Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Ten film zademonstruje prostą metodę równoległego badania wielu genów kandydujących w AML przy użyciu systemu Crisper-Cas9 w połączeniu z testem wzrostu konkurencyjnego opartym na cytometrii przepływowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i skalowalna. Procedurę zademonstruje Bo Rui Chen, doktor habilitowany z naszego laboratorium.

Internetowe oprogramowanie do projektowania CRISPR służy do projektowania od czterech do sześciu pojedynczych przewodników RNA dla interesującego genu. Aby rozpocząć, wypełnij odpowiednie informacje w polach z gwiazdkami. Następnie wybierz genom docelowy do zaprojektowania pojedynczego przewodnika RNA.

Wklej sekwencję docelową w polu sekwencji i kliknij przycisk Prześlij. W celu sklonowania w pożądanym plazmidzie ekspresji pojedynczego przewodnika RNA, należy poprzedzić nukleotydy CACC do zmysłu oglionukleotydu i AAAC do odwrotnego komplementarnego oligonukleotydu antysensownego. Wstępnie zmieszane oligonukleotydy sensowne i antysensowne są następnie zamawiane w firmie na 96-dołkowej płytce, oznaczonej jako Oligo Mix.

Ustaw oddzielną płytkę U-Bottom 96 dołków, oznaczoną jako płyta do wyżarzania. Przygotuj główną mieszankę składającą się z jednego mikrolitra kinazy polinukleotydowej T4, jednego mikrolitra 10-krotnego buforu ligacyjnego DNA T4 i sześciu mikrolitrów wody na reakcję wyżarzania. Dodać 8 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki wyżarzającej, a następnie 2 mikrolitry wstępnie zmieszanych oligonukleotydów sensownych i antysensownych.

Delikatnie odpipetować dwa do trzech razy, aby dobrze wymieszać, a następnie krótko obrócić płytkę, aby mieszanki znalazły się na dnie studzienek. Użyj następującego programu wyżarzania w maszynie PCR. 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty i 30 sekund, a następnie powolne chłodzenie do 22 stopni Celsjusza w tempie 0,1 stopnia Celsjusza na sekundę.

Po zakończeniu wyżarzania przygotuj świeżą 96-dołkową płytkę, oznaczoną jako Rozcieńczona Mieszanka Oligo, rozcieńczając fosforylowane i wyżarzane oligonukleotydy z reakcji wyżarzania w stosunku jeden do 200 wodą. Linearyzować wektor ekspresji pojedynczego przewodnika RNA, trawiąc pięć mikrogramów wektora za pomocą 1,5 mikrolitra enzymu restrykcyjnego BBS1, używając odpowiedniego buforu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie weź świeżą 96-dołkową płytkę oznaczoną płytką ligacyjną i dodaj 20 nanogramów wektora ekspresyjnego RNA z pojedynczym przewodnikiem strawionym przez BBS1 do jednego dołka na pożądaną ligację RNA z pojedynczym przewodnikiem.

Do tego dodaj 2 mikrolitry fosforylowanych, wyżarzonych oligonukleotydów z rozcieńczonej płytki Oligo Mix. Dodaj do każdej studzienki jeden mikrolitr buforu ligazy 10X T4 i jeden mikrolitr enzymu ligazy T4 i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Około 10 minut przed zakończeniem reakcji ligacji napełnij lodem 90 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Przenieść 10 mikrolitrowych porcji właściwych komórek do każdej studzienki oddzielnej płytki 96-dołkowej indywidualnie. Dodaj mieszaninę ligacji do studzienek zawierających właściwe komórki.

Delikatnie pipetować w górę i w dół i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odpipetować pięć mikrolitrów DNA bakterii zmieszanych z każdej reakcji przemiany bezpośrednio do dołka na 6-dołkowej płytce, zawierającej agar LB ze 100 miligramami na mililitr ampicyliny. Dodaj około pięciu do ośmiu szklanych kulek do każdej studzienki i potrząśnij płytką 6-dołkową osiem do 10 razy okrężnymi ruchami.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wybierz jedną lub dwie pojedyncze kolonie z każdej studzienki za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów i rozprowadź ją na oznaczonym miejscu na sterylnej 10-centymetrowej szalce Petriego, z agarem LB i 100 miligramami na mililitr ampicyliny Po smugach na płytce LB wyrzuć końcówkę do trzech mililitrów pożywki ampicyliny w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem, oznaczone odpowiednim numerem klonu bakteryjnego. Płytka bakteryjna jest następnie wysyłana bezpośrednio do sekwencjonowania Sangera.

Po potwierdzeniu sekwencji sklonowanych pojedynczych przewodników RNA, oczyść DNA z odpowiedniej 14-mililitrowej probówki, używając zestawu miniprep zgodnie z instrukcjami producenta. Cząsteczki lentiwirusa z pojedynczym przewodnikiem RNA są wytwarzane w formacie 96-dołkowym, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. A wirusowy supernatant jest natychmiast zamrażany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Na dzień przed transdukcją pojedynczych przewodnikowych RNA w komórkach AML Cas9 pokryj 96-dołkową płytkę z płaskim dnem, niepoddawaną działaniu hodowli tkankowej, 100 mililitrami rekombinowanego ludzkiego fragmentu fibronektyny w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Owiń talerz folią spożywczą, aby uniknąć utraty parowania, i pozostaw go na noc na ławce. Następnego dnia usuń rekombinowany fragment ludzkiej fibronektyny z każdej studzienki z 96-dołkowej płytki.

Rozmrozić wirusowy supernatant każdego pojedynczego przewodnika RNA w temperaturze pokojowej. Dodać 50 mikrolitrów supernatantu wirusowego z każdej probówki do każdego powlekanego dołka płytki transdukcyjnej. Owiń płytkę folią spożywczą, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia podczas wirowania.

Obracaj płytkę z prędkością 1 300 razy g w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 90 minut. Pod koniec infekcji policz komórki klonu B3 o wysokiej ekspresji Cas9 z kolby hodowlanej. Po odliczeniu odwiruj wymaganą liczbę komórek i ponownie zawieś na świeżym podłożu.

Po 90-minutowej infekcji użyj pipety wielokanałowej dostosowanej do 50 mikrolitrów, aby powoli usunąć supernatant ze wszystkich studzienek, przechylając płytkę. Dodaj 100 mikrolitrów kultury klonów komórek B3 do każdej studzienki powoli, zsuwając się z krawędzi. Obracaj płytkę 1 300 razy g w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby komórki opadły na dno.

Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki do każdej studzienki zawierającej pojedyncze komórki transdukowane prowadzącym RNA, tak aby końcowa objętość pożywki wynosiła 200 mikrolitrów. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.

72 godziny po transdukcji sprawdź procent pojedynczego przewodnika RNA zawierającego komórki dodatnie BFP w każdym dołku za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj barwnika żywotności komórek, aby oznaczyć i wykluczyć martwe komórki z analizy. Kontynuuj ponowne posiałanie części komórek do nowych studzienek ze świeżą pożywką po każdej analizie faktów, aby uniknąć przerostu podczas testu.

Co dwa do trzech dni powtarzaj analizę faktów, aby sprawdzić względną proporcję komórek dodatnich BFP w porównaniu z negatywnymi odpowiednikami BFP. Przeanalizuj procent komórek dodatnich BFP dla każdego punktu czasowego, korzystając z oprogramowania do analizy faktów. Kluczem do sukcesu konkurencyjnego testu proliferacji jest zastosowanie odpowiednich technik bramkowania, aby zapewnić, że ostateczna liczba żywych komórek jest dokładna.

Przeciągnij pliki FCS dla każdej próbki do oprogramowania. Kliknij dwukrotnie dowolny plik próbny i narysuj wykres punktowy rozproszenia do przodu w stosunku do rozrzutu bocznego, z rozproszeniem do przodu na osi x i rozproszeniem bocznym na osi y. Bramka we wszystkich komórkach.

Kliknij dwukrotnie bramkowane komórki i wykreśl plamę żywotności na osi y w porównaniu z wysokością rozproszenia do przodu lub wykresem kropkowym obszaru. Bramka żywotności barwi ujemne komórki. Kliknij dwukrotnie bramkowane komórki na żywo i wykreśl BFP na osi y w porównaniu z rozproszeniem do przodu na osi x.

Bramka komórek dodatnich BFP. Zastosuj wszystkie te bramki do wszystkich próbek, przeciągając wybraną próbkę do wszystkich próbek na karcie grupy. Kliknij edytor tabel, aby utworzyć tabelę analizy wszystkich próbek.

Przeciągnij dodatnią liczbę BFP z jednej próbki do tabeli i kliknij przycisk wyświetlania w edytorze tabel, aby utworzyć raport wsadowy wszystkich próbek, z tabelą wyświetlającą procent komórek dodatnich BFP. Zapisz tabelę jako plik programu Excel. System ten wykorzystano do zbadania roli genów, które mogą odgrywać rolę w proliferacji lub przetrwaniu ludzkich i mysich linii komórkowych AML.

Celowanie w locus bezpiecznej przystani AAVS1 za pomocą dwóch oddzielnych pojedynczych przewodnikowych RNA nie miało wpływu na proliferację ludzkich komórek MOM13 Cas9 W przeciwieństwie do tego, gdy celem był gen związany z replikacją DNA, RPA3, zaobserwowano postępujący i znaczny spadek odsetka komórek BFP dodatnich w porównaniu z nietransdukowanymi odpowiednikami BFP ujemnymi. Podobnie, wpływ pojedynczych przewodnikowych RNA ukierunkowanych na Dot1l, regulator epigenetyczny, i rodopsynę, gen pigmentacji oka, przetestowano w mysich komórkach MLL-AF9 Cas9. Pojedyncze przewodnikowe RNA ukierunkowane na Dot1l wykazały dramatyczny i postępujący spadek konkurencyjnej proliferacji w przeciwieństwie do pojedynczych przewodników RNA ukierunkowanych na rodopsynę.

Wyniki te pokazują podatność komórek białaczkowych MLL-AF9 eksprymujących masę na wyczerpanie Dot1l, potwierdzając wcześniej opublikowane wyniki. Zakładając od czterech do sześciu przewodnikowych RNA na gen, metoda ta dobrze nadaje się do równoległego testowania co najmniej 16 do 24 genów, a także może być stosowana do badania zależności genów w dowolnej linii komórek nowotworowych. W przypadku większej liczby genów, takich jak cały szlak molekularny, który musi zostać przetestowany w komórkach AML, bardziej przydatne będą badania przesiewowe oparte na CRISPR-Cas9.