w iPSC przy użyciu modyfikowanych mRNA i mikroRNA. Protokół zapewnia wysoką wydajność bez integracji wektorów i umożliwia generowanie komórek macierzystych do badań chorób oraz terapii.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Przeglądaj więcej filmów