Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka
January 9th, 2019
Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.
Chłoniaki są histologicznie złożonymi nowotworami. Dlatego multipleksowana immunohistochemia fluorescencyjna oferuje przewagę nad konwencjonalną immunohistochemią chromogenną w badaniu markerów zainteresowania w komórkach nowotworowych i mikrośrodowisku. Technika ta ma potencjał do standaryzacji punktacji barwienia na podstawie przeciwciał w próbkach chłoniaka histologicznego, procesu, który w przeszłości był wyzwaniem ze względu na złożoność mikrośrodowiska guza.
W szczególności multipleksowana immunohistochemia fluorescencyjna i obrazowanie spektralne umożliwiają ilościowy pomiar wielu barwników na jednym szkiełku, umożliwiając w ten sposób ocenę ekspresji antygenu i relacji przestrzennej w materiale klinicznym. Zacznij od zanurzenia odwoskowanych i ponownie uwodnionych szkiełek w standardowym buforze do odzyskiwania antygenu w szklanym słoiku do kuchenki mikrofalowej i przeprowadzenia indukowanego ciepłem pobierania epitopów w odpowiedniej kuchence mikrofalowej. Wykonaj dodatkowe rundy odpędzania mikrofalowego w oparciu o położenie przeciwciała w końcowej sekwencji multipleksu.
Na przykład czwarte przeciwciało wymaga trzech dodatkowych rund usuwania mikrofalowego przed barwieniem. Po zakończeniu procesu zdejmowania izolacji za pomocą kleszczy i rękawic żaroodpornych przenieś szkiełka do wody destylowanej o temperaturze pokojowej na co najmniej 10 minut schładzania. Gdy roztwór do pobierania antygenu ostygnie, zablokuj aktywność peroksydazy tkankowej za pomocą komercyjnego bloku peroksydazy na 10 minut, a następnie przepłucz pięciominutowym roztworem soli fizjologicznej buforowanej trisem lub TBS i niejonowym detergentem.
Zablokować wszelkie niespecyficzne barwienie za pomocą 10-minutowej inkubacji w buforze blokującym, a następnie inkubacji z głównym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut i trzech pięciominutowych płukań buforem TBS-D. Następnie inkubować próbki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przemywać buforem TBS-D, jak pokazano. Po ostatnim przemyciu nanieść odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu na szkiełka na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie trzy pięciominutowe płukanie TBS-D.
Wykonać dodatkowe oddzielanie na bazie mikrofal w celu usunięcia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych ze świeżego roztworu do pobierania antygenu, jak pokazano. Pod koniec pobierania schłodzić szkiełka w wodzie destylowanej i osuszyć obszary na szkiełkach bez chusteczek chusteczkami laboratoryjnymi. Inkubować szkiełko z dappy przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy przemycia TBS-D.
Następnie ostrożnie osusz szkiełka chusteczkami laboratoryjnymi bez kontaktu z tkankami i zamontuj próbki za pomocą odpowiedniego podłoża montażowego do obrazowania. W przypadku skanowania szkiełkami monopleksowymi należy wybrać odpowiednie filtry z fluoroforów używanych do znakowania próbek i zbadać każdy marker oraz odpowiadający mu kanał fluorescencyjny, aby określić odpowiedni czas ekspozycji w celu uzyskania czystego sygnału, koncentrując się na składniku tkanki, który powinien mieć najsilniejszy sygnał dla markera. Aby umożliwić porównanie intensywności pikseli między próbkami, użyj ustawienia kamery na żywo, aby dostosować czas ekspozycji w każdym pojedynczym kanale, aż do momentu, gdy na obrazie z kamery na żywo nie będzie prześwietlonych obszarów.
Po zeskanowaniu wszystkich preparatów należy uzyskać symulowane obrazy w jasnym polu, aby wizualnie porównać je z normalnym wzorcem immunohistochemicznym i określić, czy wzór barwienia jest prawidłowy. Aby zeskanować szkiełka z mikromacierzy tkankowej, należy użyć trybu skanowania mikromacierzy tkankowej w systemie obrazowania i odpowiedniego algorytmu automatycznego ustawiania ostrości. W przypadku preparatów z całego przekroju tkanki należy zlecić przegląd szkiełek wykwalifikowanemu patologowi, aby wybrać optymalne obrazy z najbardziej reprezentatywnych obszarów guza.
Przed rozpoczęciem analizy należy wybrać marker nowotworowy, aby zidentyfikować komórki będące przedmiotem zainteresowania do analizy. Poproś patologa, aby przejrzał obrazy i zdecydował, czy wymagana jest segmentacja tkanek. W razie potrzeby wybierz odpowiednie regiony kontrolne do segmentacji i sprawdź, czy oprogramowanie do analizy obrazu może poprawnie zidentyfikować takie obszary.
Po segmentacji komórek poproś patologa, aby przejrzał mapę segmentacji, aby upewnić się o wierności zamierzonego podejścia do segmentacji i przejrzał poszczególne obrazy, aby określić, czy segmentacja komórek jest odpowiednia, czy też wymagana jest dodatkowa segmentacja tkanek w celu wybrania regionów wzbogaconych o komórki nowotworowe, zrąb i/lub martwicę. Następnie określ dodatnią wartość odcięcia intensywności optycznej dla każdego markera we współpracy z patologiem i wygeneruj histogramy w odpowiednim oprogramowaniu statystycznym, aby przeanalizować rozkład częstotliwości intensywności markera na komórkę. Aby wygenerować dane procentowe dla określonych markerów zainteresowania w zdefiniowanych komórkach, wstaw tabelę przestawną do arkusza danych i wybierz opcję Suma, aby obliczyć procent dodatniości pojedynczego znacznika zainteresowania.
Zostanie obliczona całkowita liczba komórek dodatnich markerów podzielona przez całkowitą liczbę. Wynikiem jest odsetek komórek z dodatnim markerem z jednym rdzeniem lub jednym numerem badania. Aby wygenerować dane liczbowe, należy uzyskać średnią intensywność każdego markera będącego przedmiotem zainteresowania we wszystkich badanych komórkach w próbce, aby wyodrębnić medianę znormalizowanej liczby dla każdego markera każdego rdzenia lub numeru badania.
Tutaj pokazano reprezentatywne multipleksowe fluorescencyjne obrazy immunohistochemiczne dla rozlanej próbki chłoniaka z dużych komórek B z rearanżacją genu c-MYC i BCL2. Symulowane obrazy immunohistochemiczne w jasnym polu wykazują podobny wzór barwienia markerów nowotworowych. Zastosowanie multipleksowych fluorescencyjnych obrazów immunohistochemicznych do panelu komórek T w angioimmunoblastycznych chłoniakach z komórek T ujawnia niejednorodność komórek w próbce guza.
W tym miejscu pokazano optymalizację próbki kontrolnej migdałków i wynikającą z niej analizę danych. Po etapie rozmieszania można użyć różnych programów do analizy obrazu w celu ilościowego określenia ekspresji i lokalizacji markerów w komórkach nowotworowych i mikrośrodowisku guza. Technika ta toruje naukowcom drogę do badania koekspresji wielu markerów w określonych typach komórek w pojedynczych odcinkach tkanki chłoniaka.
Uważaj, aby zapobiec obrażeniom spowodowanym wysoką temperaturą podczas podgrzewania w kuchence mikrofalowej i pamiętaj o ryzyku upadku podczas etapów skanowania, które są wykonywane na pokładzie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
W tym artykule przedstawiono protokół barwienia i obrazowania wielokrotnego immunochemicznego z użyciem fluorescencji w celu zlokalizowania wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniakach. Metoda umożliwia analizę kolokalizacji biomarkerów w przekrojach tkanek.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuroscience
- Immunohistochemia
- Biologia nowotworowa
Tło
- Chłoniaki to histologicznie złożone guzy.
- Wielokrotna immunochemia fluorescencyjna zapewnia zalety w porównaniu z konwencjonalnymi metodami.
- Technika ta pomaga w badaniu markerów nowotworowych i mikrośrodowiska.
- Standaryzacja oceny barwienia opartego na przeciwciałach była historycznie trudna.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do jednoczesnej lokalizacji antygenów związanych z rakiem.
- Ułatwienie oceny współwystępowania antygenów.
- Poprawa zrozumienia zależności przestrzennych w materiale klinicznym.
Wykorzystane metody
- Zanurzenie odtłuszczonych i rehydratowanych preparatów w buforze do odzyskiwania antygenu.
- Odzyskiwanie epitopu indukowane ciepłem przy użyciu mikrofalówki.
- Dodatkowe usuwanie z preparatów przez działanie mikrofalówki w zależności od pozycji przeciwciała.
- Ilościowy pomiar wielu barwników na pojedynczym preparacie.
Główne wyniki
- Pomyślna lokalizacja wielu antygenów związanych z rakiem.
- Wzmocniona zdolność oceny współwystępowania antygenów.
- Poprawa standaryzacji oceny w próbkach histologicznych.
- Ułatwiona analiza mikrośrodowiska guza.
Wnioski
- Wielokrotna immunochemia fluorescencyjna jest cennym narzędziem do badań nad chłoniakami.
- Protokół można dostosować do różnych przekrojów tkanek.
- Metoda ta może prowadzić do lepszego zrozumienia biologii raka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Multiplexed fluorescent immunohistochemistry enables quantitative assessment of multiple protein targets within complex lymphoma tissue sections, addressing a key challenge in biomarker validation. By preserving spatial context and minimizing sample consumption, the method supports mechanistic de-risking in early discovery and improves predictive confidence for target prioritization. This capability enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation in oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through co-expression analysis of lymphoma subtype markers in specific cell types.
- Operational Value: Reduces sample utilization by allowing multiplexed readouts from single tissue sections, increasing throughput in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by clarifying antigen spatial relationships within the tumor microenvironment, informing functional target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative outputs including mean intensity and percentage positivity per marker, enabling standardized scoring across histological samples.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through optimized antibody stripping and staining cycles, improving reproducibility in biomarker assays.
- Platform Reuse: Compatible with tissue microarray (TMA) scanning and whole tissue section analysis, supporting scalable screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains spatial and quantitative fidelity from discovery samples through preclinical validation, supporting biomarker alignment.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions by quantifying marker expression in defined cellular compartments of lymphoma models.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in pathway interpretation by resolving antigen co-expression patterns in complex tumor stroma.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supporting hypothesis testing in early biology, enabling assay-ready biomarker panels for screening, and providing quantitative analytics for translational decision-making.
- Discovery Biology: Supports target validation through multiplexed detection of lymphoma markers in tumor and microenvironment compartments.
- Screening: Enables reproducible, quantitative biomarker assessment via standardized staining and imaging protocols suitable for high-content analysis.
- Analytics: Delivers normalized intensity and positivity percentage readouts that facilitate comparative analysis across conditions and samples.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by preserving spatial context and enabling correlation with phenotypic outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunostaining and imaging capability applicable across lymphoma subtypes and therapeutic target panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity through spatial multiplexing.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of IHC scoring, reducing inter-operator variability in biomarker assessment.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling parallel biomarker evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets through quantitative, spatially resolved expression data in lymphoma models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, spectral imaging, and image analysis for multiplex fluorescent workflows.
- Dependent on microwave-based antigen retrieval and stripping infrastructure, with optimization needed per antibody sequence.
- Necessitates cross-team standardization between pathology, imaging, and data analysis for consistent segmentation and threshold setting.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to new tissue types or antibody panels beyond lymphoma models.
- Includes practical limitations such as potential signal degradation during iterative stripping and the need for careful thermal control to prevent tissue damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:57
Monoplex Tyramide-Based Immunofluorescence
3:22
Monoplex Slide and Tissue Microarray (TMA) Scanning
4:36
Data Analysis
6:28
Results: Representative Mutiplexed Fluorescent Immunohistochemical (mf-IHC) Staining, Imaging, and Analysis
7:10
Conclusion
