Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Nasza metoda pobierania komórek naskórka od dorosłych myszy jest przydatna w dalszych zastosowaniach, takich jak komórki macierzyste keratynocytów. Nasza technika jest wysoce powtarzalna i może być stosowana w połączeniu z procedurami in vivo na myszach w kontekście modelu kancerogenezy skóry. Po pobraniu próbek skóry grzbietowej od uśpionych dorosłych myszy, użyj autoklawizowanych kleszczy i skalpela, aby umieścić jedną skórę grzbietową na raz owłosioną stroną do dołu na cienkiej szalce Petriego i zeskrobać tkankę podskórną, w tym tłuszcz, z brzusznej tkanki skórnej, aż tkanka stanie się półprzezroczysta.

Umieść zeskrobaną skórkę w PBS, aż wszystkie pozostałe skórki zostaną przetworzone. Następnie za pomocą skalpela pokrój próbki skóry na paski o wymiarach 0,5 na jeden do 1,5 centymetra. Umieść paski owłosioną stroną do góry na sterylnej szalce Petriego, a następnie uniesiono próbki owłosioną stroną do góry na powierzchni 20 mililitrów PBS plus dwa x roztwór gentamycyny, uzupełniony 0,25% trypsyną na plastikowej szalce Petriego o wymiarach 100 na 20 milimetrów przez dwie godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji umieść sterylną, plastikową, kwadratową szalkę Petriego zawierającą 15 mililitrów pożywki do zbioru pod kątem 30 stopni i użyj zakrzywionych kleszczy, aby ostrożnie przenieść pływający pasek skóry do naczynia. Trzymając nowe ostrze skalpela pod kątem prostopadłym do skóry i używając wystarczającej, ale nie nadmiernej siły, zeskrobać naskórek i włoski z próbki do podłoża. Po zeskrobaniu wszystkich pasków, ostrożnie zdekantuj komórkę naskórka zawierającą supernatant do sterylnego 60-mililitrowego słoika zawierającego 1,5-calową magnetyczną mieszadło i przepłucz szalkę Petriego dodatkowym podłożem do zbierania, aby zebrać pozostałe komórki naskórka.

Doprowadź końcową objętość w słoiku do 30 mililitrów świeżą pożywką i mieszaj roztwór komórek naskórka z prędkością 100 obrotów na minutę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji z mieszaniem w komorze bezpieczeństwa biologicznego wyjmij mieszadło i przefiltruj roztwór komórkowy przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Użyj kleszczy, a następnie pipety, aby przecisnąć włosy i materiały warstwy rogowej naskórka przez sitko, aby manipulować tkanką w celu uwolnienia uwięzionych komórek rzęsatych i użyj dodatkowych pięciu mililitrów pożywki do pobrania, aby uwolnić pozostałe uwięzione komórki rzęsate do probówki.

Bardzo ważne jest, aby komórki naskórka i włosy były manipulowane w taki sposób, aby uwolnić komórki z mieszków włosowych. Doprowadzić całkowitą objętość w probówce do 50 mililitrów świeżą pożywką i zebrać filtrat komórkowy przez odwirowanie. Zawiesić granulkę w 5 mililitrach świeżego podłoża do zbioru w około 20 turturacjach za pomocą pipety o pojemności 5 mililitrów.

Weź 0,5 mililitra rozcieńczenia od jednego do 20 i przenieś go do 2-mililitrowej probówki do mikrofuge. Po dokładnym wymieszaniu próbki pobrać 200 mikrolitrów z probówki do mikrofug i delikatnie wymieszać z równą objętością 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Delikatnie wymieszaj ten roztwór trzy razy i przenieś komórki do hemocytometru w celu zliczenia jądrzastych keratynocytów.

Oceń wszystkie ciemnoniebieskie komórki jako komórki niezdolne do życia i naciąć małe złote i różowawe komórki jako komórki żywotne. Żywotność wynosi średnio około 80%, a ostateczny plon keratynocytów na mysz powinien wynosić około 30 milionów żywotnych komórek. Po zliczeniu zebrać komórki za pomocą kolejnego wirowania i do hodowli masowej ponownie zamieszać od dwóch do czterech razy od 10 do szóstych żywotnych keratynocytów na 35 milimetrów szalki Petriego w 2 mililitrach pożywki do hodowli komórkowych.

W przypadku testu tworzenia kolonii klonogennych, ponownie zawiesić komórki w ilości keratynocytów raz od 10 do trzech na cztery mililitry zmodyfikowanego podłoża E Williama z suplementami w stężeniu surowicy na pokrytą kolagenem 60-milimetrową szalkę Petriego na napromieniowanych promieniowaniem rentgenowskim warstwach podajnika 3T3 myszy szwajcarskiej. W przypadku hodowli masowej hoduj kultury w temperaturze 32 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez odpowiedni okres hodowli komórkowej. Zmiana podłoża 24 godziny po początkowym wysiewie do hodowli masowej, a następnie trzy razy w tygodniu.

Pod koniec hodowli klonalnej odessać pożywkę i utrwalić kolonie w 10% buforowanej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego ranka zabarwić kolonie 0,5% rodaminą B w autoklawowanej wodzie przez godzinę, a następnie spłukać naczynia w zimnej autoklawowanej wodzie, aż woda będzie czysta. Następnie nachyl naczynia na ich pokrywkach do wyschnięcia przed policzeniem kolonii.

W tym miejscu przedstawiono typowe wyniki testów tworzenia kolonii keratynocytów po różnych zabiegach miejscowych. Komórki macierzyste mieszków włosowych zazwyczaj stanowią około 9% komórek wyizolowanych ze skóry grzbietowej dorosłej myszy C57BL/6, co oceniano za pomocą barwienia cytometrycznego przepływowego dla markerów komórek macierzystych mieszków włosowych myszy. Na tym rysunku można zaobserwować charakterystykę wzrostu kolonii komórek macierzystych keratynocytów po hodowli w czterech różnych warunkach pożywki.

Po tej procedurze komórki można wykorzystać do cytometrii przepływowej, sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, hodowli komórek i analiz biologii molekularnej. Technika ta pozwoliła nam ustalić, że liczba komórek macierzystych naskórka jest ilościową i złożoną cechą prowadzącą do identyfikacji nowego genu regulatorowego komórek macierzystych.