Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich

Metoda ta może być stosowana do oceny wpływu istniejącej wcześniej odporności przeciwko wirusowi dengi na zakażenie wirusem Zika, przy użyciu rzeczywistej surowicy ludzkiego pacjenta i pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych. Wykorzystanie rzeczywistych próbek surowicy ludzkiego pacjenta i ludzkich komórek pierwotnych zapewnia głębszy wgląd w zależne od przeciwciał wzmocnienie wirusa Zika przez surowice przedimmunologiczne i przeciwciała. Metoda ta dostarcza informacji na temat zdolności przeciwciał we krwi pacjenta do wzmacniania infekcji wirusowej w innych komórkach ludzkich.

Ważne jest, aby upewnić się, że poziomy infekcji wirusowych są wystarczająco wysokie, aby można je było wykryć, ale wystarczająco niskie, aby nie przeciążyć komórek ani nie zakłócić interpretacji danych. Zacznij od wysiewu trzy razy dziesięć do czwartego komórek w 100 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych na dołek na sterylnej, 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Gdy wszystkie komórki zostaną posiaczone, umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia rozmrożonych próbek surowicy ludzkiej w pożywce wolnej od surowicy.

Należy upewnić się, że rozcieńczenia surowicy i współczynnik rozcieńczenia są stałe dla wszystkich surowic przedimmunologicznych przed dodaniem rozcieńczeń do roztworów wirusa i komórek. Następnie rozmrozić roztwór podstawowy szczepów wirusa Zika w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch minut, a następnie szybko przenieść go do lodu. Dodać 0,1 wielokrotności objętości wirusa Zika równoważnej infekcji do podwielokrotności surowicy i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę, aby przeciwciała wirusa dengi mogły utworzyć kompleksy z wirionami Zika.

Pod koniec inkubacji przemyj komórki 100 mikrolitrami PBS na studzienkę i dodaj 50 mikrolitrów kompleksu immunologicznego do każdej studzienki. Po dwugodzinnej inkubacji usuń pożywkę i umyj studzienki dwukrotnie 100 mikrolitrami PBS na studzienkę, aby całkowicie usunąć kompleksy immunologiczne i wszelkie nieprzyłączone wiriony. Następnie nakarm komórki 100 mikrolitrami na studzienkę pożywki do hodowli komórkowych uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą.

Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 48 godzin. Dwa dni po zakażeniu umyj komórki dwa razy 100 mikrolitrami sterylnego PBS na studzienkę, a następnie dodaj 250 mikrolitrów buforu do lizy komórek z 10% beta merkaptoetanolem do każdej studzienki. Pipetować w górę i w dół co najmniej pięć razy z drapaniem, aby przyspieszyć proces lizy i przenieść lizaty komórkowe do sterylnych, oznakowanych probówek o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj równą objętość 70% etanolu do każdej probówki i pipetuj roztwór lizatu w górę iw dół cztery do pięciu razy. Gdy zawiesiny lizatu są klarowne, przenieś każdy roztwór do oznakowanych kolumn na bazie krzemionki w dwóch mililitrowych probówkach zbiorczych do odwirowania. Odrzucić przepływ, utrzymując kolumny w tych samych probówkach zbiorczych i dodać 700 mikrolitrów buforu płuczącego 1 do każdej kolumny w celu drugiego odwirowania.

Po wyrzuceniu przepływu, przepłukać kolumny jeszcze dwa razy 500 mikrolitrami buforu do płukania po dwa na mycie. Po drugim umyciu przenieś kolumny do nowych dwumililitrowych probówek zbiorczych w celu ponownego odwirowania. Dodaj 30 mikrolitrów wody wolnej od RNaz o temperaturze 42 stopni Celsjusza do środka każdej kolumny w celu odwirowania i odzyskania wymytego RNA.

W celu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym lub analizy QRTPCR dodaj jeden mikrolitr specyficznych dla genu starterów do przodu i do tyłu z 10 mikromolowych zapasów wraz z 0,25 mikrolitra mieszanki odwrotnej transkryptazy na reakcję. Należy pamiętać, że startery, które rozpoznają materiał genetyczny wirusa Zika, wykrywają geny wirusa i pozwalają na ilościowe określenie infekcji. Następnie dodaj 12,5 mikrolitra SYBR Green Mix, a następnie 25 mikrolitrów wody do każdej reakcji, dodając 15 mikrolitrów Master Mix do każdej studzienki 96-dołkowej płytki QPCR.

W przypadku korzystania z mieszanki wzorcowej należy dodać 100 nanogramów próbki RNA do mieszanki i pipetować mieszankę główną do poszczególnych dołków płytki QRTPCR. Należy pamiętać, że próbki należy rozprowadzić w trzech egzemplarzach na tej samej płytce QRTPCR. Następnie uruchom próbki na ilościowej maszynie PCR zgodnie z parametrami przedstawionymi w tabeli.

Kliknięcie zakładki krzywej topnienia w oprogramowaniu systemowym w celu monitorowania krzywej topnienia. Krzywa topnienia pokaże pojedynczy pik we wszystkich próbkach dla danego genu, aby potwierdzić obecność tylko jednego amplikonu. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy stosować przyrosty temperatury o 0,5 stopnia Celsjusza między krokami i minimalny czas utrzymywania wynoszący 10 sekund w protokole krzywej topnienia.

Następnie kliknij kartę danych kwantyfikacji, aby uzyskać cykl ilościowy dla każdej próbki i wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy ilościowej. Próbki surowicy ludzkiej można podzielić na trzy różne grupy: próbki potwierdzone zakażeniem wirusem dengi, próbki potwierdzone przeciwciałami wirusa dengi oraz zdrowe surowice bez przeciwciał neutralizujących wirusa dengi lub RNA. Po 48 godzinach od zakażenia analiza QRTPCR wykazuje, że większość surowic zawierających przeciwciała wirusa dengi o serotypie od 1 do 4 jest w stanie zwiększyć replikację wirusa Zika na różnych poziomach.

Największy wzrost miana wirusa Zika stwierdza się w makrofagach leczonych przeciwciałami serotypów 2 i 4 wirusa dengi zawierającymi surowice w porównaniu z serotypami 1 i 3, które wykazują stosunkowo niższą indukcję wirusa Zika. Ważne jest, aby utrzymywać sterylne środowisko, nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i zawsze przechowywać rozmrożone próbki surowicy wirusa i odczynniki QPCR na lodzie. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu zbadania zależnego od przeciwciał wzmocnienia innych flawiwirusów, takich jak wirus żółtej gorączki, wirus dengi lub wirus Zachodniego Nilu przy użyciu panelu surowicy pacjenta.

Technika ta będzie bardzo przydatna do przeprowadzania przyszłych badań nad wzmocnieniem zależnym od przeciwciał w dziedzinie arbowirusów lub wirusologii. Odpowiedni poziom bezpieczeństwa biologicznego: przez cały czas należy stosować dwa środki ochrony osobistej, a wszystkie odpady wirusowe należy odkazić w 10% wybielaczu przez 30 minut przed usunięciem.