Name: Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj metodę współkultury Cryptococcus neoformans z amebami w celu badania fagocytozy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i elektronowej. Technika ta pozwala zrozumieć mechanizmy infekcji grzybiczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta grantem z Narodowej Fundacji Badawczej Południowej Afryki (numer grantu: UID 87903) oraz Uniwersytetu Wolnego Państwa. Jesteśmy również wdzięczni za usługi i pomoc oferowaną przez Pietera van Wyka i Hanlie Grobler podczas naszych badań mikroskopowych.

Cryptococcus neoformans i niektóre szczepy Acanthamoeba castellanii są uważane za patogeny poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), dlatego badacze muszą podjąć odpowiednie środki ostrożności podczas pracy z tymi organizmami. Na przykład personel laboratoryjny powinien przejść specjalne szkolenie i posiadać środki ochrony osobistej (PPE), takie jak fartuchy laboratoryjne, rękawice i ochrona oczu. Szafa bezpieczeństwa biologicznego (poziom 2) powinna być używana do procedur, które mogą powodować infekcję14.
1. Hodowla i standaryzacja komórek grzybów (zmodyfikowana z Madu et al. 15 )
<ol>
	<li>Badane szczepy grzybów (tj. C. neoformans UOFS Y-1378 i C. neoformans LMPE 046) należy usunąć z kultur podstawowych (nie starszych niż 9 miesięcy) na płytkach agarowych z drożdżami, peptonem i dekstrozą (YPD). Informacje na temat składników agaru YPD można znaleźć w tabeli 1. 
	UWAGA: Wykazano, że C. neoformans UOFS Y-1378 wytwarza 3-hydroksykwasy tłuszczowe, podczas gdy C. neoformans LMPE 046 nie wytwarza 3-hydroksykwasów tłuszczowych. Patrz plik uzupełniający 1, aby uzyskać informacje na temat tego, w jaki sposób określa się obecność tych cząsteczek.</li>
	<li>Inkubować płytki agarowe przez 48 godzin w temperaturze 30 °C. 
	UWAGA: Płytka może być przechowywana do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C, zanim będzie można ją wyrzucić lub użyć do wytworzenia kultury podstawowej16.</li>
	<li>Zeskrobać pętlę pełną komórek kryptokokowych (C. neoformans UOFS Y-1378 lub C. neoformans LMPE 046) z płytki 48 h i zaszczepić w stożkowej kolbie o pojemności 250 ml zawierającej 100 ml chemicznie zdefiniowanego bulionu YNB (6,7 g / l) uzupełnionego o 4% (w/v) glukozy. Informacje o składnikach bulionu YNB znajdują się w tabeli 2.</li>
	<li>Inkubować kolby w temperaturze 30 °C przez 24 godziny, mieszając z prędkością 160 obr./min na wytrząsarce obrotowej.</li>
	<li>Po 24 godzinnym okresie inkubacji należy policzyć komórki grzyba za pomocą hemocytometru i dostosować liczbę komórek do 1 x 106 komórek/ml z PBS o pH 7,4, 
	UWAGA: Przygotowany inokulum C. neoformans UOFS Y-1378 użyto w krokach 3.1 i 3.2, podczas gdy inokulum C. neoformans LMPE 046 użyto tylko w kroku 3.2.</li>
</ol>
2. Hodowla i standaryzacja komórek ameby (zmodyfikowane z Madu et al. 15 )
<ol>
	<li>Rozmrozić kulturę Acanthamoeba castellanii i doprowadzić ją do temperatury pokojowej (RT). 
	UWAGA: Amoeba została przygotowana w oparciu o zmodyfikowane protokoły Axelsson-Olsson et al.8 oraz Schuster17.</li>
	<li>Pobrać pipetę o pojemności 1 ml rozmrożonej kultury i zaszczepić ją w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml pożywki ATCC 712. Informacje na temat składników ATCC medium 712 można znaleźć w Tabeli 3.</li>
	<li>Ręcznie delikatnie wstrząsnąć i natychmiast odwirować przez 5 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 15 ml pożywki ATCC 712 i inkubować probówkę w temperaturze 30 °C przez 14 dni. 
	UWAGA: Okresowo sprawdzaj komórki za pomocą prostego mikroskopu świetlnego, aby określić, czy są w stanie trofozoitowym. Gdy znajdą się w stanie trofozoitu, rozpocznij nową kulturę.</li>
	<li>Pobrać pipetę o pojemności 1 ml z hodowli, która pokazuje komórki w stanie trofozoitowym i użyć jej do zaszczepienia sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml świeżej, sterylnej pożywki ATCC 712.</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze 30 °C przez 1 tydzień, mieszając z prędkością 160 obr./min na wytrząsarce obrotowej.</li>
	<li>Po tygodniu policz komórki ameby za pomocą hemocytometru i ustaw liczbę komórek na 1 x 107 komórek/ml za pomocą świeżej, sterylnej pożywki ATCC 712.</li>
	<li>Wykonaj test żywotności przy użyciu niebieskiego barwnika trypanowego, zgodnie z opisem w Strober18. Kontynuuj z kulturami, które wykazują co najmniej 80% żywotności.</li>
</ol>
3. Barwienie fluorescencyjne komórek w celu zbadania fagocytozy (zmodyfikowane z Madu et al. 15 )
<ol>
	<li>Gromadzenie danych jakościowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego 
	UWAGA: Wykonaj ten test z Acanthamoeba castellanii i C. neoformans UOFS Y-1378.
	<ol>
		<li>Dozować 200 μl zawiesiny standaryzowanych ameb (1 x 10 7 komórek/ml w pożywce ATCC 712) do studzienek komory z przylegającym szkiełkiem i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 30 °C, aby komórki przylegały do powierzchni.</li>
		<li>Podczas gdy komórki ameby osiadają, aby przylegać, zabarwić standaryzowane komórki C. neoformans UOFS Y-1378, które zostały dostosowane do 1 x 106 komórek/ml (w 999 μl PBS) 1 μl izotiocyjanianu fluoresceiny w plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Przygotuj plamę, rozpuszczając 1 mg izotiocyjanianu fluoresceiny w 1 ml acetonu.</li>
		<li>Delikatnie mieszaj komórki C. neoformans UOFS Y-1378 na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 50 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i w ciemności.</li>
		<li>Po 2 godzinach odwirować przy 960 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Odessać supernatant w celu usunięcia PBS z barwnikiem.</li>
		<li>Dodać 1 ml PBS do probówki w celu przepłukania osadu komórkowego. Umyj komórki, delikatnie pipetując.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 960 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C. Odrzucić supernatant. Powtórz krok prania jeszcze raz.</li>
		<li>Ponownie zawiesić umyte komórki w 1 ml PBS.</li>
		<li>Dozować 200 μl zawiesiny barwionych komórek C. neoformans UOFS Y-1378 do studzienek komorowych zawierających niebarwione komórki ameby.</li>
		<li>Przygotowaną kokulturę inkubować w temperaturze 30 °C przez dodatkowe 2 godziny. 
		UWAGA: Współkultura może być inkubowana przez różne punkty czasowe, aby dopasować się do celu eksperymentu.</li>
		<li>Pod koniec okresu wspólnej inkubacji zassać zawartość studzienek.</li>
		<li>Dodać 300 μl PBS do studzienek, aby umyć studzienki komory i usunąć wszelkie niezwiązane współhodowane komórki. W tym celu należy delikatnie pipetować. Zassać zawartość studzienek. Powtórz krok prania jeszcze raz.</li>
		<li>Przygotować 3% roztwór aldehydu glutarowego, dodając 3 ml aldehydu glutarowego do 97 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Utrwalić współhodowane komórki, dodając 250 μl 3% roztworu do studzienek komory i inkubując przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zassać utrwalacz i umyć studzienki komory, jak opisano w kroku 3.1.13.</li>
		<li>Zdemontuj studzienki studzienki za pomocą narzędzia, które zostało dostarczone wraz ze zsuwami studzienki.</li>
		<li>Dodaj kroplę związku zapobiegającego blaknięciu, 1,4-diazabicyklo-[2.2.2]-oktanu do szkiełka, aby zapobiec samowybielaniu. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij boki lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu.</li>
		<li>Zobacz współhodowane komórki za pomocą soczewki obiektywowej 100x (z olejem) konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. 
		UWAGA: Ważne jest, aby robić zdjęcia w jasnym polu i fluorescencji, aby zobaczyć interakcję między amebą a komórkami kryptokoku. Tam, gdzie to możliwe, fluorescencja może być nakładana na obrazy w jasnym polu. Komórki ameby są zazwyczaj większe (tj. 45-60 μm), a komórki trofozoitu mają nieregularny kształt. Komórki kryptokokowe mają średnicę 5-10 μm i kształt od kulistego do jajowatego. Po wystawieniu na działanie lasera możliwe jest, że niebarwione komórki ameby mogą emitować autofluorescencję. Zapoznaj się z Beisker i Dolbeare19 oraz Clancy and Cauller20, aby zapoznać się z metodami redukcji autofluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie danych ilościowych za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych 
	UWAGA: Wykonaj ten test z Acanthamoeba castellanii i C. neoformans UOFS Y-1378 lub C. neoformans LMPE 046.
	<ol>
		<li>Dozować 100 μl zawiesiny standaryzowanych ameb (dostosowanych do 1 x 107 komórek/ml w pożywce ATCC 712) do czarnej, przylegającej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 30 °C, aby komórki ameby mogły przylgnąć do powierzchni.</li>
		<li>Podczas gdy komórki ameby osiadają, aby przylegać, wybarwić standaryzowane komórki C. neoformans UOFS Y-1378, które zostały dostosowane do 1 x 106 komórek/ml (w 999 μl PBS) za pomocą 1 μl pHrodo Green Zymosan A BioParticles w 1,5 ml probówce do mikrowirówki. Wybarwić komórki C. neoformans LMPE 046 również w osobnej probówce. 
		UWAGA: Barwnik, w przeciwieństwie do FITC, selektywnie barwi komórki, które są uwięzione w kwaśnym środowisku komórki fagocytarnej21,22. W przypadku tej techniki ważne jest, aby komórki kryptokokowe były utrzymywane w pożywce o neutralnym pH (PBS), a ameba w pożywce o neutralnym pH (pożywka ATCC 712). Pożywka o kwaśnym środowisku spowoduje fałszywie dodatni odczyt względnych jednostek fluorescencji, co oznacza, że większa liczba kryptokoków została zinternalizowana.</li>
		<li>Delikatnie mieszaj komórki kryptokokowe na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 50 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i w ciemności.</li>
		<li>Po 2 godzinach odwirować probówkę do mikrowirówek o sile 960 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C w celu osadzenia komórek. Odessać supernatant, aby usunąć PBS z barwnikiem.</li>
		<li>Dodaj 1 ml PBS do probówki, aby przepłukać granulowane komórki. Umyć komórki delikatnym pipetowaniem.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 960 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C. Odrzucić supernatant. Powtórz krok prania jeszcze raz.</li>
		<li>Zawiesić osad przemytych komórek w 1 ml PBS.</li>
		<li>Dozować 100 μl zawiesiny barwionych komórek kryptokokowych do studzienek zawierających niebarwione komórki ameby.</li>
		<li>Przygotowaną kokulturę inkubować w temperaturze 30 °C przez dodatkowe 2 godziny. 
		UWAGA: Współkultura może być inkubowana dla różnych punktów czasowych, aby dopasować się do celu eksperymentu.</li>
		<li>Pod koniec okresu wspólnej inkubacji zmierzyć fluorescencję na czytniku mikropłytek. Konwertuj sygnały logarytmiczne na względne jednostki fluorescencji. 
		UWAGA: Wzbudzenie barwnika wynosi 492 nm, a emisja 538 nm. Skonsultuj się z Beiskerem i Dolbeare19 oraz Clancy and Cauller20, aby dowiedzieć się o metodach redukcji autofluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wykorzystanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej do badania fagocytozy (zmodyfikowane z van Wyk i Wingfield 23 )
<ol>
	<li>Dodać 5 ml zawiesiny ameb (dostosowanej do 1 x 107 komórek/ml w pożywce ATCC 712) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozostawić na 30 minut w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Dodać 5 ml zawiesiny komórek C. neoformans UOFS Y-1378 (dostosowanych do 1 x 106 komórek/ml w PBS) do tej samej probówki wirówkowej, która zawiera 5 ml standaryzowanych komórek ameby.</li>
	<li>Odstawić probówkę na 2 godziny w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 640 x g przez 3 minuty w temperaturze 30 °C w celu osadzenia współhodowanych komórek. Odessać supernatant. Nie myj współhodowanych komórek.</li>
	<li>Utrwalić współhodowane komórki poprzez ponowne zawieszenie osadu w 3 ml 1,0 M (pH = 7,0) 3% aldehydu glutarowego buforowanego fosforanem sodu na 3 godziny.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 1,120 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C w celu osadzenia współhodowanych komórek. Odessać supernatant.</li>
	<li>Dodać 5 ml buforu fosforanu sodu do probówki wirówkowej, aby przepłukać granulowane komórki. Myć, delikatnie pipetując zawartość probówki przez 20 sekund.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 1,120 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C w celu osadzenia współhodowanych komórek.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.8-4.10. Odessać supernatant.</li>
	<li>Ponownie utrwalić współhodowane komórki, ponownie zawieszając osad w 3 ml 1,0 M (pH = 7,0) buforowanego 1% tetratlenkiem osmu z 1,0 M (pH = 7,0) na 1,5 godziny.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz (tetratlenek osmu) poprzez przemycie współhodowanych komórek w podobny sposób, jak w przypadku usunięcia 3% aldehydu glutarowego.</li>
	<li>Odwodnić materiał TEM (znany również jako komórki z kohodowlą) w stopniowanej serii acetonu odpowiednio 30%, 50%, 70%, 95% i dwóch przemianach po 100% przez 15 minut każda. W tym celu dodaj 3 ml roztworu acetonu do granulowanych komórek i odstaw na 15 minut. Następnie odwirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej Odrzucić supernatant i dodać większą zawartość procentową roztworu acetonu.</li>
	<li>Przygotuj żywicę epoksydową o normalnej konsystencji zgodnie z protokołem Spur24. 
	UWAGA: Żywica epoksydowa służy do cięcia.</li>
	<li>Osadź materiał TEM w świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Dodać 3 ml świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej do probówki zawierającej materiał TEM zawieszony w 3 ml 100% roztworu acetonu. Odstawić probówkę na 1 godzinę.</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Odessać roztwór epoksydowo-acetonowy.</li>
		<li>Dodaj 6 ml świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej do granulki w probówce. Odstawić probówkę na 1 godzinę.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Odessać cały roztwór epoksydowo-acetonowy.</li>
		<li>Dodaj 3 ml świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej do probówki. Odstawić probówkę na 8 godzin.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Odessać cały roztwór epoksydowy</li>
		<li>Dodaj 3 ml świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej do probówki. Materiał TEM należy przechowywać przez noc w roztworze epoksydowym w eksykatorze próżniowym. 
		UWAGA: Żywica epoksydowa jest materiałem radioaktywnym. Do obchodzenia się z żywicą epoksydową należy używać środków ochrony indywidualnej. Z żywicą epoksydową należy również obchodzić się w dygestorium. Badacze powinni przestrzegać przepisów bezpieczeństwa dotyczących wyrzucania takich materiałów, określonych przez każdy kraj25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polimeryzować materiał TEM przez 8 godzin w temperaturze 70 °C.</li>
	<li>Na ultramikrotomie należy przyciąć małe odcinki o wymiarach około 0,1 mm x 0,1 mm i grubości 60 nm z materiału osadzonego w żywicy epoksydowej za pomocą zamontowanego noża do szkła. Zmontuj sekcje na siatce i umieść je w pudełku z uchwytem na próbki TEM przed barwieniem.</li>
	<li>Zabarwić skrawki kroplą 6% octanu uranylu przez 10 minut w ciemności. Upewnij się, że sekcje są całkowicie zakryte.| 
	UWAGA: Rozpuść plamę (6 g) w 100 ml wody destylowanej. 
	UWAGA: Octan uranylu jest materiałem radioaktywnym. Używaj środków ochrony indywidualnej do obchodzenia się z octanem uranylu. Octan uranylu powinien być również przenoszony w dygestorium. Badacze powinni przestrzegać przepisów bezpieczeństwa dotyczących wyrzucania takich materiałów, określonych przez każdy kraj25.</li>
	<li>Opłucz sekcje, zanurzając je pięć razy w zlewce zawierającej 100 ml wody destylowanej. 
	UWAGA: Wodę destylowaną należy odpowiednio zutylizować, ponieważ zawiera śladowe ilości octanu uranylu.</li>
	<li>Zabarwić sekcję kroplą cytrynianu ołowiu przez 10 minut w ciemności. Upewnij się, że sekcje są całkowicie zakryte. 
	UWAGA: Cytrynian ołowiu powinien być przygotowany zgodnie z protokołem Reynold26.</li>
	<li>Opłucz sekcje, zanurzając je pięć razy w zlewce zawierającej 100 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Indywidualnie zmontuj kratki z poplamionymi sekcjami na pudełku z uchwytem na próbki TEM.</li>
	<li>Oglądaj przekroje z transmisyjnym mikroskopem elektronowym.</li>
</ol>

<ol><li>Barton, L. L., Northup, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarton%2C+LL+%22Microbial+Ecology%22">Microbial Ecology</a>. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).</li>
<li>Hunter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entente+cordiale%3A+multiple+symbiosis+illustrates+the+intricate+interconnectivity+of+nature%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature.</a> EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).</li>
<li>Comolli, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+inter-species+interactions+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intra- and inter-species interactions in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. , e629(2014).</li>
<li>Siddiqui, R., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+is+an+evolutionary+ancestor+of+macrophages%3A+a+myth+or+reality%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?</a> Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).</li>
<li>Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhan%2C+NA+%22Acanthamoeba%3A+Biology+and+Pathogenesis%22">Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis</a>. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).</li>
<li>Steenbergen, J. N., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+maintenance+of+virulence+for+the+human+pathogenic+fungus+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans.</a> Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).</li>
<li>Casadevall, A., Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCasadevall%2C+A+%22Cryptococcus+Neoformans%22">Cryptococcus Neoformans</a>. , ASM Press. Washington D.C. (1998).</li>
<li>Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+long+term+storage+of+Acanthamoeba+species%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method for long term storage of Acanthamoeba species.</a> Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).</li>
<li>Sebolai, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Hydroxy+fatty+acids+found+in+capsules+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans.</a> Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).</li>
<li>Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+acetylsalicylic+acid+on+oxylipin+migration+in+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+UOFS+Y-1378%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378.</a> Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).</li>
<li>Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+and+believing%3A+recent+advances+in+imaging+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions.</a> F1000 Research. , e6435.1(2015).</li>
<li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing+-+multiscale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).</li>
<li>Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+video+microscopy+of+fungal+pathogen+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50196(2013).</li>
<li>Duane, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+implementing+a+BLS-2%2B+biosafety+program+in+a+research+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biosafety%22%5BJournal%5D)">A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory.</a> Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).</li>
<li>Madu, U. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcal+3-hydroxy+fatty+acids+protect+cells+against+amoebal+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis.</a> Frontiers in Microbiology. , e1351(2015).</li>
<li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+D+%22The+Preservation+and+Maintenance+of+Living+Fungi%3A+IMI+Technical+Handbooks+No.+2%22">The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2</a>. , CAB International. Wallington. (1994).</li>
<li>Schuster, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+pathogenic+and+opportunistic+free-living+amebas%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).</li>
<li>Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high+sensitivity+dectection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Clancy, B., Cauller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+sections+following+immersion+in+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride.</a> Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).</li>
<li>Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytosis+and+of+phagosomal+environment+in+polymorphonuclear+phagocytes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).</li>
<li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+Imaging+of+pH+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsinCellBiology%22%5BJournal%5D)">Ratiometric Imaging of pH Probes.</a> MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).</li>
<li>van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascospores+ultrastructure+and+development+in+Ophiostoma+cucullatum%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum.</a> Mycologia. 83, 698-707 (1991).</li>
<li>Spur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+viscosity+epoxy+resin+embedding+medium+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastructural+Research%22%5BJournal%5D)">A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy.</a> Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).</li>
<li>Department of Minerals and Energy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Radioactive+Waste+Management+Policy+and+Strategy+for+the+Republic+of+South+Africa%22">Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa</a>. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).</li>
<li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Cell Biology. 17, 208-212 (1963).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%2C+5th+edition%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition</a>. , Garland Science. New York. (2001).</li>
<li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).</li>
<li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcusneoformans+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).</li>
<li>Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+role+of+3-hydroxy+fatty+acids+in+Cryptococcus-amoeba+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions.</a> Frontiers in Microbiology. , e765(2017).</li>
<li>Hayes, B. K., Heit, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayes%2C+BK+%22Inductive+reasoning+2.0%22">Inductive reasoning 2.0</a>. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459(2018).</li>
<li>Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence-based+methods+to+determine+nanoparticle+uptake+by+phagocytes+and+non-phagocytic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro.</a> Toxicology. 378, 25-36 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule z powodzeniem zastosowano różne techniki, aby ujawnić możliwy wynik, który może wystąpić, gdy ameba wchodzi w interakcję z komórkami kryptokoki. Byliśmy również zainteresowani pokazaniem wpływu 3-hydroksykwasów tłuszczowych na wynik interakcji Cryptococcus-ameba.
Pierwszą zastosowaną techniką była mikroskopia konfokalna, która pozwalała na renderowanie nieruchomych obrazów. Główną wadą tej techniki było to, że dawała nam tylko informacje, które są ograniczone do określonego...

Mikroby ewoluowały z biegiem czasu, aby zajmować i rozwijać się w różnych niszach ekologicznych, takich jak otwarte fizyczne granice gleby i wody, między innymi1. W tych niszach mikroorganizmy często angażują się w bezpośrednią konkurencję o ograniczone zasoby; Co ważne, w przypadku składników odżywczych, których używają do wspierania swojego wzrostu lub przestrzeni, których potrzebują, aby pomieścić rosnącą populację2,3. W niektórych przypadkach niektóre organizmy holozoiczne, takie jak ameba, mogą nawet żerować na komórkach kryptokokowych jako sposób na ekstrakcję składników odżywczych z ich biomasy4,5. To z kolei pozwala takim organizmom na ustanowienie dominacji terytorialnej poprzez kontrolowanie liczebności populacji swojej ofiary. Ze względu na tę drapieżną presję, niektóre ofiary mogą zostać wybrane do produkcji czynników mikrobiologicznych, takich jak kapsułka kryptokokowa 6, aby pogodzić negatywne skutki presji. Jednak niezamierzoną konsekwencją tej presji jest to, że niektóre mikroorganizmy nabywają czynniki, które pozwalają im przekroczyć barierę gatunkową i szukać nowych nisz do kolonizacji7, takich jak zamknięte przestrzenie ludzkiego ciała, które są bogate w składniki odżywcze i mają idealne warunki. To ostatnie może wyjaśniać, w jaki sposób mikrob lądowy, taki jak Cryptococcus (C.) Nowotwory mogą przekształcać się w patogenne. 
W tym celu ważne jest zbadanie początkowego kontaktu, jaki komórki kryptokokowe mogą mieć z amebą i jak to może je selekcjonować do stania się patogennymi. Mówiąc dokładniej, może to dać wskazówki na temat tego, jak zachowują się komórki kryptokokowe, gdy działają na nie makrofagi podczas infekcji. Z tego powodu ameba została wybrana jako model dla makrofagów, ponieważ jest stosunkowo tania i łatwa do utrzymania hodowla ameby w laboratorium8. Interesujące było również zbadanie, w jaki sposób wtórne metabolity kryptokokowe, tj. 3-hydroksykwasy tłuszczowe<klasa sup='xref'>9,<klasa sup='xref'>10 wpływają na interakcję między amebami a komórkami kryptokoki.
Prostym sposobem na dostrzeżenie interakcji między amebą a jej ofiarą gołym okiem jest stworzenie trawnika z wykorzystaniem zdobyczy na powierzchni płytki agarowej i plamki ameby. Wizualizacja blaszek lub przezroczystych stref na płytce agarowej przedstawia obszary, w których ameba mogła żywić się swoją zdobyczą. Jednak na tym poziomie makro odnotowuje się tylko wynik procesu i nie można zaobserwować procesu fagocytozy zmechanizowanej. Dlatego, aby docenić ten proces na podstawie komórki, istnieje kilka mikroskopijnych metod, które można zastosować11,12. Na przykład, odwrócony mikroskop z komorą inkubacyjną może być użyty do nagrania wideo poklatkowego zdarzeń między komórką fagocytarną a jej celem13. Niestety, ze względu na koszt mikroskopu z funkcją poklatkową, laboratoria nie zawsze mają możliwość zakupu takiego mikroskopu, zwłaszcza w warunkach ubogich w zasoby. 
Aby obejść powyższe ograniczenie, to badanie przedstawia sekwencyjny projekt eksploracyjny, który ocenia interakcję C. neoformans, tj. C. neoformans UOFS Y-1378 i C. neoformans LMPE 046 z Acanthamoeba castellani. Po pierwsze, stosuje się metodę jakościową, która poprzedza metodę ilościową. Nieruchome obrazy są rejestrowane za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, a także transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby zobrazować interakcje ameba-Cryptococcus. Następnie przeprowadzono ilościowe określenie fluorescencji za pomocą czytnika płytek w celu oszacowania skuteczności ameby w internalizacji komórek kryptokokowych. Uzgadnianie wyników tych metod na etapie interpretacji danych może w równym stopniu ujawnić tyle samo krytycznych informacji, co oglądanie filmu poklatkowego z fagocytozą.

<table><tbody><tr><td>1,4-diazabicyklo-[2.2.2]-oktanowa</td><td>plastikowa tubka Sigma-Aldrich</td><td>D27802-1,5</td><td></td></tr> <tr><td>ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69715-15-mL</td><td></td></tr> <tr><td>Probówka wirówkowa&nbsp;</td>Probówka wirówkowa <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>7252018-50 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1132017-8-Well zjeżdżalnia komorowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> <td>1109650-Aceton</td></tr> <tr><td></td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SAAR1022040LC-Amoeba szczep</td><td>ATCC&Ograve; </td><td>30234TM</td><td>-</td></tr><tr><td>ATCC średni 712</td><td>ATCC&Ograve; </td><td>712TM</td><td>Amoeba medium</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>152089-Wirówka</td><td>Hermle</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432-Mikroskop</td><td></td></tr> <tr><td>konfokalny</td><td>Nikon</td><td>Nikon TE 2000-Żywica</td><td></td></tr> <tr><td>epoksydowa:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1] NSA</td><td>[1] ALS[</td><td>1] R1054</td><td>-</td></tr><tr><td>[2] DER 736</td><td>[2] ALS</td><td>[2] R1073</td><td>-</td></tr><tr><td>[3] Żywica ERL Y221</td><td>[3] ALS[</td><td>3] R1047R</td><td>-</td></tr><tr><td>[4] S1 (2-dimetyloaminoetanol)</td><td>[4] ALS&nbsp;</td><td>[4] R1067-Izotiocyjanian</td><td></td></tr> <tr><td>fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274-Kwas</td><td></td></tr> <tr><td>mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>489441-Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>374-91038C</td><td>Czytnik mikropłytek</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-Aldehyd</td><td></td></tr> <tr><td>glutarowy</td><td>ALS</td><td>R1009</td><td>-</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Boeco</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu</td><td>ALS</td><td>R1209-Chromatografia</td><td></td></tr> <tr><td>cieczowa Spektrometr masowy</td><td>Thermo Fisher</td> <td>Scientific-Methanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R 34,860-Wytrząsarka</td><td></td></tr> <tr><td>orbitalna</td><td>Lasec&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>ALS</td><td>R1015-pHrodo</td><td></td></tr> <tr><td>Green Zymosan A BioParticles</td><td>Life Technologies</td><td>P35365</td><td>Jest to barwnik wrażliwy na pH</td></tr><tr><td>Fizjologiczny roztwór buforowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB-Wytrząsarka</td><td></td></tr> <tr><td>obrotowa</td><td>Labcon</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Bufor fosforanu sodu:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1] Wodoroortofosforan sodu dwuwodny&nbsp;</td><td>[1] Merck</td><td>[1] 106580</td><td>-</td></tr><tr><td>[2] di-wodorortofosforan sodu dwuwodny</td><td>[2] Merck&nbsp;</td><td>[2] 106345</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Philips</td><td>Philips EM 100&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-Ultramikrotom</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Leica</td><td>EM UC7-Octan</td><td></td></tr> <tr><td>uranylu</td><td>ALS</td><td>R1260A-Eksykator</td><td></td></tr> <tr><td>próżniowy</td><td>Lasec&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Fiolka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29651-U-YNB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Lasec&nbsp;</td><td>239210-YPD</td><td></td></tr> <tr><td>agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y-1500</td><td>-</td></tr></tbody></table>

komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Aby symulować infekcję Cryptococcus, ameba, która jest naturalnym drapieżnikiem komórek kryptokokowych w środowisku, może być używana jako model dla makrofagów. Ten drapieżny organizm, podobny do makrofagów, wykorzystuje fagocytozę do zabijania zinternalizowanych komórek. Za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego rejestrowane są obrazy przedstawiające interaktywne momenty między komórkami kryptokokowymi a amebą. Moc rozdzielcza mikroskopu elektronowego pomaga również ujawnić ultrastrukturalne szczegóły komórek kryptokokowych uwięzionych w wakuoli pokarmowej ameby. Ponieważ fagocytoza jest procesem ciągłym, dane ilościowe są następnie integrowane z analizą, aby wyjaśnić, co dzieje się w momencie, gdy obraz jest rejestrowany. Mówiąc dokładniej, względne jednostki fluorescencji są odczytywane w celu ilościowego określenia skuteczności ameby w internalizacji komórek kryptokokowych. W tym celu komórki kryptokokowe są barwione barwnikiem, który sprawia, że fluoryzują po uwięzieniu w kwaśnym środowisku wakuoli pokarmowej. Wykorzystane razem, informacje zebrane za pomocą takich technik mogą dostarczyć krytycznych informacji, które pomogą wyciągnąć wnioski na temat zachowania i losu komórek po internalizacji przez amebę i, być może, przez inne komórki fagocytarne.

Mikroby to organizmy mikroskopijne, których nie można dostrzec gołym okiem. Ich oddziaływanie może jednak prowadzić do wystąpienia obserwowalnych klinicznie chorób, takich jak zakażenia skóry. Podczas badania określonych aspektów mikrobów, od ich morfologii, przez produkty przemiany materii, aż po interakcje, kluczowe znaczenie ma możliwość przedstawienia dowodów w formie obrazów i nagrań wideo.
W pierwszej kolejności podjęto pr...

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie mikroskopii jako narzędzia do badania fagocytozy patogennego gatunku grzyba Cryptococcus neoformans przez jego środowiskowego drapieżnika amebę. Ten film szczegółowo opisuje protokół przygotowania kohodowli komórek kryptokokowych i ameb, które będę badał za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Informacje uzyskane przy użyciu tych technik mogą rzucić światło na zachowanie komórek kryptokokowych po internalizacji podczas infekcji.Usunąć testowe szczepy grzybów na płytkach agarowych YPD. Inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zeskrob pętlę komórek z 48-godzinnej płytki i zaszczep je w 250-mililitrowej stożkowej kolbie zawierającej 100 mililitrów bulionu YNB, który jest uzupełniony 4% glukozą.Inkubować kolbę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny na wytrząsarce obrotowej. Po 24-godzinnym okresie inkubacji policz komórki grzyba za pomocą hemocytometru i dostosuj liczbę komórek do miliona komórek na mililitr za pomocą fizjologicznego roztworu buforowego. Hoduj komórki ameba w bulionie glukozowym z ekstraktu drożdżowego peptonowego przez tydzień w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Policz komórki ameby za pomocą hemocytometru i dostosuj liczbę komórek do 10 milionów komórek na mililitr za pomocą świeżej sterylnej pożywki ATCC 712. Następnie wykonaj test żywotności za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Wskazane jest pracować z komórkami, które wykazują co najmniej 80% żywotności.Dozować 200-mikrolitrową zawiesinę standaryzowanych komórek ameby do komór przylegającego szkiełka. Odczekaj dwie godziny, aby komórki przylgnęły do powierzchni w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Podczas gdy komórki ameby osiadają, wybarwić standaryzowane komórki kryptokokowe izotiocyjanianem fluoresceiny.Delikatnie mieszaj komórki grzyba przez dwie godziny w temperaturze pokojowej i w ciemności. Dozować 200-mikrolitrową zawiesinę barwionych komórek kryptokokowych po umyciu do odpowiednich komór, które zawierają już komórki ameby. Przygotowaną kokulturę inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dodatkowe dwie godziny.Pod koniec okresu komonetykulacji przemyj komory dwukrotnie PBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane komórki ameby, w tym niezinternalizowane komórki kryptokokowe. Odessać aldehyd glutarowy, który został użyty do utrwalenia komórek, i dwukrotnie umyć komorę PBS. Zdemontuj suwak komory.Zobacz współhodowane komórki za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem. Aby uzupełnić powyższy test, wybarwić komórki kryptokokowe barwnikiem pHrodo, który selektywnie pozwala na odczyt komórek uwięzionych w wakuoli pokarmowej. Dozuj te wybarwione komórki do dołków czarnej, przylegającej płytki do mikromiareczkowania, która zawiera już nasiona komórek ameby.Zmierz fluorescencję na czytniku mikropłytek, który może konwertować sygnały logarytmiczne na względne jednostki fluorescencji. Dodaj pięć mililitrów standaryzowanych komórek kryptokokowych do tej samej probówki wirówkowej, która zawiera już pięć mililitrów standaryzowanych komórek ameby. Pozostaw probówkę na dwie godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Odessać supernatant po odwirowaniu. Utrwalić osad, który reprezentuje współhodowane komórki, z jednym molem fosforanu sodu buforowanym 3% aldehydem glutarowym o pH 7 przez trzy godziny. Współhodowane komórki przemyć raz buforem fosforanu sodu.Napraw ponownie przez 1 1/2 godziny w podobnie buforowanym 1% tetratlenku osmu, a następnie umyj. Odwodnić materiał TEM, znany również jako komórki z kohodowli, w stopniowanej serii acetonu 30%50%70%95% i 100% przez 15% każda. Tutaj powtórz ostatni krok odwodnienia w dwóch zmianach.Przygotuj żywicę epoksydową, odważając żywicę epoksydową o normalnej konsystencji. Osadź materiał w żywicy epoksydowej. Polimeryzuj materiał TEM przez osiem godzin w temperaturze 70 stopni Celsjusza.Wycinaj 16-nanometrowe odcinki za pomocą szklanych noży zamontowanych na ultratomie. Zabarwić skrawki octanem uranylu przez 10 minut w ciemności, a następnie cytrynianem ołowiu przez 10 minut, również w ciemności. Zobacz przekroje za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.W celach ilustracyjnych w filmie badane są dwa izolaty, jeden, który wytwarza 3-hydroksykwasy tłuszczowe, a drugi, który tego nie robi. 3-hydroksykwasy tłuszczowe są metabolitami wtórnymi, które nie odgrywają roli we wzroście komórek kryptokokowych. Oto migawki, które pokazują interaktywne chwile między Cryptococcus a amebami.Do rzeczy, można zaobserwować komórkę kryptokokową przed i po internalizacji. Podczas badania fagocytozy idealnie nadaje się wykorzystanie obrazowania na żywo. Jednak nie zawsze jest możliwe, aby badacze mieli dostęp do takiego mikroskopu, aby stale śledzić proces fagocytozy.Możliwym rozwiązaniem pozwalającym zniwelować to ograniczenie może być uzupełnienie obrazów danymi ilościowymi poprzez odczyt względnych jednostek fluorescencji. Wykres słupkowy to przykład danych, które wykorzystałem jako uzupełnienie obrazów. Co ważne, zarówno dane jakościowe w postaci obrazów, jak i dane ilościowe mogą być pobierane w różnych punktach czasowych na przestrzeni czasu.Łącząc wszystkie informacje, można zacząć konstruować większy obraz tego, co dzieje się podczas procesu fagocytozy. Z danych ilościowych jasno wynika, że komórki z 3-hydroksykwasami tłuszczowymi są mniej podatne na działanie ameby w porównaniu z komórkami, które nie wytwarzają 3-hydroksykwasów tłuszczowych, ponieważ mniej komórek jest zinternalizowanych. TEM jest szczególnie potężnym narzędziem, ponieważ może dać widok z lotu ptaka na światło wakuoli pokarmowej ze względu na swoją wysoką rozdzielczość, a jest to rodzaj szczegółów, które często są pomijane podczas badania obrazowania na żywo, a także nieruchomych obrazów.Na tym specyficznym mikrozdjęciu TEM wyraźnie widać wypukłości na powierzchni komórek kryptokokowych. Wcześniej teoretyzowano, że te struktury powierzchniowe komórek są kanałami, przez które 3-hydroksykwasy tłuszczowe są uwalniane do otaczającego środowiska. Do tego stopnia, że kanały te mogą pomóc w dostarczaniu 3-hydroksykwasów tłuszczowych do światła wakuoli pokarmowej ameb, aby zmienić warunki wewnętrzne, a tym samym promować przeżycie komórek.pHrodo lub podobnie jak FITC może być znacznie lepszym barwnikiem do użycia, ponieważ fluoryzuje tylko przy niskim pH, na przykład wewnątrz wakuoli pokarmowej. Mówiąc dokładniej, pHrodo pozwala badaczowi jedynie na uzyskanie danych dotyczących zinternalizowanych komórek. W tym celu ważne jest, aby komórki były zawieszone w roztworze buforu fosforanowego przed barwieniem i aby pożywka amebowa miała neutralne pH.Operatorzy transmisyjnych mikroskopów elektronowych muszą być dobrze przeszkoleni w zakresie prawidłowego cięcia, ponieważ często jest to punkt, w którym wyniki mogą być zniekształcone, a mikrografia uszkodzona przez bombardowanie elektronami. Przewiduje się, że naukowcy będą w stanie pobrać wystarczającą ilość informacji z przedstawionego protokołu i zoptymalizować je we własnych badaniach. Co więcej, naukowcy mogą również wytworzyć przeciwciała przeciwko docelowemu metabolitowi i zastosować je podczas badania mikroskopią immunofluorescencyjną, w tym znakowania immunozłotem podczas badania TEM.

complementary-use-microscopic-techniques-fluorescence-reading

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Poznaj metodę współkultury Cryptococcus neoformans z amebami w celu badania fagocytozy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i elektronowej. Technika ta pozwala zrozumieć mechanizmy infekcji grzybiczych.

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Przeglądaj więcej filmów