Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie mikroskopii jako narzędzia do badania fagocytozy patogennego gatunku grzyba Cryptococcus neoformans przez jego środowiskowego drapieżnika amebę. Ten film szczegółowo opisuje protokół przygotowania kohodowli komórek kryptokokowych i ameb, które będę badał za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Informacje uzyskane przy użyciu tych technik mogą rzucić światło na zachowanie komórek kryptokokowych po internalizacji podczas infekcji.

Usunąć testowe szczepy grzybów na płytkach agarowych YPD. Inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zeskrob pętlę komórek z 48-godzinnej płytki i zaszczep je w 250-mililitrowej stożkowej kolbie zawierającej 100 mililitrów bulionu YNB, który jest uzupełniony 4% glukozą.

Inkubować kolbę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny na wytrząsarce obrotowej. Po 24-godzinnym okresie inkubacji policz komórki grzyba za pomocą hemocytometru i dostosuj liczbę komórek do miliona komórek na mililitr za pomocą fizjologicznego roztworu buforowego. Hoduj komórki ameba w bulionie glukozowym z ekstraktu drożdżowego peptonowego przez tydzień w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Policz komórki ameby za pomocą hemocytometru i dostosuj liczbę komórek do 10 milionów komórek na mililitr za pomocą świeżej sterylnej pożywki ATCC 712. Następnie wykonaj test żywotności za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Wskazane jest pracować z komórkami, które wykazują co najmniej 80% żywotności.

Dozować 200-mikrolitrową zawiesinę standaryzowanych komórek ameby do komór przylegającego szkiełka. Odczekaj dwie godziny, aby komórki przylgnęły do powierzchni w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Podczas gdy komórki ameby osiadają, wybarwić standaryzowane komórki kryptokokowe izotiocyjanianem fluoresceiny.

Delikatnie mieszaj komórki grzyba przez dwie godziny w temperaturze pokojowej i w ciemności. Dozować 200-mikrolitrową zawiesinę barwionych komórek kryptokokowych po umyciu do odpowiednich komór, które zawierają już komórki ameby. Przygotowaną kokulturę inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dodatkowe dwie godziny.

Pod koniec okresu komonetykulacji przemyj komory dwukrotnie PBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane komórki ameby, w tym niezinternalizowane komórki kryptokokowe. Odessać aldehyd glutarowy, który został użyty do utrwalenia komórek, i dwukrotnie umyć komorę PBS. Zdemontuj suwak komory.

Zobacz współhodowane komórki za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem. Aby uzupełnić powyższy test, wybarwić komórki kryptokokowe barwnikiem pHrodo, który selektywnie pozwala na odczyt komórek uwięzionych w wakuoli pokarmowej. Dozuj te wybarwione komórki do dołków czarnej, przylegającej płytki do mikromiareczkowania, która zawiera już nasiona komórek ameby.

Zmierz fluorescencję na czytniku mikropłytek, który może konwertować sygnały logarytmiczne na względne jednostki fluorescencji. Dodaj pięć mililitrów standaryzowanych komórek kryptokokowych do tej samej probówki wirówkowej, która zawiera już pięć mililitrów standaryzowanych komórek ameby. Pozostaw probówkę na dwie godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Odessać supernatant po odwirowaniu. Utrwalić osad, który reprezentuje współhodowane komórki, z jednym molem fosforanu sodu buforowanym 3% aldehydem glutarowym o pH 7 przez trzy godziny. Współhodowane komórki przemyć raz buforem fosforanu sodu.

Napraw ponownie przez 1 1/2 godziny w podobnie buforowanym 1% tetratlenku osmu, a następnie umyj. Odwodnić materiał TEM, znany również jako komórki z kohodowli, w stopniowanej serii acetonu 30%50%70%95% i 100% przez 15% każda. Tutaj powtórz ostatni krok odwodnienia w dwóch zmianach.

Przygotuj żywicę epoksydową, odważając żywicę epoksydową o normalnej konsystencji. Osadź materiał w żywicy epoksydowej. Polimeryzuj materiał TEM przez osiem godzin w temperaturze 70 stopni Celsjusza.

Wycinaj 16-nanometrowe odcinki za pomocą szklanych noży zamontowanych na ultratomie. Zabarwić skrawki octanem uranylu przez 10 minut w ciemności, a następnie cytrynianem ołowiu przez 10 minut, również w ciemności. Zobacz przekroje za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

W celach ilustracyjnych w filmie badane są dwa izolaty, jeden, który wytwarza 3-hydroksykwasy tłuszczowe, a drugi, który tego nie robi. 3-hydroksykwasy tłuszczowe są metabolitami wtórnymi, które nie odgrywają roli we wzroście komórek kryptokokowych. Oto migawki, które pokazują interaktywne chwile między Cryptococcus a amebami.

Do rzeczy, można zaobserwować komórkę kryptokokową przed i po internalizacji. Podczas badania fagocytozy idealnie nadaje się wykorzystanie obrazowania na żywo. Jednak nie zawsze jest możliwe, aby badacze mieli dostęp do takiego mikroskopu, aby stale śledzić proces fagocytozy.

Możliwym rozwiązaniem pozwalającym zniwelować to ograniczenie może być uzupełnienie obrazów danymi ilościowymi poprzez odczyt względnych jednostek fluorescencji. Wykres słupkowy to przykład danych, które wykorzystałem jako uzupełnienie obrazów. Co ważne, zarówno dane jakościowe w postaci obrazów, jak i dane ilościowe mogą być pobierane w różnych punktach czasowych na przestrzeni czasu.

Łącząc wszystkie informacje, można zacząć konstruować większy obraz tego, co dzieje się podczas procesu fagocytozy. Z danych ilościowych jasno wynika, że komórki z 3-hydroksykwasami tłuszczowymi są mniej podatne na działanie ameby w porównaniu z komórkami, które nie wytwarzają 3-hydroksykwasów tłuszczowych, ponieważ mniej komórek jest zinternalizowanych. TEM jest szczególnie potężnym narzędziem, ponieważ może dać widok z lotu ptaka na światło wakuoli pokarmowej ze względu na swoją wysoką rozdzielczość, a jest to rodzaj szczegółów, które często są pomijane podczas badania obrazowania na żywo, a także nieruchomych obrazów.

Na tym specyficznym mikrozdjęciu TEM wyraźnie widać wypukłości na powierzchni komórek kryptokokowych. Wcześniej teoretyzowano, że te struktury powierzchniowe komórek są kanałami, przez które 3-hydroksykwasy tłuszczowe są uwalniane do otaczającego środowiska. Do tego stopnia, że kanały te mogą pomóc w dostarczaniu 3-hydroksykwasów tłuszczowych do światła wakuoli pokarmowej ameb, aby zmienić warunki wewnętrzne, a tym samym promować przeżycie komórek.

pHrodo lub podobnie jak FITC może być znacznie lepszym barwnikiem do użycia, ponieważ fluoryzuje tylko przy niskim pH, na przykład wewnątrz wakuoli pokarmowej. Mówiąc dokładniej, pHrodo pozwala badaczowi jedynie na uzyskanie danych dotyczących zinternalizowanych komórek. W tym celu ważne jest, aby komórki były zawieszone w roztworze buforu fosforanowego przed barwieniem i aby pożywka amebowa miała neutralne pH.

Operatorzy transmisyjnych mikroskopów elektronowych muszą być dobrze przeszkoleni w zakresie prawidłowego cięcia, ponieważ często jest to punkt, w którym wyniki mogą być zniekształcone, a mikrografia uszkodzona przez bombardowanie elektronami. Przewiduje się, że naukowcy będą w stanie pobrać wystarczającą ilość informacji z przedstawionego protokołu i zoptymalizować je we własnych badaniach. Co więcej, naukowcy mogą również wytworzyć przeciwciała przeciwko docelowemu metabolitowi i zastosować je podczas badania mikroskopią immunofluorescencyjną, w tym znakowania immunozłotem podczas badania TEM.