Name: Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji wzmocnienia zależnego od przeciwciał wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich przy użyciu ludzkiego surowicy i PCR w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia badanie wpływu uprzedniej odporności na dengę na zakażenie Ziką.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była hojnie wspierana przez 1R21AI129881-01 (do T.M.C.), fundusze startowe z National Emerging Infectious Diseases Laboratories oraz Boston University School of Medicine.

Próbki surowicy użyte w tym badaniu zostały pobrane od ludzkich uczestników kohorty z Kolumbii. Pobranie próbki zostało zatwierdzone przez wewnętrzną komisję rewizyjną (IRB) na Universidad de Pamplona (Columbia, Ameryka Południowa) i Los Potios Hospital8. Próbki zostały dostarczone anonimowo, a badacze nie mieli dostępu do informacji o pacjentach. Próbki surowicy przebadano pod kątem serotypu DENV. Potwierdzono również, że próbki neutralizują zakażenie DENV in vitro. Do kontroli wykorzystano próbki surowicy od osób zdrowych (HC) z USA.
UWAGA: Ten protokół może być użyty do zbadania ADE replikacji ZIKV w dowolnym typie ludzkiej komórki wyrażającej receptor Fcγ. Protokół składa się z trzech części (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
1. Konfiguracja rozsiewania komórek i infekcji
UWAGA: W tym konkretnym badaniu użyto ludzkich pierwotnych makrofagów lub linii komórek mielomonocytarnych U937 (ATCC-CRL-1593.2). Komórki utrzymywano w pożywce wzrostowej RPMI uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2 ). Wszystkie etapy zostały przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Wysiać 3 x 104 komórki na basenie na sterylnej płaskiej 96-dołkowej płytce wraz ze 100 μl pożywki i umieścić je w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Po wysianiu komórek rozmrozić próbki surowicy w temperaturze pokojowej i wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia (tj. 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10 000), mieszając próbki w pożywce bez surowicy. Porcjować rozcieńczenia na sterylną płytkę 96-dołkową. Wirusa należy stosować bez surowicy jako dodatkową kontrolę.</li>
	<li>Rozmrażaj bulion ZIKV w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 1 - 2 minuty i szybko przenieś go do lodu do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Dodać równoważną 0,1 wielokrotności infekcji (MOI) ilość szczepu ZIKV MR766 do podwielokrotności surowicy podwielokrotności. 
	nuta: Upewnij się, że współczynnik rozcieńczenia pozostaje stały, a całkowita objętość wynosi ~200 μL; To wystarcza na trzykrotne powtórzenia każdego zabiegu. Utrzymuj trzy studzienki niezainfekowane, aby wykorzystać je jako kontrolę ujemną do dalszej analizy.</li>
	<li>Rozcieńczenia surowicy należy inkubować z dodatkiem wirusa w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% stężeniem CO2 przez 1 godzinę, aby umożliwić przeciwciałom DENV utworzenie kompleksów z wirionami Zika (dla wygody, zwanych dalej "kompleksami immunologicznymi").</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek, które zostały wysiane na płaskiej 96-dołkowej płytce. Umyj komórki sterylnym 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS).</li>
	<li>Dodać 50 μl kompleksów immunologicznych do każdej studzienki i inkubować je w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 godziny.</li>
	<li>Po 2 godzinach inkubacji odessać pożywkę zawierającą kompleksy immunologiczne z komórek za pomocą pipety wielokanałowej i umyć komórki 2x 1x PBS, aby całkowicie usunąć kompleksy immunologiczne i wszelkie nieprzyłączone wiriony.</li>
	<li>Dodać 100 μl świeżej, kompletnej pożywki uzupełnionej 10% FBS do każdej studzienki i inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i przenieść ją do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Odessać pożywkę, przemyć komórki 2x 1x PBS i przystąpić do ekstrakcji RNA. 
	nuta: RNA można wyekstrahować dowolną metodą (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu do lizy komórek z 10% β-merkaptoetanolem na studzienkę. Pipetuj bufor w górę i w dół co najmniej 5 razy, a także zarysuj komórki końcówką pipety, aby przyspieszyć procedurę lizy.</li>
	<li>Przenieś lizaty komórkowe do nowych, oznakowanych, sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać równą ilość 70% etanolu (250 μL). Pipetować w górę i w dół 4x - 5x, aż mieszanina będzie klarowna.</li>
	<li>Przenieś mieszaninę (~500 μl) do znakowanych kolumn na bazie krzemionki w probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml i odwiruj przy 15 000 x g przez 30 s. Odrzuć przepływ i utrzymuj kolumny w tych samych probówkach zbiorczych.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu płuczącego 1 do każdej kolumny i odwirować przy 15 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ i utrzymać kolumny w tych samych probówkach zbiorczych.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do każdej kolumny i odwirować przy 15 000 x g przez 30 s. Odrzucić supernatant. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
	<li>Przenieść kolumny do nowych probówek zbiorczych o pojemności 2 ml i odwirować przy 15 000 x g przez 2 minuty. Upewnij się, że kolumny na bazie krzemionki całkowicie wyschły i nie pozostały żadne etanole z buforu płuczącego 2.</li>
	<li>Wyrzuć probówki o pojemności 2 ml i umieść kolumny w nowych, sterylnych, oznakowanych probówkach regeneracyjnych o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać podgrzane (42 °C) 30 μl wody wolnej od RNaz na środek każdej kolumny i odwirować przy 15 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Odzyskać wymyty RNA i określić ilościowo próbki za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm. 
	nuta: Najlepiej określić czystość RNA, obliczając stosunek wartości absorbancji przy 260 nm i 280 nm. Stosunek oczyszczonego RNA 260/280 wynosi idealnie od 1,8 do 2,0.</li>
</ol>
3. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym
UWAGA: Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) może być przeprowadzona przy użyciu dowolnej zielonej mieszanki SYBR, która zwykle składa się z barwnika SYBR Green I, polimerazy DNA Taq, trifosforanów deoksynukleotydowych (dNTP) i barwnika pasywnego. Każda maszyna qPCR zdolna do wykrywania koloru zielonego SYBR może być użyta do przeprowadzenia reakcji i pozyskania danych. W tym eksperymencie użyto jednoetapowego zestawu RT-PCR, który zawierał koktajl SYBR Green I, barwnika ROX, polimerazy DNA Taq, dNTP i dodatkowej mieszaniny odwrotnej transkryptazy (patrz Tabela materiałów). Startery zaprojektowane w odniesieniu do regionu otoczki i użyte w tym badaniu do ilościowego określenia poziomów genomu ZIKV to CCGCTGCCCAACACAAG dla ZIKV-qF i CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT dla ZIKV-qR. Jako kontrolę, ludzka β-2-mikroglobulina (B2M) została zmierzona i wykorzystana do normalizacji ekspresji ZIKV (gen porządkowy). Sekwencje starterowe do ilościowego określenia ekspresji genu B2M użyte w tym badaniu to CTCCGTGGCCTTAGCTGTG dla B2M-qF i TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT dla B2M-qR. Upewnij się, że umieścisz trzy kontrpróby techniczne dla każdej próbki zarówno dla genów ZIKV, jak i B2M. Konfiguracja RT-PCR jest pokrótce opisana poniżej.
<ol>
	<li>Konfiguracja RT-PCR
	<ol>
		<li>Użyj 100 ng RNA na próbkę.</li>
		<li>Dodać 1 μl z 10 μM zapasów zarówno przednich, jak i odwrotnych starterów określonego genu dla każdej reakcji.</li>
		<li>Dodać 0,25 μl mieszaniny odwrotnej transkryptazy na próbkę.</li>
		<li>Do każdej pojedynczej reakcji dodać 12,5 μl mieszanki SYBR Green.</li>
		<li>Dodać do 25 μl wody. Sporządzić główną mieszaninę wszystkich wyżej wymienionych odczynników z wyjątkiem RNA, podwielokrotnić ją na 96-dołkowej płytce do PCR i dodać RNA na końcu.</li>
		<li>Uszczelnij płytkę przezroczystą taśmą klejącą.</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 1 000 x g przez 1 minutę w celu wymieszania odczynników.</li>
		<li>Umieść płytkę w maszynie qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Profil RT-PCR 
	nuta: Należy użyć profilu RT-PCR przedstawionego w Tabeli 1.
	<ol>
		<li>Inkubować próbki w temperaturze 50 °C przez 10 minut w celu zapewnienia syntezy komplementarnego DNA (cDNA).</li>
		<li>Po syntezie cDNA aktywować polimerazę DNA Taq w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Wykonać 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 s oraz wyżarzania i przedłużania podkładu w temperaturze 60 °C przez 30 s.</li>
		<li>Umieść dodatkowy stopień krzywej topnienia (65°C) na końcu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Monitoruj krzywą topnienia, klikając zakładkę krzywej topnienia w programie używanym do uruchamiania maszyny qPCR, która w idealnym przypadku pokazuje pojedynczy pik we wszystkich próbkach dla określonego genu, aby potwierdzić obecność tylko jednego amplikonu i wartość amplifikacji większą niż 1,6, jeśli algorytm uważa 2 za 100% wartość amplifikacji (wartość amplifikacji zmienia się w zależności od algorytmu używanego przez maszynę qPCR). Upewnij się, że używasz przyrostów temperatury o 0,5 °C między krokami i minimalnego czasu utrzymywania 10 s w protokole krzywej topnienia, aby uzyskać optymalne wyniki.</li>
		<li>Po upewnieniu się, że istnieje pojedynczy amplikon i dobra wartość amplifikacji, najpierw kliknij kartę danych kwantyfikacji, aby uzyskać cykl ilościowy (wartość Ct/Cq) każdej próbki i wyeksportować ją do programu Microsoft Excel.</li>
		<li>Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, oblicz średnią z każdej próbki, używając wartości Ct. Następnie kliknij formuły i wybierz średnią. Średnie wartości CT każdej próbki (kontrpróby) są wykorzystywane do dalszej analizy.</li>
		<li>Następnie należy obliczyć ΔCt za pomocą wzoru ΔCt = średnia Ct genu docelowego - średnia Ct genu kontrolnego (w tym przypadku ΔCt = średnia Ct genu ZIKV - średnia Ct genu B2M).</li>
		<li>Obliczyć ΔΔCt, aby znormalizować dane (w tym przypadku ΔΔCt = ΔCt ZIKV próbki - próbki B2M).</li>
		<li>Oblicz ekspresję genu zwiększającego krotność, wpisując wzór 2^-(ΔΔCt) dla każdej znormalizowanej wartości ΔΔCt. Wyniki zwiększania krotności w celu przeprowadzenia testów statystycznych można uzyskać zgodnie z opisem we wcześniejszych badaniach9,10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hayes, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+outside+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus outside Africa.</a> Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).</li>
<li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+Gabon+%28Central+Africa%29+-+2007%3A+a+new+threat+from+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus in Gabon (Central Africa) - 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).</li>
<li>Fauci, A. S., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+in+the+Americas--Yet+Another+Arbovirus+Threat%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat.</a> New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).</li>
<li>Hawkes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+Infectivity+of+Arboviruses+by+Specific+Antisera+Produced+in+Domestic+Fowls%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Experimental+Biology+and+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls.</a> Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).</li>
<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 487-524 (2016).</li>
<li>Vaughn, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+viremia+titer%2C+antibody+response+pattern%2C+and+virus+serotype+correlate+with+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity.</a> The Journal of Infectious Diseases. 181 (1), 2-9 (2000).</li>
<li>Khandia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Dengue%2FZika+Virus+Pathogenicity+by+Antibody-Dependent+Enhancement+and+Strategies+to+Protect+Against+Enhancement+in+Zika+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection.</a> Frontiers of Immunology. 9, 597(2018).</li>
<li>Londono-Renteria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relevant+in+vitro+human+model+for+the+study+of+Zika+virus+antibody-dependent+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement.</a> Journal of General Virology. 98 (7), 1702-1712 (2017).</li>
<li>Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+base+method+for+analysis+of+qPCR+data+and+the+application+of+simple+blocking+in+qPCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 534(2017).</li>
<li>Renn, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+real-time+RT-PCR+assay+for+determining+expression+profiles+of+types+I+and+III+interferon+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52650(2015).</li>
<li>McArthur, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+vaccines%3A+recent+developments%2C+ongoing+challenges+and+current+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates.</a> Expert Review of Vaccines. 12 (8), 933-953 (2013).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+cross-reactivity+between+Zika+and+dengue+viruses%3A+implications+for+protection+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology.</a> Emerging Microbes and Infections. 6 (5), 33(2017).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+antibody-mediated+neutralization+and+protection+against+flavivirus%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus.</a> IUBMB Life. 68 (10), 783-791 (2016).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+Zika+Virus+Envelope+Protein+and+Its+Complex+with+a+Flavivirus+Broadly+Protective+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody.</a> Cell Host & Microbe. 19 (5), 696-704 (2016).</li>
<li>Sirohi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3.8+A+resolution+cryo-EM+structure+of+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus.</a> Science. 352 (6284), 467-470 (2016).</li>
<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+Exposure+to+Zika+Virus+Significantly+Enhances+Peak+Dengue-2+Viremia+in+Rhesus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> Journal of General Virology. 71, Pt 12 2909-2914 (1990).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
<li>Charles, A. S., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+a+Dengue-Derived+Monoclonal+Antibody+to+Enhance+Zika+Infection+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Currents%22%5BJournal%5D)">Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro.</a> PLoS Currents. 8, (2016).</li>
<li>Swanstrom, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Virus+Envelope+Dimer+Epitope+Monoclonal+Antibodies+Isolated+from+Dengue+Patients+Are+Protective+against+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Reaktywność krzyżowa przeciwciał DENV prowadząca do ADE innych serotypów DENV utrudniła opracowanie skutecznej szczepionki11. ZIKV należy do tej samej rodziny, Flaviviridae, i ma znaczną homologię z innymi flawiwirusami, zwłaszcza DENV12. Głównym celem przeciwciał neutralizujących zarówno dla ZIKV, jak i DENV jest białko otoczki, które ma bardzo wysoką homologię sekwencji strukturalnej i czwartorzędowej między tymi dwoma wirusami 13,14,15....

Wśród chorób wirusowych przenoszonych przez komary, zakażenie wirusem Zika jest jednym z najważniejszych klinicznie1. Infekcja jest wywoływana przez flawiwirusa ZIKV, który w większości przypadków wykorzystuje Aedes aegypti jako główny wektor1,2. Istnieją jednak badania, które wykazały, że Aedes albopictus jest głównym wektorem w niektórych epidemiach ZIKV 3. Chociaż w wielu przypadkach infekcja przebiega bezobjawowo, najczęstszymi objawami są gorączka, ból głowy i ból mięśni2. Nie ma lekarstwa ani szczepionki na zakażenie ZIKV, a dostępne leczenie ma w większości charakter wspomagający. Niedawne wybuchy epidemii ZIKV w Ameryce Południowej doprowadziły do ciężkich przypadków choroby i około 20-krotnego wzrostu zaburzeń neurorozwojowych u płodów o nazwie microcephaly2. Ponieważ Ameryka Południowa jest obszarem endemicznym dla kilku arbowirusów, takich jak DENV i wirus Zachodniego Nilu, kluczowe znaczenie ma zbadanie, czy wcześniejsza odporność na inne flawiwirusy odgrywa rolę w ciężkości zakażeń i choroby ZIKV.
Na przestrzeni wieków, wirusy rozwijały różne strategie, aby zwiększyć swoje szanse na zakaźność, aby przejąć maszynerię komórek gospodarza i stłumić odpowiedź przeciwwirusową. Jednym z najbardziej fascynujących jest wykorzystanie przez wirusy przeciwciał przedimmunologicznych gospodarza w celu zwiększenia ich replikacji za pomocą zjawiska ADE4. ADE we wszystkich czterech serotypach DENV zostało dobrze przebadane i wykazano, że zwiększa miana wirusa i wynik choroby5,6,7. W poprzednim badaniu in vitro wykazaliśmy znaczne zwiększenie replikacji ZIKV ze względu na istniejącą wcześniej odporność DENV w pierwotnych ludzkich komórkach odpornościowych8. Wykazaliśmy również odpowiednią metodę in vitro do ilościowego określenia zdolności istniejących wcześniej przeciwciał DENV do zwiększenia replikacji ZIKV w komórkach pierwotnych.
Protokół, który opracowaliśmy, wykorzystuje próbki ludzkiej surowicy, które są testowane pod kątem neutralizacji DENV w testach TCID-50 lub teście neutralizacji płytki nazębnej (PRNT), wraz z ZIKV w biologicznie istotnych komórkach lub komórkach pochodzących z tkanek, które ZIKV może zainfekować.

<table><tbody><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>GEMINI</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>iCycler&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>785BR02188</td><td>Nr modelu CFX96 Moduł optyczny</td></tr><tr><td>Wirówka Microfuge 18 Beckman</td><td>Coulter&nbsp;</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop-1000</td><td>Termonaukowy&nbsp;</td><td>1072</td><td></td></tr><tr><td>Jednoetapowy zestaw RT-PCR Quantifast SYBR&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>204154</td><td>Używany do 1-etapowego</td></tr><tr><td>zestawu do izolacji RNeasy RNeasy</td> RT-qPCR&nbsp;<td>Qiagen&nbsp;</td><td>74106</td><td>Służy do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>RPMI-medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa zika w pierwotnych komórkach ludzkich

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Niedawne pojawienie się flawiwirusa Zika i powikłań neurologicznych, takich jak zespół Guillaina-Barrégo i małogłowie u niemowląt, przyniosły poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa publicznego. Wśród czynników ryzyka największym zagrożeniem jest wzmocnienie zależne od przeciwciał (ADE), ponieważ niedawne ponowne pojawienie się wirusa Zika (ZIKV) ma miejsce przede wszystkim na obszarach, na które populacja była narażona i znajduje się w stanie preodporności na inne blisko spokrewnione flawiwirusy, zwłaszcza wirusa dengi (DENV). W tym miejscu opisujemy protokół ilościowego określania wpływu ludzkich przeciwciał surowicy przeciwko DENV na zakażenie ZIKV w pierwotnych komórkach ludzkich lub liniach komórkowych.

Na Rysunku 1 przedstawiono krok po kroku ilustrację diagramatyczną wszystkich etapów prowadzących do wykonania protokołu ADE. Jest to schematyczny rysunek pokazujący cały przebieg ADE wirusa ZIKV na tle istniejącej wcześniejszej odporności na DENV. Rysunek 2 przedstawia sposób podziału próbek surowicy ludzkiej na trzy różne grupy: próbki z potwierdzonym zakażeniem DENV określane są jako grupa zakażona DENV, próbki z potwierdzonym...

Opisujemy metodę oceny wpływu istniejącej wcześniej odporności na wirusa dengi na infekcję wirusem Zika za pomocą ludzkiej surowicy, pierwotnych komórek ludzkich i kwantyfikacji infekcji za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Metoda ta może być stosowana do oceny wpływu istniejącej wcześniej odporności przeciwko wirusowi dengi na zakażenie wirusem Zika, przy użyciu rzeczywistej surowicy ludzkiego pacjenta i pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych. Wykorzystanie rzeczywistych próbek surowicy ludzkiego pacjenta i ludzkich komórek pierwotnych zapewnia głębszy wgląd w zależne od przeciwciał wzmocnienie wirusa Zika przez surowice przedimmunologiczne i przeciwciała. Metoda ta dostarcza informacji na temat zdolności przeciwciał we krwi pacjenta do wzmacniania infekcji wirusowej w innych komórkach ludzkich.Ważne jest, aby upewnić się, że poziomy infekcji wirusowych są wystarczająco wysokie, aby można je było wykryć, ale wystarczająco niskie, aby nie przeciążyć komórek ani nie zakłócić interpretacji danych. Zacznij od wysiewu trzy razy dziesięć do czwartego komórek w 100 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych na dołek na sterylnej, 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Gdy wszystkie komórki zostaną posiaczone, umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia rozmrożonych próbek surowicy ludzkiej w pożywce wolnej od surowicy.Należy upewnić się, że rozcieńczenia surowicy i współczynnik rozcieńczenia są stałe dla wszystkich surowic przedimmunologicznych przed dodaniem rozcieńczeń do roztworów wirusa i komórek. Następnie rozmrozić roztwór podstawowy szczepów wirusa Zika w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch minut, a następnie szybko przenieść go do lodu. Dodać 0,1 wielokrotności objętości wirusa Zika równoważnej infekcji do podwielokrotności surowicy i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę, aby przeciwciała wirusa dengi mogły utworzyć kompleksy z wirionami Zika.Pod koniec inkubacji przemyj komórki 100 mikrolitrami PBS na studzienkę i dodaj 50 mikrolitrów kompleksu immunologicznego do każdej studzienki. Po dwugodzinnej inkubacji usuń pożywkę i umyj studzienki dwukrotnie 100 mikrolitrami PBS na studzienkę, aby całkowicie usunąć kompleksy immunologiczne i wszelkie nieprzyłączone wiriony. Następnie nakarm komórki 100 mikrolitrami na studzienkę pożywki do hodowli komórkowych uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą.Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 48 godzin. Dwa dni po zakażeniu umyj komórki dwa razy 100 mikrolitrami sterylnego PBS na studzienkę, a następnie dodaj 250 mikrolitrów buforu do lizy komórek z 10% beta merkaptoetanolem do każdej studzienki. Pipetować w górę i w dół co najmniej pięć razy z drapaniem, aby przyspieszyć proces lizy i przenieść lizaty komórkowe do sterylnych, oznakowanych probówek o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj równą objętość 70% etanolu do każdej probówki i pipetuj roztwór lizatu w górę iw dół cztery do pięciu razy. Gdy zawiesiny lizatu są klarowne, przenieś każdy roztwór do oznakowanych kolumn na bazie krzemionki w dwóch mililitrowych probówkach zbiorczych do odwirowania. Odrzucić przepływ, utrzymując kolumny w tych samych probówkach zbiorczych i dodać 700 mikrolitrów buforu płuczącego 1 do każdej kolumny w celu drugiego odwirowania.Po wyrzuceniu przepływu, przepłukać kolumny jeszcze dwa razy 500 mikrolitrami buforu do płukania po dwa na mycie. Po drugim umyciu przenieś kolumny do nowych dwumililitrowych probówek zbiorczych w celu ponownego odwirowania. Dodaj 30 mikrolitrów wody wolnej od RNaz o temperaturze 42 stopni Celsjusza do środka każdej kolumny w celu odwirowania i odzyskania wymytego RNA.W celu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym lub analizy QRTPCR dodaj jeden mikrolitr specyficznych dla genu starterów do przodu i do tyłu z 10 mikromolowych zapasów wraz z 0,25 mikrolitra mieszanki odwrotnej transkryptazy na reakcję. Należy pamiętać, że startery, które rozpoznają materiał genetyczny wirusa Zika, wykrywają geny wirusa i pozwalają na ilościowe określenie infekcji. Następnie dodaj 12,5 mikrolitra SYBR Green Mix, a następnie 25 mikrolitrów wody do każdej reakcji, dodając 15 mikrolitrów Master Mix do każdej studzienki 96-dołkowej płytki QPCR.W przypadku korzystania z mieszanki wzorcowej należy dodać 100 nanogramów próbki RNA do mieszanki i pipetować mieszankę główną do poszczególnych dołków płytki QRTPCR. Należy pamiętać, że próbki należy rozprowadzić w trzech egzemplarzach na tej samej płytce QRTPCR. Następnie uruchom próbki na ilościowej maszynie PCR zgodnie z parametrami przedstawionymi w tabeli.Kliknięcie zakładki krzywej topnienia w oprogramowaniu systemowym w celu monitorowania krzywej topnienia. Krzywa topnienia pokaże pojedynczy pik we wszystkich próbkach dla danego genu, aby potwierdzić obecność tylko jednego amplikonu. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy stosować przyrosty temperatury o 0,5 stopnia Celsjusza między krokami i minimalny czas utrzymywania wynoszący 10 sekund w protokole krzywej topnienia.Następnie kliknij kartę danych kwantyfikacji, aby uzyskać cykl ilościowy dla każdej próbki i wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy ilościowej. Próbki surowicy ludzkiej można podzielić na trzy różne grupy: próbki potwierdzone zakażeniem wirusem dengi, próbki potwierdzone przeciwciałami wirusa dengi oraz zdrowe surowice bez przeciwciał neutralizujących wirusa dengi lub RNA. Po 48 godzinach od zakażenia analiza QRTPCR wykazuje, że większość surowic zawierających przeciwciała wirusa dengi o serotypie od 1 do 4 jest w stanie zwiększyć replikację wirusa Zika na różnych poziomach.Największy wzrost miana wirusa Zika stwierdza się w makrofagach leczonych przeciwciałami serotypów 2 i 4 wirusa dengi zawierającymi surowice w porównaniu z serotypami 1 i 3, które wykazują stosunkowo niższą indukcję wirusa Zika. Ważne jest, aby utrzymywać sterylne środowisko, nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i zawsze przechowywać rozmrożone próbki surowicy wirusa i odczynniki QPCR na lodzie. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu zbadania zależnego od przeciwciał wzmocnienia innych flawiwirusów, takich jak wirus żółtej gorączki, wirus dengi lub wirus Zachodniego Nilu przy użyciu panelu surowicy pacjenta.Technika ta będzie bardzo przydatna do przeprowadzania przyszłych badań nad wzmocnieniem zależnym od przeciwciał w dziedzinie arbowirusów lub wirusologii. Odpowiedni poziom bezpieczeństwa biologicznego: przez cały czas należy stosować dwa środki ochrony osobistej, a wszystkie odpady wirusowe należy odkazić w 10% wybielaczu przez 30 minut przed usunięciem.

quantification-antibody-dependent-enhancement-zika-virus-primary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Ten film demonstruje test do pomiaru zależnego od przeciwciał wzmocnienia (ADE) infekcji wirusem dengi za pomocą surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika. Test wykorzystuje cząstki reporterowe wirusa dengi (RVP) kodujące zielone białko fluorescencyjne. Przeciwciała w surowicy przeciwko wirusowi Zika reagują krzyżowo z RVP, tworząc kompleks. Związane przeciwciała zwiększają wychwyt RVP przez komórki wyrażające receptor Fc, który jest wykrywany za pomocą cytometrii przepływowej.

Test in vitro w celu zbadania zależnego od przeciwciał wzmocnienia infekcji wirusowej

Wideo demonstruje test in vitro do badania interferonów o działaniu przeciwwirusowym przeciwko wirusowi Zika, ludzkiemu patogenowi. W komórce gospodarza wirus Zika ulega namnażaniu po internalizacji, infekując sąsiednie komórki i tworząc odrębne strefy lub blaszki wirusowe. Interferon typu I, działając jako środek przeciwwirusowy, hamuje namnażanie się wirusa, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się blaszek wirusowych w monowarstwie komórki gospodarza.

Test in vitro do badań przesiewowych interferonów jako silnych inhibitorów wzrostu wirusa Zika

Ten film pokazuje procedurę zakażenia ludzkich płodowych nerwowych komórek macierzystych wirusem Zika. Zainfekowane komórki mogą być wykorzystane do dalszych badań.

Zakażenie płodowymi neuronalnymi komórkami macierzystymi wirusem Zika

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Ten protokół opisuje odzyskiwanie zakaźnego wirusa Zika z dwuplazmidowego zakaźnego klonu cDNA.

Ratowanie i charakterystyka rekombinowanego wirusa z zakaźnego klonu wirusa Zika z Nowego Świata

Opisujemy prosty i łatwy protokół pomiaru zależnego od przeciwciał wzmocnienia infekcji przez surowicę rekonwalescencyjną wirusa Zika za pomocą Reporter Virus Particles.

Prosty test oparty na cytometrii przepływowej do określenia zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa dengi in vitro przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

Celem protokołu jest zademonstrowanie technik używanych do badania chorób wirusowych poprzez izolację i ilościowe określenie wirusa Zika z wielu narządów u myszy po zakażeniu.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Tutaj pokazujemy użycie komórkowej impedancji elektrycznej (CEI) jako bardzo łatwej i prostej metody badania infekcji wirusem Zika i jego replikacji w ludzkich komórkach w czasie rzeczywistym. Ponadto test CEI jest przydatny do oceny związków przeciwwirusowych.

Komórkowa platforma impedancji elektrycznej do oceny inhibitorów wirusa Zika w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę kwantyfikacji wzmocnienia zależnego od przeciwciał wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich przy użyciu ludzkiego surowicy i PCR w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia badanie wpływu uprzedniej odporności na dengę na zakażenie Ziką.

Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich

Przeglądaj więcej filmów