Name: Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę fotokonwersji do śledzenia leukocytów w skórze i guzach myszy Kaede. Technika ta umożliwia ilościową analizę migracji komórek odpornościowych in vivo w badaniach immunologicznych i onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Marcusowi Bosenbergowi za dostarczenie linii YUMM 1.1 i YUMM 1.7 mysiego czerniaka oraz dr Deborah J. Fowell za dostarczenie witaminy B6. Myszy Cg-Tg(CAG-tdKaede)15Utr w porozumieniu z RIKEN BRC za pośrednictwem National Bio-Resource of MEXT, Japonia.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Zdrowia i Nauki w Oregonie.
1. Indukcja stanu zapalnego i malowanie FITC małżowiny usznej myszy
<ol>
	<li>W okapie z przepływem laminarnym znieczulij mysz C57Bl/6 za pomocą odparowanego izofluoranu (indukować 3-5% izofluoranu i utrzymywać na poziomie 1-3% izofluoranu; natężenie przepływu tlenu na poziomie 0,5-1,0 l/min). Zapewnij odpowiednie znieczulenie, monitorując utratę odruchu pedałowania, mimowolne ruchy i zmniejszoną częstość oddechów.</li>
	<li>Połóż ucho płasko z brzuszną stroną ucha skierowaną do góry. Odmierzyć pipetą 20 μl 5% roztworu FITC rozpuszczonego w ftalanu dibutylu (DBP) w stosunku 1:1 do brzusznej strony małżowiny usznej. Pozostaw ucho do wyschnięcia na kilka sekund.</li>
	<li>24 godziny po zastosowaniu FITC należy poddać myszy eutanazji poprzez ekspozycję na dwutlenek węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Zbierz małżowiny uszne do PBS, oddzielając uszy od głowy za pomocą nożyczek. Zbierz dLN szyjki macicy i pachwinowe niedrenujące LN do PBS za pomocą pęsety, aby oddzielić LN od otaczających tkanek. Pachwinowe, niedrenujące LN będą służyć jako ujemna kontrola obecności leukocytów FITC+/Kaede red+. Utylizacja zwłok zgodnie z protokołem instytucjonalnym. 
	Uwaga: Optymalny czas po fotokonwersji do analizy będzie zależał od typu komórki i znanych zachowań migracyjnych. Na przykład komórki dendrytyczne można wykryć w dLN już po 6 godzinach od aplikacji DBP.</li>
</ol>
2. Indukcja stanu zapalnego i fotokonwersja małżowiny usznej myszy
<ol>
	<li>W okapie z przepływem laminarnym znieczulić mysz Kaede-Tg (tło C57Bl/6) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny rozpuszczonej w soli fizjologicznej. Zapewnić odpowiednie znieczulenie zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
	<li>Połóż ucho płasko z brzuszną stroną ucha skierowaną do góry. Odmierzyć 20 μl acetonu w stosunku 1:1:DBP do brzusznej strony małżowiny usznej. Pozostaw ucho do wyschnięcia na kilka sekund.</li>
	<li>Po aplikacji DBP wytnij szczelinę w kawałku folii aluminiowej i przeciągnij ucho przez szczelinę, aby wystawić ucho na działanie fioletowego źródła światła. Połóż ucho płasko stroną grzbietową skierowaną do góry za pomocą taśmy dwustronnej, aby przymocować ucho do folii.</li>
	<li>Umieść ucho bezpośrednio pod źródłem światła i fotokonwertuj przez 3 minuty za pomocą źródła światła o długości fali 405 nm i mocy 100 mW.</li>
	<li>24 godziny po fotokonwersji poddaj myszy eutanazji Kaede-Tg i zbierz małżowiny uszne, LN szyjki macicy i LN pachwinowe, jak opisano w kroku 1.3. 
	Uwaga: Oprócz rozważań przytoczonych w kroku 1.3, tempo proliferacji określi czas analizy, ponieważ utrata czerwieni Kaede nastąpi w szybko dzielących się komórkach.</li>
</ol>
3. Zakażenie krowianką małżowiny usznej myszy i aplikacja FITC
<ol>
	<li>Znieczulij mysz C57Bl/6 odparowanym izofluoranem zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
	<li>Połóż brzuszną stronę ucha płasko. Odpipetować 5 x 106 jednostek tworzących blaszkę miażdżycową (PFU) wirusa krowianki (VacV) rozcieńczonych w 10 μl PBS na małżowinę uszną. Używając igły o rozmiarze 29, wbij małżowinę uszną 25 razy40.</li>
	<li>24 godziny po zakażeniu znieczulić myszy zakażone VacV izofluoranem, jak opisano w kroku 1.1, a następnie odpipetować 20 μl 5% FITC rozpuszczonego w acetonie na brzuszną stronę małżowiny usznej. Pozostaw ucho do wyschnięcia na kilka sekund.</li>
	<li>24 godziny po zastosowaniu FITC należy poddać myszy eutanazji i pobrać małżowiny uszne, LN szyjki macicy i pachwinowe LN, jak opisano w kroku 1.3. 
	Uwaga: FITC może być stosowany w dowolnym momencie po infekcji w celu określenia handlu prądem stałym w różnych odstępach 24 godzin. Wcześniej informowaliśmy, że migracja DC do dLN utrzymuje się na podobnym poziomie od 1 do 3 dnia po infekcji41.</li>
</ol>
4. Zakażenie krowianką małżowiny usznej myszy i fotokonwersja.
<ol>
	<li>Znieczulij mysz Kaede-Tg odparowanym izofluoranem zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
	<li>Zainfekuj małżowinę uszną ucha VacV zgodnie z opisem w kroku 3.2.</li>
	<li>24 godziny po zakażeniu znieczulij myszy Kaede zakażone VacV, jak opisano w kroku 2.1 i wykonaj fotokonwersję, jak opisano w krokach 2.3-2.4.</li>
	<li>24 godziny po fotokonwersji poddać myszy eutanazji i pobrać małżowiny uszne, LN szyjki macicy i pachwinowe LN, jak opisano w kroku 1.3. 
	Uwaga: Jak wspomniano powyżej w kroku 3.4, fotokonwersję można przeprowadzić w dowolnym momencie po infekcji.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie węzłów chłonnych i usznych w cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Utwórz jednokomórkowe zawiesiny małżowiny usznej: oderwij brzuszną i grzbietową stronę małżowiny usznej za pomocą dwóch par pęsety i umieść wnętrze ucha skierowaną w dół do dołków 24-dołkowej płytki zawierającej 1 mg / ml kolagenazy D i 80 U / ml DNazy rozcieńczonej w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka (HBSS) (zawierającym Ca2+ i Mg2+). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przeciśnij strawioną tkankę przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 70 μm.</li>
	<li>Utwórz zawiesiny pojedynczych komórek z LN: umieść LN w studzienkach 24-dołkowej płytki zawierającej 1 mg / ml kolagenazy D i 80 U / ml DNazy rozcieńczonej w HBSS. Otworzyć torebkę węzłów chłonnych za pomocą dwóch igieł o rozmiarze 29G, a następnie inkubować węzły chłonne w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przeciśnij strawioną tkankę przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 70 μm.</li>
</ol>
6. Śródskórna implantacja guza czerniaka i fotokonwersja.
<ol>
	<li>Ogol futro od środka grzbietu myszy Kaede-Tg za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.</li>
	<li>Umieść igłę o rozmiarze 29 G na środku pleców między lewą i prawą górną łopatką i śródskórnie wstrzyknij 5 x 105 komórek nowotworowych (rozcieńczonych w 50 μl soli fizjologicznej) w skórę myszy Kaede-Tg. Guzy muszą być starannie ustawione, aby zapewnić drenaż limfatyczny do określonych węzłów chłonnych (tj. LN lewej i prawej ramienia w przypadku guzów umieszczonych pośrodku górnej części pleców). Unikaj umieszczania guza powyżej dLN, ponieważ może to spowodować bezpośrednią fotokonwersję LN przez skórę/guz</li>.
	<li>Pozwól guzom urosnąć do pożądanego rozmiaru (100-650 mm3).</li>
	<li>Na jeden dzień przed pobraniem tkanek znieczulić mysz Kaede-Tg zgodnie z opisem w ppkt 2.1 i ogolić nowo odrastającą sierść wokół guza.</li>
	<li>Wytnij okrągły otwór w folii aluminiowej i przeciągnij guz, aby wystawić guz na działanie źródła światła. Wytnij otwór nieco mniejszy niż guz, aby zapobiec cofaniu się guza przez otwór i zminimalizować konwersję sąsiedniej, nienowotworowej skóry.</li>
	<li>Umieść guz bezpośrednio pod źródłem światła i fotokonwertuj przez 5 minut przy użyciu źródła światła 405 nm o mocy 200 mW.</li>
	<li>24 godziny po fotokonwersji poddać myszy eutanazji zgodnie z opisem w kroku 1.3. Zbierz guzy, dLN ramienne i pachwinowe niedrenujące LN do PBS. Odetnij guzy od otaczającej skóry za pomocą nożyczek i usuń LN zgodnie z opisem w kroku 1.3.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie guza i węzłów chłonnych w cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Stwórz zawiesiny pojedynczych komórek z guzów: zmiel guzy nożyczkami do studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej 1 mg / ml kolagenazy D i 80 U / ml DNazy rozcieńczonej w HBSS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przeciśnij strawioną tkankę przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm.</li>
	<li>Utwórz jednokomórkową zawiesinę węzłów chłonnych zgodnie z opisem w kroku 5.2.</li>
</ol>
8. Barwienie przeciwciał w cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Po strawieniu tkanek do zawiesin pojedynczych komórek należy wykonać standardowe techniki barwienia cytometrią przepływową, aby oznaczyć komórki interesującymi je markerami. Krótko odpipetować 2 x 106 komórek do płytki 96-dołkowej. Inkubować próbki z blokiem Fc (1 μg/ml) przez 20 minut na lodzie; przemyć dwukrotnie buforem FAC (1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS). Dodać żywą/martwą plamę (rozcieńczoną w PBS) do próbek i inkubować przez 15 minut na lodzie; przemyć dwukrotnie buforem FAC. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (tabela materiałów) rozcieńczonymi w buforze FAC przez 30 minut na lodzie; przemyć dwukrotnie buforem FAC. 
	Uwaga: Fluorescencja zielona Kaede i czerwona Kaede nakłada się na fluorofory FITC i PE; w związku z tym przeciwciała sprzężone z FITC i PE nie mogą być stosowane w połączeniu z białkami Kaede.</li>
	<li>Po barwieniu należy uruchomić próbki na cytometrze przepływowym. Alternatywnie, utrwal komórki za pomocą 2% PFA.</li>
</ol>
9. Analiza cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Ustaw napięcia PMT kanału FITC (zielony Kaede) i PE (czerwony Kaede) na 70-80% całkowitego zakresu (populacja środkowa na około 104) za pomocą jednokolorowych splenocytów w kolorze zielonym Kaede ex vivo lub jednokolorowych splenocytów Kaede lub krwi. 
	Uwaga: Nie należy kompensować kanałów zielonego Kaede (FITC) i czerwonego Kaede (PE), ponieważ spowoduje to większe rozproszenie sygnału.
	<ol>
		<li>Aby utworzyć jednokolorowe kontrolki Kaede, pobierz śledzionę lub krew od myszy Kaede-Tg. Lizować czerwone krwinki za pomocą buforu ACK, a następnie podzielić komórki na dwie grupy: nieprzekształconą zieloną Kaede i przekształconą czerwoną Kaede.</li>
		<li>W przypadku jednokolorowych czerwonych kontrolek Kaede zawieś komórki w 1 ml PBS i fotokonwertuj na 24-dołkowej płytce na 5 minut przy użyciu źródeł światła o długości fali 405 nm o mocy 100 mW. Użyj tych komórek, aby ustawić zielone napięcia PMT Kaede (FITC) i czerwone Kaede na cytometrze przepływowym (krok 9.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ustawieniu napięć dla białek Kaede, skompensuj wszystkie inne pierwotne barwienia przeciwciał za pomocą kulek kompensacyjnych znakowanych pojedynczym fluoroforem zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Uruchom próbki na cytometrze przepływowym, aby zebrać dane. 
	Uwaga: Białko Kaede jest stale wytwarzane przez komórki. Oznacza to, że 24 godziny po fotokonwersji przekształcone komórki będą podwójnie dodatnie dla zieleni Kaede i czerwieni Kaede, ponieważ nowo zsyntetyzowane białko Kaede (zielone) zgromadziło się w komórce.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo lub podobnego oprogramowania.</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Chociaż wydostawanie się leukocytów z obwodowych, nielimfatycznych tkanek ma kluczowe znaczenie dla inicjacji i ustąpienia odpowiedzi immunologicznej, mechanizmy molekularne rządzące wyjściem są słabo poznane. Ta luka w wiedzy wynika w dużej mierze z łatwej dostępności narzędzi do oznaczania ilościowego in vivo. W tym miejscu opisujemy zastosowanie myszy fotokonwertowalnych (Kaede-Tg) do ilościowego określenia endogennego wydostania się leukocytów ze skóry i guzów oraz zapewniamy bezpośrednie porównanie head-to-...

Odpowiedzi immunologiczne tkanek obwodowych są kształtowane nie tylko przez rekrutację leukocytów do miejsc zapalenia, ale także przez mechanizmy regulujące ich późniejsze zachowanie. Tak więc odporność ochronna jest podyktowana kumulatywnymi mechanizmami komórkowymi i molekularnymi, które decydują o tym, czy leukocyt wchodzi, pozostaje w środku, czy raczej migruje z tkanki obwodowej przez naczynia limfatyczne. Co ważne, skłonność leukocytów do wychodzenia z tkanek przez naczynia limfatyczne (określana jako wyjście) jest związana z ich wyspecjalizowanymi funkcjami. Komórki dendrytyczne (DC) nabywają zachowania migracyjne w odpowiedzi na sygnały dojrzewania prowadzące do transportu antygenu i prezentacji w drenujących węzłach chłonnych (dLN), procesu, który jest niezbędny dla odporności adaptacyjnej1. Wymiatacze komórek szpikowych, takich jak makrofagi i neutrofile, służą do usuwania zanieczyszczeń apoptotycznych poprzez fagocytozę. Podczas infekcji bakteryjnej neutrofile opuszczają tkankę i ostatecznie ulegają apoptozie w dLNs2 oraz w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS, dane potwierdzają hipotezę, że wydostanie się makrofagów jest niezbędne do rozwiązania miejscowego stanu zapalnego3. Nie wiadomo jednak, czy wydostanie się neutrofili i makrofagów występuje we wszystkich kontekstach zapalnych. Dowody na wyjście limfocytów T ze stanu ustalonego4,5,6,7, infected8, and inflamed4,9,10,11,12 obwodowe, nielimfoidalne tkanki wskazują, że limfocyty T aktywnie recyrkulują, chociaż sygnały tkankowe, które napędzają to wyjście, pozostają słabo poznane. W kilku badaniach zidentyfikowano sygnały niezbędne do kierunkowej migracji w kierunku drenujących naczyń włosowatych limfatycznych i późniejszego wyjścia, w tym ligand 21 chemokiny (motyw C-C) (CCL21) i jego receptor CCR74,11,13, ligand 12 chemokiny (motyw C-X-C) (CXCL12) i jego receptor CXCR42,14 i sfingozyno-1-fosforan (S1P)10,15,16. Mechanizmy te nie są jednak aktywne we wszystkich kontekstach, a to, czy determinują wyjście wszystkich typów komórek, pozostaje kwestią otwartą. Co ważne, dalsze poznanie mechanizmów rządzących wyjściem i jego funkcjonalnego znaczenia w chorobie wymaga ilościowych metod analizy in vivo.
Do ilościowego określenia wyjścia w wielu modelach zwierzęcych in vivo użyto kilku metod, w tym bezpośredniej kaniulacji naczyń limfatycznych, adoptywnego transferu leukocytów znakowanych ex vivo, transdermalnego stosowania znaczników fluorescencyjnych, wstrzykiwania znakowanych cząstek oraz fotokonwersji in vivo17,18. Bezpośrednia kaniulacja naczyń limfatycznych myszy doprowadzających jest trudna i ograniczona u małych zwierząt objętościami płynu, które można zebrać. Tak więc kaniulacja była w dużej mierze wykonywana u dużych zwierząt (np. owiec), gdzie takie manipulacje chirurgiczne są praktyczne. Badania te dostarczają bezpośrednich dowodów na obecność zarówno komórek limfoidalnych, jak i szpikowych w limfie10,19,20. Co więcej, modele owcze ujawniają, że ostre i przewlekłe zapalenie zwiększyło obecność limfocytów w limfie prawie 100-krotnie10,21.
Adoptywny transfer znakowanych i genetycznie modyfikowanych limfocytów ujawnił, że CCR7 jest niezbędny do wyjścia limfocytów T CD4+ z ostrego stanu zapalnego skóry5,11, podczas gdy wstępne traktowanie limfocytów małocząsteczkowym agonistą receptora S1P, FTY720, tylko częściowo hamuje ich wychodzenie10. Co ciekawe, wyjście przenoszonych limfocytów z przewlekle zapalnej skóry jest niezależne od CCR710, ale może częściowo wymagać CXCR49. Eksperymenty z transferem adoptywnym dostarczają jednak niefizjologiczną liczbę limfocytów aktywowanych i znakowanych ex vivo do tkanki poprzez wstrzyknięcie, co zmienia środowisko biomechaniczne tkanek i zwiększa ciśnienie płynu śródmiąższowego, które otwiera początkowe naczynia włosowate limfatyczne i zmienia ich właściwości transportowe22. Alternatywnie, transdermalne stosowanie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w obecności lub braku substancji drażniących skórę (np. ftalanu dibutylu, DBP) lub infekcji23,24 pozwala na śledzenie komórek fagocytarnych, które gromadzą znacznik i migrują do dLN. Podobnie, guzy znakowane fluorescencyjnie zapewniają środki do śledzenia komórek fagocytarnych, które pochłonęły materiał nowotworowy25. Metody te dostarczyły ważnych informacji na temat mechanizmów, które rządzą wyjściem DC13,14,17,26,27, ale nie są w stanie śledzić limfocytów niefagocytarnych, a interpretacja może być skomplikowana przez swobodny drenaż limfatyczny rozpuszczalnego FITC, oznaczając w ten sposób niemigrujące, rezydentne LN DC.
Alternatywnie, mikroskopia przyżyciowa jest potężnym narzędziem, które pozwala na śledzenie in vivo fizjologicznie istotnych populacji leukocytów w czasie rzeczywistym28,29. Mikroskopia przyżyciowa, stosowana w połączeniu z myszami reporterowymi i immunofluorescencyjnym znakowaniem in vivo opartym na przeciwciałach, ujawniła złożoną przestrzenną i czasową dynamikę transportu komórek odpornościowych, w tym migrację śródmiąższową30, transmigrację przez śródbłonek limfatyczny, przejście w świetle limfy i migrację po wejściu do LN28,31. Szerokie zastosowanie technik obrazowania przyżyciowego jest ograniczone ze względu na koszty, niezbędną wiedzę specjalistyczną do konfiguracji i ograniczoną przepustowość w zakresie ilościowego oznaczania wielu typów komórek. Mimo to, sprzężenie metod ilościowych, które analizują dynamikę tkanek populacji, z obrazowaniem przyżyciowym dostarczy dodatkowych i ważnych mechanistycznych informacji w odniesieniu do mechanizmów ruchliwości i migracji w kierunku i w obrębie naczyń włosowatych limfatycznych18,31,32.
W związku z tym, fotokonwersja in vivo pojawiła się jako metoda, która pozwala na znakowanie in situ, niezależnie od aktywności fagocytarnej, oraz na ilościowe określenie fizjologicznego wyjścia leukocytów (w połączeniu z cytometrią przepływową) w przypadku braku lub obecności prowokacji. Myszy Kaede-Tg konstytutywnie wyrażają białko wyizolowane z koralowca kamiennego, które wykazuje zieloną fluorescencję (zieleń Kaede) do momentu wystawienia na działanie światła fioletowego, po czym nieodwracalnie przekształca się w czerwoną fluorescencję (czerwień Kaede)33. Fotokonwertowane komórki mogą być śledzone, gdy wychodzą z obwodowych miejsc tkankowych i gromadzą się w dLN. Ten i inne podobne modele myszy konwertowalnych na zdjęcia34,35 ujawniły ważne biologie, w tym konstytutywne wyjście regulatorowych komórek T ze skóry36, zależne od CXCR4 wyjście komórek B z łat Peyera37, mobilizacja rezydentnych komórek T pamięci po ponownym wywołaniu peptydu38, oraz szerokie wyjście leukocytów z mikrośrodowisk nowotworowych39. W niniejszym artykule przeprowadzamy bezpośrednie porównanie fotokonwersji z transdermalną aplikacją FITC w kontekście zapalenia i infekcji skóry, aby umożliwić bezpośrednie porównanie istniejących danych z metodą fotokonwertowalną. Ponadto wykazujemy fotokonwersję w implantowanych nowotworach oraz opisujemy skuteczność konwersji i selektywne wyjście z mikrośrodowisk guza. W związku z tym twierdzimy, że potrzebne jest dalsze stosowanie tych metod, aby wyjaśnić krytyczną biologię wychodzenia leukocytów z guzów, co będzie miało znaczące implikacje dla interpretacji złożoności leukocytów wewnątrznowotworowych, odporności przeciwnowotworowej i odpowiedzi na terapię.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Silver-LED-405B źródło światła ze światłowodem i kolimtorem</td><td>Prizmatix Ltd</td><td>V8144</td><td></td></tr><tr><td>Izomer izotiocyjanianu fluoresceiny I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>ftalan dibutylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524980</td><td></td></tr><tr><td>aceton</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2440-02</td><td></td></tr><tr><td>29-częściowe strzykawki</td><td>Exel International</td><td>26029</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>70 um sitka komórkowe</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HBSS Keson</td><td>HBL06</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do naprawy Aqua Dead Cell Stain</td><td>Kit Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-mysz CD16/CD32</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-M001</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD11c (klon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 MHCII (klon M5/114.15.2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>562363</td><td></td></tr><tr><td>BV421 CD3e (klon 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>APC CD8a (klon 53-6.7)</td><td>TonBo Biosciences</td><td>20-0081-u100</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 CD45 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>BV650 CD19 (klon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115541</td><td></td></tr><tr><td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (klon HK1.4)</td><td>Biolegend</td><td>128011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 F4/80 (klon BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123121</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ly6G (klon 1A8)</td><td>Biolegend</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD11b (klon M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101241</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD45 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD4 (klon RM4-5)</td><td>BD Biosciences</td><td>563726</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (frakcja V)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Anit-Rat i anty-chomik Igk / Zestaw cząstek kompensacji kontroli negatywnej</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 Oprogramowanie</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Wyjście leukocytów z tkanek obwodowych do drenujących węzłów chłonnych jest nie tylko kluczowe dla nadzoru i inicjacji immunologicznej, ale także przyczynia się do rozwiązania odpowiedzi tkanek obwodowych. Chociaż do ilościowego określania wyjścia leukocytów z tkanek obwodowych nielimfatycznych stosuje się różne metody, mechanizmy komórkowe i molekularne, które rządzą wyjściem zależnym od kontekstu, pozostają słabo poznane. W tym miejscu opisujemy zastosowanie fotokonwersji in situ do analizy ilościowej wyjścia leukocytów ze skóry myszy i guzów. Fotokonwersja pozwala na bezpośrednie znakowanie leukocytów znajdujących się w tkance skórnej. Chociaż ekspozycja skóry na światło fioletowe indukuje miejscowe reakcje zapalne charakteryzujące się naciekami leukocytów i nieszczelnością naczyń krwionośnych, w bezpośrednim porównaniu z transdermalnym stosowaniem znaczników fluorescencyjnych, fotokonwersja specyficznie znakowała migrujące populacje komórek dendrytycznych i jednocześnie umożliwiła ilościowe określenie wyjścia szpiku i limfoidów z mikrośrodowisk skórnych i guzów. Mechanizmy wychodzenia leukocytów pozostają brakującym elementem w naszym zrozumieniu złożoności leukocytów wewnątrznowotworowych, a zatem zastosowanie opisanych w niniejszym dokumencie narzędzi zapewni unikalny wgląd w dynamikę mikrośrodowisk immunologicznych nowotworu zarówno w stanie stacjonarnym, jak i w odpowiedzi na terapię.

W pierwszej kolejności podjęto próbę powtórzenia wyników fotokonwersji opublikowanych w literaturze, aby ocenić wydajność procesu i określić towarzyszący mu stan zapalny w skórze myszy. Małżowinę uszną eksponowano na fioletowe światło o mocy 100 mW (405 nm) przez 3 min, zgodnie z wcześniejszym opisem33. Zawiesiny pojedynczych komórek uzyskane ze skóry ucha lub szyjnych dLN bezpośrednio po ekspozycji wykazały 78% wydajność konwersji wszystkich leukocytów CD45+<...

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Fotokonwersja zapewnia możliwą do śledzenia metodę in vivo do analizy ilościowej wychodzenia leukocytów w celu uzyskania mechanistycznego wglądu w dynamikę przebywania i wychodzenia leukocytów z wielu miejsc tkankowych w stanach chorobowych. Cóż, tutaj pokazujemy użyteczność śledzenia leukocytów z guzów skóry. Zastosowanie tego testu do innych tkanek i chorób jest ograniczone jedynie zdolnością do podawania światła.Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościowe określenie endogennych, a nie przeniesionych populacji komórek odpornościowych jako wyjścia z tkanek objętych stanem zapalnym in vivo. W celu wywołania stanu zapalnego, po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi, za pomocą mikropipety podaj 20 mikrolitrów ftalanu dibutylu lub DBP do brzusznej strony małżowiny usznej znieczulonej transgenicznej myszy Kaede. Po pozostawieniu DBP do wyschnięcia, przeciągnij ucho przez szczelinę w kawałku folii aluminiowej i użyj taśmy dwustronnej, aby płasko przymocować ucho do folii stroną grzbietową skierowaną do góry.Następnie ustaw się tak, aby znajdował się bezpośrednio pod źródłem światła o długości 405 nanometrów i fotokonwertuj przez trzy minuty przy mocy 100 miliwatów. W przypadku infekcji krowianki użyj mikropipety, aby podać 5 razy 10 do 6 jednostek tworzących płytkę mienną wirusa krowianki w 10 mikrolitrach PBS do małżowiny usznej znieczulonej transgenicznej myszy Kaede i szturchnij małżowinę uszną 25 razy. 24 godziny później przekształć małżowinę uszną, jak właśnie pokazano.W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym zbierz małżowiny uszne oraz węzły chłonne szyjne i pachwinowe i użyj dwóch par pęset, aby rozdzielić brzuszną i grzbietową stronę każdej małżowiny usznej. Następnie umieść węzły chłonne i kawałki małżowiny usznej, wnętrzem ucha skierowanym w dół, w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki zawierającej 1 miligram na mililitr kolagenazy D i 80 jednostek na mililitr Dnazy rozcieńczonej w HBSS zawierającej wapń i magnez. Użyj dwóch igieł o rozmiarze 29, aby otworzyć każdą kapsułkę węzła chłonnego i umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.Pod koniec inkubacji przeciśnij strawione tkanki małżowiny usznej i węzłów chłonnych przez oddzielne sitka do komórek nylonowych o średnicy 70 mikronów, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek każdej tkanki. Kiedy guzy osiągną odpowiedni rozmiar eksperymentalny, należy ogolić nowo odrastające futro wokół miejsca guza i przeciągnąć guz przez okrągły otwór wycięty w kawałku folii aluminiowej. Umieść guz bezpośrednio pod źródłem światła o długości 405 nanometrów i fotokonwertuj przez 5 minut przy mocy 200 miliwatów.24 godziny po fotokonwersji zbierz guzy oraz węzły chłonne ramienne i pachwinowe od każdego zwierzęcia i użyj nożyczek do mielenia guzów w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki zawierającej kolagenazę D i DNazę w HBSS. Umieść węzły chłonne w oddzielnych studzienkach i otwórz kapsułki, jak pokazano. Po inkubacji guzów przez godzinę i węzłów chłonnych przez pół godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przeciśnij strawione tkanki przez oddzielne sitka o wielkości 70 mikronów, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek każdej tkanki.Aby przeanalizować zawiesiny pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej, najpierw zbierz śledzionę lub krew od transgenicznej myszy Kaede i zlizuj czerwone krwinki buforem potasu chlorku amonu. Podziel komórki na jedną nieprzekształconą populację Kaede FITC i jedną przekształconą populację Kaede PE i ponownie zawieś jednokolorowe komórki Kaede PE w jednym mililitrze PBS w jednej studzience 24-dołkowej płytki, a następnie fotokonwertuj komórki przez 5 minut pod 405-nanometrowym źródłem światła o mocy 100 miliwatów. Następnie użyj fotokonwertowanych ogniw Kaede PE i nieprzekonwertowanych ogniw Kaede FITC, aby ustawić napięcia fotopowielacza na 70 do 80% całkowitego zakresu każdego kanału fluorescencyjnego.Po ustawieniu napięć dla białek Kaede, skompensuj wszystkie inne pierwotne barwienia przeciwciał za pomocą pojedynczych kulek kompensacyjnych znakowanych fluoroforem, zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie uruchom próbki na cytometrze przepływowym zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej. Zawiesiny pojedynczych komórek generowane ze skóry ucha lub węzłów chłonnych drenujących szyjkę macicy bezpośrednio po ekspozycji na fotokonwersję ujawniają 78% wydajność konwersji wszystkich leukocytów CD45 dodatnich w skórze, bez przekształcenia komórek obserwowanych w drenujących węzłach chłonnych.Kwantyfikacja liczby naciekających leukocytów CD45 dodatnich w kłosach nawróconych w wyniku fotokonwersji zero i 24 godziny po konwersji ujawnia, że ekspozycja na światło fioletowe powoduje statystycznie istotny wzrost naciekania leukocytów. Ten wzrost nacieku leukocytów CD45 dodatnich jest jednak niewielki w porównaniu z naciekiem wywołanym silnym bodźcem zapalnym, takim jak wirus krowianki. Fotokonwersja zwiększa również przepuszczalność naczyń krwionośnych w małżowinach usznych, mierzoną za pomocą testu Milesa, co razem wskazuje, że wpływ światła fioletowego na stan zapalny tkanek powinien być brany pod uwagę przy optymalizacji dawki, czasu ekspozycji i interpretacji danych.Analiza cytometrii przepływowej zdysocjowanych komórek nowotworowych od fotokonwertowanych zwierząt ujawnia znaczącą konwersję wewnątrznowotworowych komórek CD45 dodatnich z dodatniego Kaede FITC na dodatniego Kaede PE, podczas gdy drenujące komórki węzłów chłonnych pozostają nieprzekształcone. Wydajność fotokonwersji leukocytów CD45-dodatnich różniła się znacznie w zależności od typu i wielkości guza, przy czym leukocyty CD45 dodatnie w małych guzach czerniaka wykazywały najbardziej efektywną fotokonwersję. Wraz ze wzrostem objętości guza wydajność konwersji spada do około 50%Warto zauważyć, że melanina ma uderzający wpływ na wydajność fotokonwersji przy maksymalnej fotokonwersji komórek CD45 dodatnich obserwowanych w guzach wytwarzających melaninę wynoszącej tylko około 30% w mniejszych guzach, która spada do 10%, gdy objętość guza zbliża się do 400 milimetrów sześciennych.Badanie węzłów chłonnych drenujących guz 24 godziny po fotokonwersji ujawnia obecność czerwonych dodatnich komórek odpornościowych Kaede o różnych fenotypach, wykazując w ten sposób emigrację leukocytów z fotokonwertowanego guza. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do odkrycia kinetyki obrotu leukocytów w stanie stacjonarnym i zapalnym w tkance obwodowej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że tylko tkanka będąca przedmiotem zainteresowania jest fotokonwertowana, ponieważ niezamierzona fotokonwersja otaczającej tkanki pogorszy wyniki.Osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, powinny zoptymalizować czas ekspozycji na konwersję swojej tkanki, a także czas trwania czasu przed pobraniem tkanki w oparciu o dynamikę leukocytów będących przedmiotem zainteresowania.

quantifying-leukocyte-egress-via-lymphatic-vessels-from-murine-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niedawno opracowane techniki obrazowania z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) mogą pomóc w wyjaśnieniu roli, jaką układ limfatyczny odgrywa w przerzutowaniu nowotworów, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu ran oraz innych chorobach związanych z układem limfatycznym.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne naczyń limfatycznych myszy

Ten film demonstruje test do monitorowania migracji komórek dendrytycznych po zakażeniu opuszki stopy Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG u myszy. Po zakażeniu bakteryjnym aktywowane komórki DC skóry są znakowane przepuszczalnym dla komórek barwnikiem estru sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE). Po odpowiednim odstępie czasu na migrację DC do węzła chłonnego drenującego podniebienie, komórki węzła są izolowane i poddawane barwieniu immunologicznemu w celu uzyskania...

Test oparty na CFSE do monitorowania migracji komórek dendrytycznych skóry do drenujących węzłów chłonnych u zakażonych myszy

Ten protokół opisuje metodę szczegółowej oceny podzbiorów leukocytów w mikrośrodowisku guza w modelu guza myszy. Komórki czerniaka B16 z ekspresją chemeryny wszczepiono podskórnie myszom syngenicznym. Komórki z mikrośrodowiska guza zostały następnie wybarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwoliło na szczegółowe analizy podzbiorów leukocytów.

Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza

Opisano test na myszach do śledzenia migracji komórek ze skóry do drenującego węzła chłonnego, który umożliwia scharakteryzowanie komórek dendrytycznych skóry zmobilizowanych do węzła chłonnego po zakażeniu opuszki stopy Bacille Calmette-Guérin.

Test oparty na CFSE do badania migracji komórek dendrytycznych skóry myszy do drenujących węzłów chłonnych podczas zakażenia Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Tutaj opisujemy dokładną metodę pobierania limfocytów przewodu piersiowego i obserwacji migracji limfocytów tropikalnych jelitowych w plamach Peyera szczura przez 3 godziny za pomocą fotografii poklatkowej. Ta technika może wyjaśnić, w jaki sposób dynamika limfocytów wpływa na stan zapalny.

Obserwacja mikroskopowa dynamiki limfocytów w szczurzych łatach Peyera

Czerniak jest bardzo agresywną chorobą, która szybko rozprzestrzenia się na inne narządy. Protokół ten opisuje zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości, w połączeniu z renderowaniem 3D, do monitorowania objętości pachwinowych węzłów chłonnych w mysim modelu czerniaka z przerzutami Braf/Pten.

Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Poznaj metodę fotokonwersji do śledzenia leukocytów w skórze i guzach myszy Kaede. Technika ta umożliwia ilościową analizę migracji komórek odpornościowych in vivo w badaniach immunologicznych i onkologicznych.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Przeglądaj więcej filmów