Ocena wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza C1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek

Kompleksowa procedura oceny wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza C1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek. Niedawno ustaliliśmy, że składnik dopełniacza C1q, cząsteczka wrodzonego układu odpornościowego, ulega silnej ekspresji w mikrośrodowisku guza i łożyska i jest zdolna do interakcji ze składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej. W tym przypadku kwas hialuronowy.

Proponujemy metodę badania funkcji biologicznych białek w całym środowisku ekronomicznym. W celu zbadania zdolności tych cząsteczek do kształtowania właściwości podziału komórek czynników macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby zbadać, w jaki sposób ta interakcja może być wyczuwana przez komórki obecne w tkance środowiska, opracowaliśmy tę prostą metodę, w której komórkom binarnym pochodzącym z tkanek ludzkich pozwolono przylegać do C1q związanego z macierzą zewnątrzkomórkową, w tym przypadku kwasem hialuronowym.

W przypadku procedury powlekania pierwszym krokiem jest wiązanie kwasu hialuronowego o wysokiej masie cząsteczkowej z 96-dołkową mikropłytką pokrytą tkanką. W celu powlekania kwas hialuronowy rozcieńcza się w 0,1 molowym buforze węglowym o pH 9,6 w stężeniu 15 mikrogramów na mililitr. Delikatne pipetowanie jest niezbędne do uzyskania jednorodnego roztworu.

Do pokrycia studzienek używa się 100 mikrolitrów roztworu. Płytkę przenosi się następnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia odessać próżniowo poddane działaniu ścieków studzienki.

Przemyć raz za pomocą dPBS. Dodaj C1q lub BSA w odpowiednich studzienkach. C1q jest obecnie dostępny na rynku w stężeniu jednego miligrama na mililitr i jest rozcieńczany w stężeniu 25 mikrogramów na mililitr.

I dPBS zawierający 0,5% BSA i 0,7 milimoli wapnia i magnezu oraz kationy dwuwartościowe. BSA LPS free stosuje się w stężeniu 0,5% i dacie PBF. Płytkę przenosi się następnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Zależne od dawki C1q interakcje z unieruchomionym kwasem hialuronowym są determinowane przez immuno SA sprzężoną z enzymem. Znakowanie komórek za pomocą szybkiego DiI. Lipofilowy znacznik szybki DiI służy do oznaczania interesujących komórek. Komórki zawieszone w dPBS stosuje się w stężeniu miliona komórek na mililitr.

Fast DiI rozcieńcza się w ilości od 1 do 100 bezpośrednio do zawiesiny komórek. Zawiesinę komórek miesza się ręcznie i przenosi w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po pięciu minutach inkubacji wymieszaj zawiesinę komórkową i powtórz tę operację jeszcze dwa razy.

Aby usunąć nadmiar szybkiego DiI, dodaj 10 mililitrów dPBS. Delikatnie obracaj w górę i w dół i odwiruj przy 250 g przez siedem minut. Zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze wolnego podłoża ludzkiej surowicy endofilnej w obecności 0,1% BSA.

Adhezja komórek na matrycach kwasu hialuronowego C1q. Odessać próżniowo dPBS z powlekanych studzienek. Rozprowadzić 100 mikrolitrów oznakowanej zawiesiny komórkowej do powlekanych studzienek.

200 mikrolitrów znakowanych komórek jest rozkładanych w probówce Ependure w celu wykorzystania do generowania krzywej standardowej. Inkubować płytkę przez 35 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjmij płytkę z inkubatora.

Delikatnie odessać niezrównoważone komórki. Przemyć raz dPBS zawierającym 0,5% BSA i 0,7 milimoli wapnia i magnezu. Usuwa przylegające komórki, dodając 200 mikrolitrów buforu do lizy.

W tym samym czasie przygotuj krzywą wzorcową po jednym lub dwóch seryjnych rozcieńczeniach znakowanych komórek w buforze do lizy. Wykonaj odczyt sygnału fluorescencji na nieskończonym przyrządzie F 200 T-can, używając 544 nanometrów jako długości fali wzbudzenia i 590 nanometrów jako długości fali emisyjnej. Reprezentatywne wyniki.

Jak pokazują reprezentatywne wyniki, oczywiste jest, że adhezja komórek na kwasie hialuronowym wykazała, że C1q jest silnie wzmocniony w porównaniu z samym HA lub BSA związanym z HA. Procent przylegających komórek na każdej macierzy jest obliczany na podstawie krzywej standardowej. Wnioski. W naszych eksperymentach oceniliśmy przede wszystkim zdolność składnika dopełniacza C12 do wiązania macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym przypadku kwasu hialuronowego, za pomocą metalu arisalowego.

Po drugie, przeanalizowaliśmy zdolność ludzkich komórek pierwotnych barwionych barwnikiem fluorescencyjnym do poszukiwania związanego kwasu hialuronowego. Model, który zaproponowaliśmy w tym badaniu, jest łatwiejszą, szybszą i tańszą metodą alternatywną dla modelu 3D rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej do oceny tej odpowiedzi komórkowej na kombinację bodźców.