Name: Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj metodę CRISPR-Cas9 do badania genów w ostra białaczka szpikowa przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia szybką i skalowalną analizę proliferacji komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plazmid pCW-Cas9 był prezentem od Erica Landera i Davida Sabatini (plazmid Addgene #50661) oraz plazmid pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W z laboratorium Yusa (plazmid Addgene #67974. Chcielibyśmy podziękować ośrodkowi cytometrii przepływowej w SBP Medical Discovery Institute za szybką pomoc w analizie i sortowaniu przepływu. Chcielibyśmy podziękować za wsparcie Lady Tata Memorial Foundation dla A.D. Chcielibyśmy również podziękować za wsparcie następujących źródeł finansowania: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center Sponsored Grant, V-Foundation oraz San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.

<ol><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Method%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li>
<li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li>
<li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR%2FCas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).</li>
<li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li>
<li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li>
<li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li>
<li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li>
<li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L%2C+the+H3K79+methyltransferase%2C+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li>
<li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).</li>
</ol>

A.J.D jest konsultantem A2A Pharmaceuticals (New Jersey) i Salgomed Therapeutics (San Diego). Inni autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

W tym manuskrypcie opisujemy szczegółowy protokół przeprowadzania testu wzrostu konkurencyjnego opartego na CRISPR-Cas9 w celu zbadania roli genów kandydujących w liniach komórkowych AML za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich / mysich komórkach AML (Figura 5). Celem testu jest zidentyfikowanie wpływu delecji genu na utrzymanie proliferacji komórek AML przez dwa do trzech tygodni w skali średnioprzepustowej. Należy uważnie wykonać kilka krytycznych kroków, aby ułatwić skalowanie opisane...

W ciągu ostatnich kilku dekad byliśmy świadkami licznych badań mających na celu określenie udziału kluczowych szlaków molekularnych w patogenezie ostrej białaczki szpikowej (AML). Tradycyjnie, zakłócenie genów w komórkach AML przeprowadzono przy użyciu myszy z warunkowym nokautem lub RNA z krótką spinką do włosów (shRNA). Podczas gdy myszy z nokautem oferują wyrafinowany system czasoprzestrzennej kontroli delecji genów, generowanie myszy z nokautem genów jest pracochłonne, czasochłonne i kosztowne. Co więcej, nokaut genów przy użyciu strategii rekombinacji nie jest łatwo skalowalny; Strategie te nie nadają się dobrze do równoległego badania kilku genów. Po odkryciu metod interferencji RNA w celu wyeliminowania endogennych mRNA za pomocą małego interferującego RNA (siRNA) lub shRNA, wiele grup zaczęło stosować techniki interferencji RNA w celu zbadania roli określonych genów w AML. Ponieważ zarówno mysie, jak i ludzkie komórki AML są notorycznie trudne do transfekcji przy użyciu tradycyjnych metod transfekcji opartych na lipidach, w większości badań wykorzystywano shRNA kodowane lentiwirusowo lub retrowirusowo do badania funkcji genów w komórkach AML. Niedawne odkrycie zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) i związanych z nimi nukleaz Cas (CRISPR-Cas9) zrewolucjonizowało technologie celowania w geny1,2,3. Korzystając z CRISPR-Cas9, określone geny lub regiony genomu mogą być usuwane, edytowane lub oznaczane z wydajnością i łatwością. Edycja genów oparta na CRISPR-Cas9 staje się obecnie metodą z wyboru do badania relacji między genotypem a fenotypem w różnych typach komórek ze względu na prostotę, skuteczność i szerokie zastosowanie tej techniki. Metody oparte na CRISPR-Cas9 stają się również metodą z wyboru w AML, nie tylko do badania pojedynczych genów, ale także jako sposób na celowanie w wiele genów w macierzowanych lub zbiorczych badaniach genetycznych, mających na celu równoległe badanie kilku genów jako potencjalnych zależności AML4,5,6.
W tym manuskrypcie opisujemy prosty test konkurencyjnego wzrostu do pomiaru wpływu zaburzeń genów na wzrost komórek AML, oparty na stabilnej edycji genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9, a następnie wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej. Metoda ta jest prosta, wydajna i skalowalna do średnioprzepustowych eksperymentów w celu zbadania roli kilku genów równolegle w komórkach AML.

<table><tbody><tr><td>FLAG-M2 Przeciwciało</td><td>sigma-aldrich</td><td>F3165, lot # SLBS3530V</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom</td><td>Invitrogen</td><td>31446, lot # TA2514341</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Maksymalna czułość Podłoże</td><td>Thermo Fisher</td><td>34095</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania ChemiDoc</td><td>Wirówka BIO RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R21001</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>SAFC</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>pojedynczy wektor gRNA</td><td>Addgene #67974</td><td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td><td></td></tr><tr><td>CelLytic Zestaw do ekstrakcji jądrowej</td><td>sigma-alorich</td><td>NXTRACT</td><td></td></tr><tr><td>XtremeGENE 9</td><td>sigma-alorich</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEBioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 bufor do ligacji DNA</td><td>NEBioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Enzym ligazy DNA</td><td>NEBioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Agar LB</td><td>Fisher scientific</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Fisher scientific</td><td>BP9731-500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mini-przygotowania Qiagen</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Stabilne kompetentne komórki</td><td>NEBiolabs</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do lizy komórek</td><td>Qiagen</td><td>158906</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do wytrącania białek</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do hydratacji DNA</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BbSI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit</td><td>Genessee Scientific</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Fisher scientific</td><td>BP2956100</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowe probówki</td> <td>stożkoweFisher scientific</td><td>1495949A</td> 15 ml polipropylenowe rurki <td></td></tr><tr><td>stożkowe</td><td>Fisher scientific</td><td>1495970C</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na crispr-cas9

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Badania nad zaburzeniami genów były szeroko wykorzystywane do badania roli poszczególnych genów w patogenezie AML. Aby osiągnąć całkowite rozerwanie genów, w wielu z tych badań wykorzystano złożone modele nokautu genów. Podczas gdy te badania na myszach z nokautem oferują elegancki i sprawdzony system do badania zależności między genotypem a fenotypem, szybka i skalowalna metoda oceny genów kandydujących, które odgrywają rolę w proliferacji komórek AML lub przeżyciu w modelach AML, pomoże przyspieszyć równoległe badanie wielu genów kandydujących. Niedawne postępy w technologiach edycji genomu znacznie zwiększyły naszą zdolność do wykonywania perturbacji genetycznych na niespotykaną dotąd skalę. Jednym z takich systemów edycji genomu jest metoda oparta na CRISPR-Cas9, która może być stosowana do wprowadzania szybkich i skutecznych zmian w genomie komórki docelowej. Łatwość i skalowalność delecji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 sprawia, że jest to jedna z najbardziej atrakcyjnych technik badania dużej liczby genów w testach fenotypowych. W tym miejscu przedstawiamy prosty test wykorzystujący zakłócenie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w połączeniu z wysokoprzepustowymi testami konkurencji opartymi na cytometrii przepływowej w celu zbadania roli genów, które mogą odgrywać ważną rolę w proliferacji lub przetrwaniu ludzkich i mysich linii komórkowych AML.

W naszym badaniu w pierwszej kolejności przetransdukcyjną linię komórek AML człowieka MOLM13, posiadającą translokację MLL-AF9, wysokim mianem wirusa kodującego lentiwirusowy plazmid Cas9-blasticidin. W naszych próbach nieposortowane populacje komórek MOLM13-Cas9 nie wykazywały wysokiego poziomu ekspresji Cas9 w analizie Western blot, a także nie osiągały zadowalających wyników w testach wydajności edycji genów, przeprowadzonych zgodnie z wcześniej opisaną metodą7....

Ten manuskrypt opisuje metodę opartą na CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) do prostego i szybkiego badania roli wielu genów kandydujących w równoległej proliferacji komórek ostrej białaczki szpikowej (AML). Technika ta jest skalowalna i może być stosowana również w innych liniach komórek nowotworowych.

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Ten film zademonstruje prostą metodę równoległego badania wielu genów kandydujących w AML przy użyciu systemu Crisper-Cas9 w połączeniu z testem wzrostu konkurencyjnego opartym na cytometrii przepływowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i skalowalna. Procedurę zademonstruje Bo Rui Chen, doktor habilitowany z naszego laboratorium.Internetowe oprogramowanie do projektowania CRISPR służy do projektowania od czterech do sześciu pojedynczych przewodników RNA dla interesującego genu. Aby rozpocząć, wypełnij odpowiednie informacje w polach z gwiazdkami. Następnie wybierz genom docelowy do zaprojektowania pojedynczego przewodnika RNA.Wklej sekwencję docelową w polu sekwencji i kliknij przycisk Prześlij. W celu sklonowania w pożądanym plazmidzie ekspresji pojedynczego przewodnika RNA, należy poprzedzić nukleotydy CACC do zmysłu oglionukleotydu i AAAC do odwrotnego komplementarnego oligonukleotydu antysensownego. Wstępnie zmieszane oligonukleotydy sensowne i antysensowne są następnie zamawiane w firmie na 96-dołkowej płytce, oznaczonej jako Oligo Mix.Ustaw oddzielną płytkę U-Bottom 96 dołków, oznaczoną jako płyta do wyżarzania. Przygotuj główną mieszankę składającą się z jednego mikrolitra kinazy polinukleotydowej T4, jednego mikrolitra 10-krotnego buforu ligacyjnego DNA T4 i sześciu mikrolitrów wody na reakcję wyżarzania. Dodać 8 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki wyżarzającej, a następnie 2 mikrolitry wstępnie zmieszanych oligonukleotydów sensownych i antysensownych.Delikatnie odpipetować dwa do trzech razy, aby dobrze wymieszać, a następnie krótko obrócić płytkę, aby mieszanki znalazły się na dnie studzienek. Użyj następującego programu wyżarzania w maszynie PCR. 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty i 30 sekund, a następnie powolne chłodzenie do 22 stopni Celsjusza w tempie 0,1 stopnia Celsjusza na sekundę.Po zakończeniu wyżarzania przygotuj świeżą 96-dołkową płytkę, oznaczoną jako Rozcieńczona Mieszanka Oligo, rozcieńczając fosforylowane i wyżarzane oligonukleotydy z reakcji wyżarzania w stosunku jeden do 200 wodą. Linearyzować wektor ekspresji pojedynczego przewodnika RNA, trawiąc pięć mikrogramów wektora za pomocą 1,5 mikrolitra enzymu restrykcyjnego BBS1, używając odpowiedniego buforu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie weź świeżą 96-dołkową płytkę oznaczoną płytką ligacyjną i dodaj 20 nanogramów wektora ekspresyjnego RNA z pojedynczym przewodnikiem strawionym przez BBS1 do jednego dołka na pożądaną ligację RNA z pojedynczym przewodnikiem.Do tego dodaj 2 mikrolitry fosforylowanych, wyżarzonych oligonukleotydów z rozcieńczonej płytki Oligo Mix. Dodaj do każdej studzienki jeden mikrolitr buforu ligazy 10X T4 i jeden mikrolitr enzymu ligazy T4 i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Około 10 minut przed zakończeniem reakcji ligacji napełnij lodem 90 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Przenieść 10 mikrolitrowych porcji właściwych komórek do każdej studzienki oddzielnej płytki 96-dołkowej indywidualnie. Dodaj mieszaninę ligacji do studzienek zawierających właściwe komórki.Delikatnie pipetować w górę i w dół i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odpipetować pięć mikrolitrów DNA bakterii zmieszanych z każdej reakcji przemiany bezpośrednio do dołka na 6-dołkowej płytce, zawierającej agar LB ze 100 miligramami na mililitr ampicyliny. Dodaj około pięciu do ośmiu szklanych kulek do każdej studzienki i potrząśnij płytką 6-dołkową osiem do 10 razy okrężnymi ruchami.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wybierz jedną lub dwie pojedyncze kolonie z każdej studzienki za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów i rozprowadź ją na oznaczonym miejscu na sterylnej 10-centymetrowej szalce Petriego, z agarem LB i 100 miligramami na mililitr ampicyliny Po smugach na płytce LB wyrzuć końcówkę do trzech mililitrów pożywki ampicyliny w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem, oznaczone odpowiednim numerem klonu bakteryjnego. Płytka bakteryjna jest następnie wysyłana bezpośrednio do sekwencjonowania Sangera.Po potwierdzeniu sekwencji sklonowanych pojedynczych przewodników RNA, oczyść DNA z odpowiedniej 14-mililitrowej probówki, używając zestawu miniprep zgodnie z instrukcjami producenta. Cząsteczki lentiwirusa z pojedynczym przewodnikiem RNA są wytwarzane w formacie 96-dołkowym, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. A wirusowy supernatant jest natychmiast zamrażany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Na dzień przed transdukcją pojedynczych przewodnikowych RNA w komórkach AML Cas9 pokryj 96-dołkową płytkę z płaskim dnem, niepoddawaną działaniu hodowli tkankowej, 100 mililitrami rekombinowanego ludzkiego fragmentu fibronektyny w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Owiń talerz folią spożywczą, aby uniknąć utraty parowania, i pozostaw go na noc na ławce. Następnego dnia usuń rekombinowany fragment ludzkiej fibronektyny z każdej studzienki z 96-dołkowej płytki.Rozmrozić wirusowy supernatant każdego pojedynczego przewodnika RNA w temperaturze pokojowej. Dodać 50 mikrolitrów supernatantu wirusowego z każdej probówki do każdego powlekanego dołka płytki transdukcyjnej. Owiń płytkę folią spożywczą, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia podczas wirowania.Obracaj płytkę z prędkością 1 300 razy g w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 90 minut. Pod koniec infekcji policz komórki klonu B3 o wysokiej ekspresji Cas9 z kolby hodowlanej. Po odliczeniu odwiruj wymaganą liczbę komórek i ponownie zawieś na świeżym podłożu.Po 90-minutowej infekcji użyj pipety wielokanałowej dostosowanej do 50 mikrolitrów, aby powoli usunąć supernatant ze wszystkich studzienek, przechylając płytkę. Dodaj 100 mikrolitrów kultury klonów komórek B3 do każdej studzienki powoli, zsuwając się z krawędzi. Obracaj płytkę 1 300 razy g w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby komórki opadły na dno.Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki do każdej studzienki zawierającej pojedyncze komórki transdukowane prowadzącym RNA, tak aby końcowa objętość pożywki wynosiła 200 mikrolitrów. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.72 godziny po transdukcji sprawdź procent pojedynczego przewodnika RNA zawierającego komórki dodatnie BFP w każdym dołku za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj barwnika żywotności komórek, aby oznaczyć i wykluczyć martwe komórki z analizy. Kontynuuj ponowne posiałanie części komórek do nowych studzienek ze świeżą pożywką po każdej analizie faktów, aby uniknąć przerostu podczas testu.Co dwa do trzech dni powtarzaj analizę faktów, aby sprawdzić względną proporcję komórek dodatnich BFP w porównaniu z negatywnymi odpowiednikami BFP. Przeanalizuj procent komórek dodatnich BFP dla każdego punktu czasowego, korzystając z oprogramowania do analizy faktów. Kluczem do sukcesu konkurencyjnego testu proliferacji jest zastosowanie odpowiednich technik bramkowania, aby zapewnić, że ostateczna liczba żywych komórek jest dokładna.Przeciągnij pliki FCS dla każdej próbki do oprogramowania. Kliknij dwukrotnie dowolny plik próbny i narysuj wykres punktowy rozproszenia do przodu w stosunku do rozrzutu bocznego, z rozproszeniem do przodu na osi x i rozproszeniem bocznym na osi y. Bramka we wszystkich komórkach.Kliknij dwukrotnie bramkowane komórki i wykreśl plamę żywotności na osi y w porównaniu z wysokością rozproszenia do przodu lub wykresem kropkowym obszaru. Bramka żywotności barwi ujemne komórki. Kliknij dwukrotnie bramkowane komórki na żywo i wykreśl BFP na osi y w porównaniu z rozproszeniem do przodu na osi x.Bramka komórek dodatnich BFP. Zastosuj wszystkie te bramki do wszystkich próbek, przeciągając wybraną próbkę do wszystkich próbek na karcie grupy. Kliknij edytor tabel, aby utworzyć tabelę analizy wszystkich próbek.Przeciągnij dodatnią liczbę BFP z jednej próbki do tabeli i kliknij przycisk wyświetlania w edytorze tabel, aby utworzyć raport wsadowy wszystkich próbek, z tabelą wyświetlającą procent komórek dodatnich BFP. Zapisz tabelę jako plik programu Excel. System ten wykorzystano do zbadania roli genów, które mogą odgrywać rolę w proliferacji lub przetrwaniu ludzkich i mysich linii komórkowych AML.Celowanie w locus bezpiecznej przystani AAVS1 za pomocą dwóch oddzielnych pojedynczych przewodnikowych RNA nie miało wpływu na proliferację ludzkich komórek MOM13 Cas9 W przeciwieństwie do tego, gdy celem był gen związany z replikacją DNA, RPA3, zaobserwowano postępujący i znaczny spadek odsetka komórek BFP dodatnich w porównaniu z nietransdukowanymi odpowiednikami BFP ujemnymi. Podobnie, wpływ pojedynczych przewodnikowych RNA ukierunkowanych na Dot1l, regulator epigenetyczny, i rodopsynę, gen pigmentacji oka, przetestowano w mysich komórkach MLL-AF9 Cas9. Pojedyncze przewodnikowe RNA ukierunkowane na Dot1l wykazały dramatyczny i postępujący spadek konkurencyjnej proliferacji w przeciwieństwie do pojedynczych przewodników RNA ukierunkowanych na rodopsynę.Wyniki te pokazują podatność komórek białaczkowych MLL-AF9 eksprymujących masę na wyczerpanie Dot1l, potwierdzając wcześniej opublikowane wyniki. Zakładając od czterech do sześciu przewodnikowych RNA na gen, metoda ta dobrze nadaje się do równoległego testowania co najmniej 16 do 24 genów, a także może być stosowana do badania zależności genów w dowolnej linii komórek nowotworowych. W przypadku większej liczby genów, takich jak cały szlak molekularny, który musi zostać przetestowany w komórkach AML, bardziej przydatne będą badania przesiewowe oparte na CRISPR-Cas9.

investigation-genetic-dependencies-using-crispr-cas9-based

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Poznaj metodę CRISPR-Cas9 do badania genów w ostra białaczka szpikowa przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia szybką i skalowalną analizę proliferacji komórek nowotworowych.

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Przeglądaj więcej filmów