Name: Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki znakowanych fluorescencyjnie neuronów myszy przy użyciu ręcznego sortowania i podwójnej transkrypcji in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę izolacji pojedynczych neuronów myszy z fluorescencyjnym znaczeniem przy użyciu ręcznego sortowania i sekwencjonowania RNA. Technika DIVA-Seq umożliwia analizę ekspresji genów w określonych populacjach komórkowych mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z NIH (5R01MH094705-04 i R01MH109665-01 dla Z.J.H.), przez CSHL Robertson Neuroscience Fund (dla Z.J.H.) oraz przez stypendium podoktorskie NARSAD (dla A.P.).

<ol><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228(2017).</li>
<li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883(2016).</li>
<li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101(2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma sprzecznych interesów finansowych.

Protokół ręcznego sortowania jest odpowiedni do nadzorowanego sekwencjonowania RNA populacji neuronów, które są albo słabo znakowane w mózgu myszy, albo reprezentują rzadką populację komórek, która w inny sposób nie jest możliwa do zbadania przy użyciu obecnych metod sortowania i amplifikacji komórek o wysokiej przepustowości. Ogniwa poddane działaniu FACS są zwykle poddawane ciśnieniu w osłonie i linii próbki w zakresie ~9–14 psi, w zależności od rozmiaru dyszy i pożądanych szybkości zdarzeń. Ponadto, po wyrzuceniu z dy...

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (sekwencjonowanie RNA) zmieniło badania transkryptomiczne. Podczas gdy sekwencja RNAseq pojedynczej komórki na dużą skalę może być wykonywana przy użyciu różnych technik, takich jak droplets1,2, microfluidics3, nanogrids4 i microwells5, większość metod nie może sortować zdefiniowanych typów komórek, które wyrażają genetycznie kodowane fluorofory. Aby wyizolować wybraną populację komórek, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest często używane do sortowania oznakowanych komórek w trybie pojedynczej komórki. Jednak FACS ma pewne ograniczenia i wymaga skrupulatnych etapów przetwarzania próbek. Po pierwsze, zwykle potrzebna jest duża liczba komórek wejściowych (często kilka milionów komórek na ml), przy czym znaczna część (>15–20%) zawiera znakowaną populację. Po drugie, przygotowanie komórek może wymagać wielu rund wirowania w gradionym gradimencie gęstości w celu usunięcia frakcji glejowej, zanieczyszczeń i grudek komórek, które w przeciwnym razie mogłyby zatkać dyszę lub komórkę przepływową. Po trzecie, FACS zwykle stosuje etapy barwienia i odbarwiania do barwienia żywego/martwego (np. 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), jodek propidyny (PI) i barwniki Cytotracker), które zajmują dodatkowy czas. Po czwarte, zgodnie z zasadą sortowania dwukolorowego (takiego jak DAPI i zielone/czerwone białko fluorescencyjne (GFP/RFP)), zwykle potrzebne są dwie próbki i jedna kontrola, co wymaga przetworzenia nieoznakowanej próbki oprócz pożądanego szczepu myszy. Po piąte, filtrowanie jest często wykonywane wielokrotnie przed i w trakcie sortowania próbek, aby proaktywnie zapobiegać zatykaniu się linii pobierania próbek w maszynie FACS. Po szóste, w najczęściej używanych konfiguracjach FACS należy przeznaczyć czas na inicjalizację i stabilizację strumienia płynu oraz przeprowadzenie kalibracji kropel. Po siódme, próbki kontrolne są zwykle uruchamiane w sekwencji przed faktycznym pobraniem próbki w celu ustawienia matryc kompensacji, odrzucenia dubletów, ustawienia bramek itp. Użytkownicy albo wykonują kroki szóste i siódme samodzielnie z wyprzedzeniem, albo wymagają pomocy technika równolegle. Wreszcie, po FACS, często wykonuje się kroki, aby upewnić się, że w każdej studzience obecne są tylko oznakowane pojedyncze komórki; Na przykład poprzez sprawdzanie próbek w konfiguracji do przesiewania o wysokiej zawartości, takiej jak szybki imager płytowy.
Aby obejść kroki opisane powyżej i ułatwić stosunkowo szybkie, ukierunkowane sekwencjonowanie małej populacji pojedynczych, fluorescencyjnie znakowanych neuronów, opisujemy procedurę ręcznego sortowania, po której następują dwie rundy bardzo czułego protokołu amplifikacji in vitro, zwanego podwójną transkrypcją in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq). Amplifikacja RNA i generowanie biblioteki cDNA zostały zaadaptowane z Eberwine i wsp.6 oraz Hashimshony et al.7, z pewnymi modyfikacjami, aby dopasować je do mysich interneuronów, które mają mniejsze objętości komórkowe; Co więcej, odkryliśmy również, że jest równie przydatny dla pobudzających neuronów piramidowych.

<table><tbody><tr><td>ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 10777019</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do fragmentacji RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# E6105S</td><td></td></tr><tr><td>RNA MinElute</td><td>kit Qiagen</td><td>Cat# 74204</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza antarktyczna</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0289</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0201</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza RNA T42, obcięta</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0242</td><td></td></tr><tr><td>Ampure Xp magnetyczne&nbsp; koraliki</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# A63880</td><td></td></tr><tr><td>SPRIwybierz wybór rozmiaru koraliki</td> <td>magnetyczneThermo Fisher</td><td>Cat# B23317</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Tocris</td><td>Cat# 0105</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1045</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1078</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza ze Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P5147</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Message Amp II</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# AM1751</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>Cat# UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 761036</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TrueSeq zestaw smallRNA</td><td>Illumina</td><td>Cat# RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator RNA Chip Pico</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator o wysokiej czułości Chip DNA</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny z fluorescencją i oświetleniem jasnego pola z optyką DIC.&nbsp; (Leica model MZ-16F).</td><td>Leica</td><td>Model MZ-16F</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapilara szklana: borokrzemianowe rurki kapilarne 500/op. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, ścianka= 0.21 mm, Długość= 150 mm.</td><td>Instrumenty Warner</td><td>Model GC100-15, zamówienie# 30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet kapilarnych</td><td>Sutter Instruments Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Klimatyzator do tkanek Vibratome</td><td></td><td></td> Thermo Microm HM 650V Vibratome Thermo Microm CU 65 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie rna pojedynczej komórki znakowanych fluorescencyjnie neuronów myszy przy użyciu ręcznego sortowania i podwójnej transkrypcji in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (diva-seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (sekwencjonowanie RNA) jest obecnie powszechnie stosowanym narzędziem do oznaczania ekspresji genów. Dostępne na rynku platformy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przetwarzają wszystkie komórki wejściowe bezkrytycznie. Czasami sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest stosowane przed wyizolowaniem specjalnie oznakowanej populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Ograniczeniem FACS jest potrzeba dużej liczby komórek wejściowych ze znacznie znakowanymi frakcjami, co jest niepraktyczne w przypadku zbierania i profilowania rzadkich lub słabo znakowanych populacji neuronów z mózgu myszy. W tym miejscu opisujemy metodę ręcznego zbierania rzadkich, znakowanych fluorescencyjnie pojedynczych neuronów ze świeżo zdysocjowanej tkanki mózgowej myszy. Proces ten pozwala na wychwytywanie pojedynczych znakowanych neuronów o wysokiej czystości, a następnie integrację z protokołem amplifikacji opartym na transkrypcji in vitro, który zachowuje endogenne proporcje transkryptów. Opisujemy metodę podwójnej amplifikacji liniowej, która wykorzystuje unikalne identyfikatory cząsteczek (UMI) do generowania indywidualnych liczb mRNA. Dwie rundy amplifikacji skutkują wysokim stopniem detekcji genu na pojedynczą komórkę.

Stosując opisany powyżej protokół, neurony GABAergiczne zostały wyizolowane ręcznie (Rycina 1), a RNA zostało amplifikowane, a następnie przekształcone w bibliotekę cDNA (Rycina 2) i zsekwencjonowane z dużą głębokością8. Produkty amplifikowanego RNA (aRNA) miały wielkość od 200–4 000 bp, z szczytem rozkładu nieco powyżej 500 bp (Rycina 3A). Biblioteka cDNA oczyszczona za pomoc...

Ten protokół opisuje procedurę ręcznego sortowania w celu izolacji pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie neuronów, a następnie amplifikacji mRNA opartej na transkrypcji in vitro w celu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki o dużej głębokości.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki znakowanych fluorescencyjnie neuronów myszy przy użyciu ręcznego sortowania i podwójnej transkrypcji in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowej przeszkody w dziedzinie izolacji i sekwencjonowania pojedynczych neuronów. Na przykład zbieranie określonej populacji lub subpopulacji znakowanego fluorescencyjnie neuronu ze zdefiniowanego przez użytkownika obszaru mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wychwycenie pojedynczego neuronu będącego przedmiotem zainteresowania bez zanieczyszczania szczątków.Jest również stosunkowo łagodny, co jest ważne dla delikatnych typów neuronów, które szybko umierają, gdy są poddawane ciśnieniu płynu konwencjonalnego sortowania FACS. Zacznij od przygotowania mikrokapilar z wyciągniętego szkła o średnicy wyjścia od 10 do 15 mikronów za pomocą ściągacza kapilarnego. Za pomocą cienkich nożyczek przeciąć końcówkę kapilary, aby uzyskać pożądaną średnicę deski.Następnie za pomocą łączników rurowych przymocuj elastyczną rurkę silikonową o długości od 120 do 150 centymetrów o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra do filtra strzykawkowego z membraną PVDF o grubości 0,2 mikrona i dwukierunkowego zaworu rurkowego. Przygotuj 500 mililitrów schłodzonego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub ACSF i natleniaj, bulgocząc 5% dwutlenkiem węgla przez kamień napowietrzający przez 15 minut lub do momentu, gdy roztwór całkowicie się zklaruje. Przygotuj trzy 150-mililitrowe zlewki, z których każda zawiera 100 mililitrów ACSF.Do jednego z nich dodaj koktajl blokerów aktywności. Do innego dodaj frakcję Streptococcus dla proteazy do końcowego stężenia jednego miligrama na mililitr. Do ostatniej zlewki dodaj FBS do końcowego stężenia 1% i natlenić 5% tlenem zrównoważonym dwutlenkiem węgla przez napowietrzanie.Na koniec przygotuj trzy pipety Pasteura z długimi nóżkami o zmniejszających się średnicach wylotów, przetaczając je nad otwartym ogniem. Wypreparuj mózg myszy poddanej eutanazji, otwierając czaszkę małymi nożyczkami i wydobywając świeży mózg za pomocą cienkich kleszczy bez uszkadzania kory. Umieść mózg w schłodzonym i natlenionym ACSF, pozostawiając kamień napowietrzający przyłączony do tlenu o równowadze 5% dwutlenku węgla przez cały czas trwania sekcji.Umieść mózg na uchwycie wibratomicznym i wytnij odcinki czołowe lub strzałkowe o grubości 300 mikronów. Zbierz tyle sekcji, ile potrzeba, aby uzyskać co najmniej od 10 do 50 oznaczonych komórek. Połóż plastry na uchwycie na plastry z bawełnianymi oczkami umieszczonym w zlewce, aby były skąpane w natlenionym ACSF.Przenieś plastry do zlewki zawierającej ACSF z blokerami aktywności i blokuj przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej, bulgocząc tlenem za pomocą kamienia napowietrzającego. Przenieś plastry do zlewki zawierającej ACSF z roztworem proteazy, aby przeprowadzić łagodne trawienie w temperaturze pokojowej. Po strawieniu wypłucz proteazę, przesuwając plastry z powrotem do zlewki zawierającej ACSF z roztworem blokującym aktywność przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej.Kontynuuj bulgoczący tlen. Następnie przygotuj 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą ACSF z 1%FBS w temperaturze pokojowej i przenieś poszczególne sekcje do dysku w celu mikrodysekcji. Pod fluorescencyjnym lunetą sekcyjną użyj pary cienkich kleszczy do mikropreparowania obszarów i warstw zainteresowania mających co najmniej 10 do 50 komórek.Za pomocą pipety Pasteura przenieś mikrowycięte kawałki do 2-mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej około 0,8 mililitra 1% FBS w roztworze ACSF. Miareczkować wypreparowaną tkankę w probówce do mikrofuge w temperaturze pokojowej. Wykonaj około 10 pociągnięć każdą z płomieniowanych pipet Pasteura, zaczynając od największej, a kończąc na najmniejszej średnicy wylotu.Dozuj zdysocjowane komórki do 100-milimetrowej szalki Petriego zawierającej natleniony ACSF i odczekaj od pięciu do siedmiu minut, aż komórki stopniowo się uspokoją. Obserwuj sygnał GFP i RFP pod mikroskopem preparacyjnym. Zidentyfikuj szczątki, badając morfologię w świetle jasnego pola.Po zidentyfikowaniu obszaru komórek z niewielką ilością zanieczyszczeń użyj kapilary i przymocuj do rurki, aby pobrać komórki, blokując koniec zaworu rurki językiem. Następnie umieść kapilarnę blisko komórek. Zwolnij blok na kapilarze i szybko zablokuj ponownie, aby uchwycić komórkę za pomocą działania kapilarnego.Przenieś kapilarnę na 100-milimetrową szalkę Petriego ze świeżo natlenionym ACSF i delikatnie dmuchnij do probówki, obserwując końcówkę kapilary pod optyką fluorescencyjną, aby dozować komórki do naczynia. Powtarzaj procedurę zbierania, aż zostanie zebranych od 100 do 150 komórek, upewniając się, że zanieczyszczenia, takie jak zanieczyszczenia, są minimalne w kontrastowych optykach interferencyjnych z jasnym polem. Na koniec, za każdym razem używając świeżej pipety mikrokapilarnej, wybierz pojedynczą komórkę i wyrzuć ją w nie więcej niż 0,5 mikrolitra do 0,2 mikrolitrowej probówki mikro-fuge zawierającej jeden mikrolitr buforu do pobierania próbek ze starterami.Złamać końcówkę pipety w probówce z mikrofugą, aby upewnić się, że komórka pozostaje w buforze do zbierania. Zamroź komórki, kładąc probówki na suchym lodzie. Przechowywać w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przetworzenia w celu amplifikacji RNA.Neurony GABA-ergiczne wyizolowano z kory obręczy mózgu myszy. RNA amplifikowane z ręcznie posortowanych neuronów miało wielkość od 200 do 4 000 par zasad z rozkładem pików nieco powyżej 500 par zasad. Po oczyszczeniu kulek rozmiar biblioteki cDNA jest dodatkowo ograniczany przez drugą rundę oczyszczania przy użyciu kulek w celu wyeliminowania fragmentów mniejszych niż 200 par zasad i dla piku na około 350 par zasad.Sekwencjonowanie wykazało 4,8 razy 10 do 5. mediany lub 6,9 razy 10 do 5. uśrednionych zmapowanych odczytów na komórkę. Po usunięciu zduplikowanego RNA za pomocą UMI, każda pojedyncza komórka miała średnią liczbę unikalnych odczytów 1,0 razy 10 do 5. mediany lub 1,4 razy 10 do 5. średniej liczby unikalnych odczytów na komórkę. W każdym konsorcjum kontroli zewnętrznego RNA pojedynczej komórki, skok RNA został wykorzystany jako kontrola wewnętrzna do obliczenia bezwzględnej liczby cząsteczek dodanych do próbki.Istniała liniowa zależność danych wejściowych od obserwowanych zliczeń o nachyleniu 0,92 i skorygowanym kwadracie R wynoszącym 0,94. Średnio około 10 000 genów na pojedynczy neuron zostało wykrytych przy użyciu tej procedury, przy czym ponad 95% pojedynczych komórek wykryło ponad 6 000 genów. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę biologom molekularnym do zbadania transkryptomu odrębnych, dobrze scharakteryzowanych interneuronów korowych myszy i zidentyfikowania wybranych kategorii genów, które są odpowiedzialne za kodowanie tożsamości komórkowej.

single-cell-rna-sequencing-fluorescently-labeled-mouse-neurons-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę izolowania fluorescencyjnie znakowanych neuronów z mózgu myszy.

Izolowanie fluorescencyjnie znakowanych neuronów z mysiego mózgu

Wysokiej jakości całkowite RNA zostało przygotowane z ciał komórkowych mysich neuronów ruchowych rdzenia kręgowego za pomocą laserowej mikrodysekcji po zabarwieniu odcinków rdzenia kręgowego Azure B w 70% etanolu. Wystarczająca ilość RNA (~40-60 ng) jest odzyskiwana z 3 000-4 000 neuronów ruchowych, aby umożliwić dalszą analizę RNA za pomocą sekwencji RNA i qRT-PCR.

Produkcja RNA do analizy transkryptomicznej z ciał komórek neuronów ruchowych rdzenia kręgowego myszy za pomocą mikrodysekcji wychwytywania laserowego

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Przedstawiona tutaj jest metoda sekwencjonowania pojedynczych jąder wyizolowanych z mysiego zakrętu zębatego, która wyklucza większość neuronów poprzez sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FAN). Takie podejście pozwala na uzyskanie wysokiej jakości profili ekspresji i ułatwia badanie większości innych typów komórek reprezentowanych w niszy, w tym rzadkich populacji, takich jak nerwowe komórki macierzyste.

Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Poznaj metodę izolacji pojedynczych neuronów myszy z fluorescencyjnym znaczeniem przy użyciu ręcznego sortowania i sekwencjonowania RNA. Technika DIVA-Seq umożliwia analizę ekspresji genów w określonych populacjach komórkowych mózgu.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki znakowanych fluorescencyjnie neuronów myszy przy użyciu ręcznego sortowania i podwójnej transkrypcji in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq) (Wideo) | JoVE Journal

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki znakowanych fluorescencyjnie neuronów myszy przy użyciu ręcznego sortowania i podwójnej transkrypcji in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq)

Przeglądaj więcej filmów