Name: Ocena wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza C1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Odkryj metodę oceny oddziaływań białka C1q z kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek. Ta technika pozwala badać funkcje białek w kontekście macierzy pozakomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ivanowi Donati za dostarczenie HA, Leonardo Amadio, Gabrielli Zito (Oddział Ginekologii IRCCS "Burlo Garofolo", Triest, Włochy) i Andrei Romano (Operacyjny Oddział Kliniczny Anatomii i Patologii Histologii, Szpital Cattinara, Triest, Włochy) za pobranie próbki tkanki. Dziękujemy również Nicolò Morosiniemu za pomoc w przygotowaniu filmu oraz Alexowi Coppoli, który użyczył głosu. Praca ta była wspierana przez granty z Instytutu Zdrowia Matki i Dziecka, IRCCS "Burlo Garofolo", Triest, Włochy (RC20/16) oraz Fondazione Cassa di Risparmio Trieste dla R. Bulla.

Próbki tkanek od pacjentów zostały pobrane po świadomej zgodzie, po zatwierdzeniu względów etycznych przez Radę Instytucjonalną Szpitala Uniwersyteckiego w Trieście, Włochy.
1. Izolacja i hodowla komórek nowotworowych (Dzień 1)
<ol>
	<li>Wyizoluj ludzkie komórki międzybłoniaka z próbek stałych MPM. Drobno zmielić tkankę nożem, aby uzyskać fragmenty o wielkości około 2-3mm2 i inkubować w 5 ml roztworu trawiącego składającego się ze zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego 0,5 mM Ca2+/Mg2+, 0,5% trypsyny i 50 μg/ml DNazy I, przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Izolacja i hodowla komórek nowotworowych (dzień 2)
	<ol>
		<li>Po całonocnej inkubacji umieścić strawioną tkankę na 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
		<li>Zastąpić roztwór wytrawiający po odwirowaniu (250 x g) roztworem kolagenazy typu 1 o stężeniu 3 mg/ml rozpuszczonym w 5 ml pożywki 199 z HBSS i dalej inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
		<li>Zablokuj reakcję enzymatyczną, dodając 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Ponownie zawiesić komórki bardzo ostrożnie za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aby upewnić się, że większość komórek została uwolniona z tkanki. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr porowy 100 μm.</li>
		<li>Wysiewać komórki w kolbie o średnicy 12,5cm2 i hodować je w temperaturze 37 °C za pomocą pożywki bez surowicy ludzkich komórek śródbłonka (HESF), z 10% FBS i uzupełnionej EGF (10 ng/ml), zasadowym FGF (20 ng/ml) i 1% penicyliny-streptomycyny. 
		UWAGA: Wymieniaj na świeże podłoże co 2-3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Powłoka HA (Dzień 1)
<ol>
	<li>Zawiesić HA o wysokiej masie cząsteczkowej (1,5 kDa) w wodzie podwójnie destylowanej o stężeniu 1 mg/mL6.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy HA do 50 μg/ml w buforze węglanowo-wodorowęglanowym (0,1 M, pH 9,6) delikatnie pipetując.</li>
	<li>Pokryć 96-dołkową płytkę 100 μl rozcieńczonego roztworu podstawowego HA na basenik przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Kwas hialuronowy był miłym prezentem od profesora Ivana Donatiego, Wydziału Nauk Przyrodniczych, Uniwersytetu w Trieście7.</li>
</ol>
3. Powłoka C1q (Dzień 2)
<ol>
	<li>Po całonocnej inkubacji odessać próżniowo studzienki poddane działaniu środka i przemyć 96-dołkową płytkę 100 μl PBS (dPBS) Dulbecco na studzienkę.</li>
	<li>Pozwolić, aby C1q (25 μg/ml lub różne stężenia do eksperymentów z odpowiedzią na dawkę) lub BSA (jako kontrola ujemna) związały się z unieruchomionym HA z tworzywa sztucznego poprzez inkubację tych białek w stężeniu 25 μg/ml w 100 μl dPBS + 0,5% BSA i 0,7 mM Ca2 + / Mg2+. Następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać próżniowo studzienki i umyć 96-dołkową płytkę 100 μl/studzienkę dPBS.</li>
</ol>
4. Etykietowanie komórek za pomocą FAST DiI
<ol>
	<li>Zawieś 1 x 105 komórek nowotworowych w 500 μl dPBS zawierającym 10 μg/ml barwnika fluorescencyjnego FAST DiI. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% v/v CO2 w celu etykietowania, mieszając ręcznie w odstępach 5 minut.
	<ol>
		<li>Aby usunąć nadmiar FAST DiI, dodaj 10 ml dPBS, delikatnie pipetuj w górę i w dół i odwiruj przy 250 x g przez 7 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml wolnej pożywki ludzkiej surowicy śródbłonka zawierającej 0,1% BSA (HESF + 0,1% BSA).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Adhezja komórek na matrycach HA/C1q (Dzień 1)
<ol>
	<li>Odsysać próżniowo studzienki pokryte różnymi matrycami (studzienki zostały pokryte w kroku 3.2).</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl oznakowanej zawiesiny komórek do powlekanych studzienek i inkubować płytkę przez 35 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% v/v CO2 .</li>
	<li>Usunąć nieprzylegające komórki poprzez zasysanie supernatantu. Przemyć raz dPBS zawierającym 0,5% BSA, 0,7 mM Ca2+ i 0,7 mM Mg2+.</li>
	<li>Poddać lizie przylegające komórki, dodając 200 μl/basenik 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS i natychmiast odczytać 96-dołkową płytkę za pomocą czytnika fluorescencji (544 nm, emisja 590 nm) przy użyciu krzywej kalibracyjnej wygenerowanej w wyniku lizy rosnącej liczby znakowanych komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+hyaluronic+acid+in+immunoprotection+and+immunomodulation%3A+Chemistry%2C+processing+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function.</a> Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).</li>
<li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li>
<li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement%3A+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).</li>
<li>Bulla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+acts+in+the+tumour+microenvironment+as+a+cancer-promoting+factor+independently+of+complement+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation.</a> Nature Communications. 7, 10346(2016).</li>
<li>Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+stromal+gene+signatures+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prognostic stromal gene signatures in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 17, 23(2015).</li>
<li>Collins, M. N., Birkinshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+solutions%3A+A+processing+method+for+efficient+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification.</a> Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).</li>
<li>Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+primary+structure%2C+complex+turnover+regulation+and+multiple+roles+of+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan.</a> Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).</li>
<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+role+of+C1q+in+cell+migration+and+tissue+remodeling%3A+contribution+to+trophoblast+invasion+and+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development.</a> Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).</li>
<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+Protein+C1q+Binds+to+Hyaluronic+Acid+in+the+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Microenvironment+and+Promotes+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).</li>
<li>Bossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+as+a+unique+player+in+angiogenesis+with+therapeutic+implication+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).</li>
<li>Hosszu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+expression+and+function+of+the+macromolecular+c1+complex+on+the+surface+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).</li>
<li>Laurent, T. C., Fraser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan.</a> Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).</li>
<li>Gaboriaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+globular+head+of+complement+protein+C1q+provides+a+basis+for+its+versatile+recognition+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).</li>
<li>Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+cell-matrix+interactions+in+hyaluronic+acid+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Opisujemy łatwą metodę zbadania, w jaki sposób składnik dopełniacza C1q, oddziałując z kwasem hialuronowym, jest w stanie modulować zachowanie pierwotnych komórek wyizolowanych z ludzkich tkanek nowotworowych. Zarówno HA, jak i C1q są obficie obecne w mikrośrodowisku tkankowym zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, uczestnicząc w kilku procesach biologicznych komórki. Na przykład wykazano, że C1q jest obecny w mikrośrodowisku łożyska, gdzie sprzyja inwazji trofoblastu poza kosmkami na matczyne decidua...

Mikrośrodowisko guza (TME) wpływa na rozwój i progresję raka, ponieważ może zapewnić dopuszczalną niszę dla przetrwania, wzrostu i inwazji komórek. Identyfikacja nowych kluczowych graczy w TME może być przydatna do odkrycia nowych narzędzi molekularnych do terapii celowanej. TME obejmuje złożoną i dynamiczną sieć komórek niezłośliwych, takich jak komórki śródbłonka, fibroblasty i komórki układu odpornościowego, osadzonych w otaczających składnikach macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), w tym kolagenach, lamininach, fibronektynach, proteoglikanach i hialuronianach. Zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe syntetyzują i wydzielają składniki ECM wraz z cytokinami, chemokinami, czynnikami wzrostu oraz enzymami zapalnymi i przebudowującymi macierz, które ogólnie zmieniają właściwości fizyczne, chemiczne i sygnalizacyjne TME. Wśród tych składników pojawił się kwas hialuronowy (HA), który odgrywa kluczową rolę w biologii nowotworów. Pomimo swojego prostego składu chemicznego, HA, wraz z cząsteczkami wiążącymi HA (hialadheryny), może modulować angiogenezę, reakcję układu odpornościowego i przebudowę ECM w sposób zależny od wielkości i stężenia1.
System dopełniacza (C) jest również częścią lokalnego TME, który ostatnio cieszy się coraz większym zainteresowaniem. System C obejmuje zestaw rozpuszczalnych i związanych z błoną białek biorących udział w pierwszej linii obrony przed komórkami niebędącymi własnymi, niepożądanymi elementami gospodarza i patogenami. Funkcjonalnie, C łączy dwuefektorowe ramiona systemów wrodzonych i adaptacyjnych, aby promować bezpośrednie zabijanie komórek lub montowanie odpowiedzi zapalnej2. Aktywacja C może hamować wzrost guza, niszcząc komórki rakowe lub hamując ich wzrost, ale staje się coraz bardziej jasne, że może mieć działanie promujące nowotwór poprzez podtrzymywanie przewlekłego stanu zapalnego, promowanie tworzenia środowiska immunosupresyjnego, indukowanie angiogenezy i aktywację szlaków sygnałowych związanych z rakiem3. W tym kontekście, C1q, pierwsza cząsteczka rozpoznająca klasycznego szlaku układu C, pojawiła się, aby pełnić ważne funkcje w mikrośrodowisku guza niezależnie od aktywacji C4. Wykazano, że C1q ulega lokalnej ekspresji w szeregu ludzkich nowotworów złośliwych, gdzie może sprzyjać adhezji, migracji i proliferacji komórek rakowych, a także angiogenezie i przerzutom5. Co ciekawe, C1q wchodzi w interakcje z głównym składnikiem ECM, takim jak HA.
Opracowaliśmy technikę izolowania pierwotnych komórek rakowych z masy guza. Ponadto stworzyliśmy matrycę, która może stymulować mikrośrodowisko guza, w szczególności interakcję między C1q a kwasem hialuronowym o wysokiej masie cząsteczkowej. C1q związany z HA był w stanie indukować adhezję komórek nowotworowych.

<table><tbody><tr><td>100&cienkie; &mikro; m filtr porowy</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B roztwór (fungizone)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr>podstawowe <td>nauki immunologiczne</td><td>FGF</td><td>GRF-15595</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Worthington Biochemical Corporation, DBA</td><td>MX1D12644</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Nauki Immunologiczne</td><td>GRF-10544</td><td></td></tr><tr><td>FAST DiI</td><td>Sondy molekularne, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>D7756</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco,&nbsp; Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Roche</td><td>11051407001</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Sterylny, wentylowany</td></tr><tr><td>roztwór gentamycyny</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Motek ' s Zrównoważony roztwór soli (HBBS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H6648</td><td>Uzupełniony EDTA, glukozą, penicyliną-streptamicyną, gentamycyną i fungizonem</td></tr><tr><td>Kwas hialuronowy o wysokiej masie cząsteczkowej</td><td>Miły prezent od prof. Ivana Donati</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica śródbłonkowa wolne podłoże&nbsp;</td><td>Gibco,&nbsp; Thermo Fisher Scientific</td><td>11111-044</td><td>Uzupełniony o EGF (5&thinsp; ng/mL), zasadowy FGF (10&thinsp; ng/ml), oraz&nbsp; 1% penicyliny&ndash; streptomycyna (Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Carlo Erba</td><td>13446-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 z Hank' s</td><td>sól Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia poklatkowa&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>System obrazowania BioStation IM-Q</td><td></td></tr><tr><td>Titertek Multiskan ELISA Reader</td><td>Flow Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Zobacz materiał T4674</td><td></td></tr></tbody></table> TGL

ocena wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza c1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek

Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

Coraz częściej wykazano, że mikrośrodowisko guza odgrywa aktywną rolę we wzroście nowotworu i przerzutach. Poprzez różne szlaki komórki nowotworowe mogą skutecznie rekrutować komórki zrębu, odpornościowe i śródbłonka poprzez wydzielanie czynników stymulujących, chemokin i cytokin. Z kolei komórki te mogą zmieniać właściwości sygnalizacyjne mikrośrodowiska, uwalniając sygnały stymulujące wzrost, metabolity i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej w celu utrzymania wysokiej proliferacji i zdolności przerzutowych. W tym kontekście stwierdzamy, że składnik dopełniacza C1q, silnie eksprymowany lokalnie przez szereg ludzkich nowotworów złośliwych, po interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową kwasu hialuronowego, silnie wpływa na zachowanie komórek pierwotnych wyizolowanych z ludzkich próbek guza. W tym miejscu opisujemy metodę testowania, w jaki sposób C1q związany z kwasem hialuronowym (HA) wpływa na adhezję komórek nowotworowych, podkreślając fakt, że właściwości biologiczne kluczowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej (w tym przypadku HA) mogą być kształtowane przez sygnały bioaktywne w kierunku progresji guza.

Kwas hialuronowy (HA) jest ujemnie naładowanym polisacharydem o wysokiej masie cząsteczkowej, który składa się z powtarzających się jednostek disacharydowych kwasu (β,1-4)-D-glukuronowego i (β,1-3)-N-acetyl-D-glukozaminy (Rysunek 1B)7. W celu zbadania wiązania HA na płytce 96-dołkowej oraz wydajności jego unieruchomienia wykorzystano biotynilowany kwas hialuronowy (bio-HA). Różne stężenia bio-HA, w zakresie od 10 µg/mL do 1 mg/mL, zawi...

Składnik dopełniacza C1q jest cząsteczką prozapalną o wysokiej ekspresji w mikrośrodowisku tkankowym, która może wchodzić w interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową. W tym miejscu opisujemy metodę testowania, w jaki sposób C1q związany z kwasem hialuronowym wpływa na adhezję komórek.

Ocena wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza C1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

Kompleksowa procedura oceny wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza C1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek. Niedawno ustaliliśmy, że składnik dopełniacza C1q, cząsteczka wrodzonego układu odpornościowego, ulega silnej ekspresji w mikrośrodowisku guza i łożyska i jest zdolna do interakcji ze składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej. W tym przypadku kwas hialuronowy.Proponujemy metodę badania funkcji biologicznych białek w całym środowisku ekronomicznym. W celu zbadania zdolności tych cząsteczek do kształtowania właściwości podziału komórek czynników macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby zbadać, w jaki sposób ta interakcja może być wyczuwana przez komórki obecne w tkance środowiska, opracowaliśmy tę prostą metodę, w której komórkom binarnym pochodzącym z tkanek ludzkich pozwolono przylegać do C1q związanego z macierzą zewnątrzkomórkową, w tym przypadku kwasem hialuronowym.W przypadku procedury powlekania pierwszym krokiem jest wiązanie kwasu hialuronowego o wysokiej masie cząsteczkowej z 96-dołkową mikropłytką pokrytą tkanką. W celu powlekania kwas hialuronowy rozcieńcza się w 0,1 molowym buforze węglowym o pH 9,6 w stężeniu 15 mikrogramów na mililitr. Delikatne pipetowanie jest niezbędne do uzyskania jednorodnego roztworu.Do pokrycia studzienek używa się 100 mikrolitrów roztworu. Płytkę przenosi się następnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia odessać próżniowo poddane działaniu ścieków studzienki.Przemyć raz za pomocą dPBS. Dodaj C1q lub BSA w odpowiednich studzienkach. C1q jest obecnie dostępny na rynku w stężeniu jednego miligrama na mililitr i jest rozcieńczany w stężeniu 25 mikrogramów na mililitr.I dPBS zawierający 0,5% BSA i 0,7 milimoli wapnia i magnezu oraz kationy dwuwartościowe. BSA LPS free stosuje się w stężeniu 0,5% i dacie PBF. Płytkę przenosi się następnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Zależne od dawki C1q interakcje z unieruchomionym kwasem hialuronowym są determinowane przez immuno SA sprzężoną z enzymem. Znakowanie komórek za pomocą szybkiego DiI. Lipofilowy znacznik szybki DiI służy do oznaczania interesujących komórek. Komórki zawieszone w dPBS stosuje się w stężeniu miliona komórek na mililitr.Fast DiI rozcieńcza się w ilości od 1 do 100 bezpośrednio do zawiesiny komórek. Zawiesinę komórek miesza się ręcznie i przenosi w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po pięciu minutach inkubacji wymieszaj zawiesinę komórkową i powtórz tę operację jeszcze dwa razy.Aby usunąć nadmiar szybkiego DiI, dodaj 10 mililitrów dPBS. Delikatnie obracaj w górę i w dół i odwiruj przy 250 g przez siedem minut. Zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze wolnego podłoża ludzkiej surowicy endofilnej w obecności 0,1% BSA.Adhezja komórek na matrycach kwasu hialuronowego C1q. Odessać próżniowo dPBS z powlekanych studzienek. Rozprowadzić 100 mikrolitrów oznakowanej zawiesiny komórkowej do powlekanych studzienek.200 mikrolitrów znakowanych komórek jest rozkładanych w probówce Ependure w celu wykorzystania do generowania krzywej standardowej. Inkubować płytkę przez 35 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjmij płytkę z inkubatora.Delikatnie odessać niezrównoważone komórki. Przemyć raz dPBS zawierającym 0,5% BSA i 0,7 milimoli wapnia i magnezu. Usuwa przylegające komórki, dodając 200 mikrolitrów buforu do lizy.W tym samym czasie przygotuj krzywą wzorcową po jednym lub dwóch seryjnych rozcieńczeniach znakowanych komórek w buforze do lizy. Wykonaj odczyt sygnału fluorescencji na nieskończonym przyrządzie F 200 T-can, używając 544 nanometrów jako długości fali wzbudzenia i 590 nanometrów jako długości fali emisyjnej. Reprezentatywne wyniki.Jak pokazują reprezentatywne wyniki, oczywiste jest, że adhezja komórek na kwasie hialuronowym wykazała, że C1q jest silnie wzmocniony w porównaniu z samym HA lub BSA związanym z HA. Procent przylegających komórek na każdej macierzy jest obliczany na podstawie krzywej standardowej. Wnioski. W naszych eksperymentach oceniliśmy przede wszystkim zdolność składnika dopełniacza C12 do wiązania macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym przypadku kwasu hialuronowego, za pomocą metalu arisalowego.Po drugie, przeanalizowaliśmy zdolność ludzkich komórek pierwotnych barwionych barwnikiem fluorescencyjnym do poszukiwania związanego kwasu hialuronowego. Model, który zaproponowaliśmy w tym badaniu, jest łatwiejszą, szybszą i tańszą metodą alternatywną dla modelu 3D rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej do oceny tej odpowiedzi komórkowej na kombinację bodźców.

evaluation-interplay-between-complement-protein-c1q-hyaluronic-acid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano nowatorskie podejście umożliwiające analizę wysokiej rozdzielczości interakcji komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym (HA). Powierzchnie wzorowane są wytwarzane poprzez połączenie chemii karbodiimidowej i mikrodruku kontaktowego.

Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek.  Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach.  Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Tutaj opisujemy innowacyjną metodę określania polimorfizmów długości receptora dopełniacza 1 (CR1) do wykorzystania w wielu zastosowaniach, szczególnie w ocenie podatności na choroby takie jak choroba Alzheimera (AD). Metoda ta może być przydatna do lepszego zrozumienia roli izoform CR1 w patogenezie choroby Alzheimera.

Genotypowanie polimorfizmu długości receptora dopełniacza 1 metodą topnienia w wysokiej rozdzielczości: innowacyjne narzędzie do oceny podatności genów choroby Alzheimera

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Ten protokół przedstawia eksperyment migracji in vitro odpowiedni do analizy funkcjonalnej cząsteczek biorących udział w migracji in vivo komórek grzebienia nerwowego do bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej.

In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

Aby skutecznie badać funkcje populacji komórek odpornościowych, często konieczna jest ich puryfikacja. Usuwanie dopełniacza jest szybką i niedrogą techniką izolacji populacji komórek odpornościowych o wysokiej czystości.

Deplecja specyficznych populacji komórek poprzez deplecję dopełniacza

Odkryj metodę oceny oddziaływań białka C1q z kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek. Ta technika pozwala badać funkcje białek w kontekście macierzy pozakomórkowej.

Ocena wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza C1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek

Przeglądaj więcej filmów