Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki znakowanych fluorescencyjnie neuronów myszy przy użyciu ręcznego sortowania i podwójnej transkrypcji in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq)

Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowej przeszkody w dziedzinie izolacji i sekwencjonowania pojedynczych neuronów. Na przykład zbieranie określonej populacji lub subpopulacji znakowanego fluorescencyjnie neuronu ze zdefiniowanego przez użytkownika obszaru mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wychwycenie pojedynczego neuronu będącego przedmiotem zainteresowania bez zanieczyszczania szczątków.

Jest również stosunkowo łagodny, co jest ważne dla delikatnych typów neuronów, które szybko umierają, gdy są poddawane ciśnieniu płynu konwencjonalnego sortowania FACS. Zacznij od przygotowania mikrokapilar z wyciągniętego szkła o średnicy wyjścia od 10 do 15 mikronów za pomocą ściągacza kapilarnego. Za pomocą cienkich nożyczek przeciąć końcówkę kapilary, aby uzyskać pożądaną średnicę deski.

Następnie za pomocą łączników rurowych przymocuj elastyczną rurkę silikonową o długości od 120 do 150 centymetrów o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra do filtra strzykawkowego z membraną PVDF o grubości 0,2 mikrona i dwukierunkowego zaworu rurkowego. Przygotuj 500 mililitrów schłodzonego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub ACSF i natleniaj, bulgocząc 5% dwutlenkiem węgla przez kamień napowietrzający przez 15 minut lub do momentu, gdy roztwór całkowicie się zklaruje. Przygotuj trzy 150-mililitrowe zlewki, z których każda zawiera 100 mililitrów ACSF.

Do jednego z nich dodaj koktajl blokerów aktywności. Do innego dodaj frakcję Streptococcus dla proteazy do końcowego stężenia jednego miligrama na mililitr. Do ostatniej zlewki dodaj FBS do końcowego stężenia 1% i natlenić 5% tlenem zrównoważonym dwutlenkiem węgla przez napowietrzanie.

Na koniec przygotuj trzy pipety Pasteura z długimi nóżkami o zmniejszających się średnicach wylotów, przetaczając je nad otwartym ogniem. Wypreparuj mózg myszy poddanej eutanazji, otwierając czaszkę małymi nożyczkami i wydobywając świeży mózg za pomocą cienkich kleszczy bez uszkadzania kory. Umieść mózg w schłodzonym i natlenionym ACSF, pozostawiając kamień napowietrzający przyłączony do tlenu o równowadze 5% dwutlenku węgla przez cały czas trwania sekcji.

Umieść mózg na uchwycie wibratomicznym i wytnij odcinki czołowe lub strzałkowe o grubości 300 mikronów. Zbierz tyle sekcji, ile potrzeba, aby uzyskać co najmniej od 10 do 50 oznaczonych komórek. Połóż plastry na uchwycie na plastry z bawełnianymi oczkami umieszczonym w zlewce, aby były skąpane w natlenionym ACSF.

Przenieś plastry do zlewki zawierającej ACSF z blokerami aktywności i blokuj przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej, bulgocząc tlenem za pomocą kamienia napowietrzającego. Przenieś plastry do zlewki zawierającej ACSF z roztworem proteazy, aby przeprowadzić łagodne trawienie w temperaturze pokojowej. Po strawieniu wypłucz proteazę, przesuwając plastry z powrotem do zlewki zawierającej ACSF z roztworem blokującym aktywność przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej.

Kontynuuj bulgoczący tlen. Następnie przygotuj 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą ACSF z 1%FBS w temperaturze pokojowej i przenieś poszczególne sekcje do dysku w celu mikrodysekcji. Pod fluorescencyjnym lunetą sekcyjną użyj pary cienkich kleszczy do mikropreparowania obszarów i warstw zainteresowania mających co najmniej 10 do 50 komórek.

Za pomocą pipety Pasteura przenieś mikrowycięte kawałki do 2-mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej około 0,8 mililitra 1% FBS w roztworze ACSF. Miareczkować wypreparowaną tkankę w probówce do mikrofuge w temperaturze pokojowej. Wykonaj około 10 pociągnięć każdą z płomieniowanych pipet Pasteura, zaczynając od największej, a kończąc na najmniejszej średnicy wylotu.

Dozuj zdysocjowane komórki do 100-milimetrowej szalki Petriego zawierającej natleniony ACSF i odczekaj od pięciu do siedmiu minut, aż komórki stopniowo się uspokoją. Obserwuj sygnał GFP i RFP pod mikroskopem preparacyjnym. Zidentyfikuj szczątki, badając morfologię w świetle jasnego pola.

Po zidentyfikowaniu obszaru komórek z niewielką ilością zanieczyszczeń użyj kapilary i przymocuj do rurki, aby pobrać komórki, blokując koniec zaworu rurki językiem. Następnie umieść kapilarnę blisko komórek. Zwolnij blok na kapilarze i szybko zablokuj ponownie, aby uchwycić komórkę za pomocą działania kapilarnego.

Przenieś kapilarnę na 100-milimetrową szalkę Petriego ze świeżo natlenionym ACSF i delikatnie dmuchnij do probówki, obserwując końcówkę kapilary pod optyką fluorescencyjną, aby dozować komórki do naczynia. Powtarzaj procedurę zbierania, aż zostanie zebranych od 100 do 150 komórek, upewniając się, że zanieczyszczenia, takie jak zanieczyszczenia, są minimalne w kontrastowych optykach interferencyjnych z jasnym polem. Na koniec, za każdym razem używając świeżej pipety mikrokapilarnej, wybierz pojedynczą komórkę i wyrzuć ją w nie więcej niż 0,5 mikrolitra do 0,2 mikrolitrowej probówki mikro-fuge zawierającej jeden mikrolitr buforu do pobierania próbek ze starterami.

Złamać końcówkę pipety w probówce z mikrofugą, aby upewnić się, że komórka pozostaje w buforze do zbierania. Zamroź komórki, kładąc probówki na suchym lodzie. Przechowywać w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przetworzenia w celu amplifikacji RNA.

Neurony GABA-ergiczne wyizolowano z kory obręczy mózgu myszy. RNA amplifikowane z ręcznie posortowanych neuronów miało wielkość od 200 do 4 000 par zasad z rozkładem pików nieco powyżej 500 par zasad. Po oczyszczeniu kulek rozmiar biblioteki cDNA jest dodatkowo ograniczany przez drugą rundę oczyszczania przy użyciu kulek w celu wyeliminowania fragmentów mniejszych niż 200 par zasad i dla piku na około 350 par zasad.

Sekwencjonowanie wykazało 4,8 razy 10 do 5. mediany lub 6,9 razy 10 do 5. uśrednionych zmapowanych odczytów na komórkę. Po usunięciu zduplikowanego RNA za pomocą UMI, każda pojedyncza komórka miała średnią liczbę unikalnych odczytów 1,0 razy 10 do 5. mediany lub 1,4 razy 10 do 5. średniej liczby unikalnych odczytów na komórkę. W każdym konsorcjum kontroli zewnętrznego RNA pojedynczej komórki, skok RNA został wykorzystany jako kontrola wewnętrzna do obliczenia bezwzględnej liczby cząsteczek dodanych do próbki.

Istniała liniowa zależność danych wejściowych od obserwowanych zliczeń o nachyleniu 0,92 i skorygowanym kwadracie R wynoszącym 0,94. Średnio około 10 000 genów na pojedynczy neuron zostało wykrytych przy użyciu tej procedury, przy czym ponad 95% pojedynczych komórek wykryło ponad 6 000 genów. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę biologom molekularnym do zbadania transkryptomu odrębnych, dobrze scharakteryzowanych interneuronów korowych myszy i zidentyfikowania wybranych kategorii genów, które są odpowiedzialne za kodowanie tożsamości komórkowej.