Name: Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj technikę multipleksowanego fluorescencyjnego barwienia immunohistochemicznego do lokalizacji antygenów nowotworowych w chłoniaku. Ta metoda umożliwia ilościową analizę współekspresji markerów w pojedynczym preparacie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.-B.N. i A.D.J. są wspierane przez Narodową Radę ds. Badań Medycznych Singapuru (NMRC/TA/0020/2013 i NMRC/TA/0052/2016). Autorzy potwierdzają przyznanie grantu badawczego Yong Siew Yoon dla A.D.J. z National University Cancer Institute of Singapore na zakup mikroskopu do obrazowania spektralnego Vectra. To badanie zostało zatwierdzone przez Singapore NHG Domain Specific Review Board B (2014/00693).

<ol><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwerdlow%2C+SH+%22WHO+Classification+of+Tumours+of+Haematopoietic+and+Lymphoid+Tissues%22">WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues</a>. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).</li>
<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li>
<li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDabbs%2C+DJ+%22Diagnostic+Immunohistochemistry.+Theranostic+and+Genomic+Applications%22">Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications</a>. , Saunders. (2010).</li>
<li>Kim, S. -W., Roh, J., Park, C. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+Pathologists%3A+Protocols%2C+Pitfalls%2C+and+Tips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Anderson, M. W., Natkunam, Y. Immunohistochemical profiling of lymphoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MW+%22Neoplastic+Hematopathology%3A+Experimental+and+Clinical+Approaches%22">Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches</a>. Jones, D. , Humana Press. 21-44 (2010).</li>
<li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Tóth, Z. E., Mezey, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Ng, S. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+TECHNOLOGY%3A+Translating+Life+Sciences+Innovation%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li>
<li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364(2017).</li>
<li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKalyuzhny%2C+AE+%22Signal+Transduction+Immunohistochemistry%3A+Methods+and+Protocols%22">Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+validation%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li>
<li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vectra+3+Quantitative+Pathology+Imaging+System+User%27s+Manual%22">Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual</a>. , PerkinElmer, Inc. (2012).</li>
<li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+P+values%3A+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology+Author+Choice%22%5BJournal%5D)">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li>
<li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Opal+Multiplex+IHC+Assay+Development+Guide%22">Opal Multiplex IHC Assay Development Guide</a>. , PerkinElmer, Inc. (2017).</li>
</ol>

A.D.J. otrzymał dofinansowanie od PerkinElmer na podróże na spotkania grup użytkowników. Autorzy nie mają do ujawnienia żadnego innego konfliktu interesów.

mf-IHC ma potencjał, aby umożliwić patologom udoskonalenie kryteriów diagnostycznych w patologii limfoidalnej i analizę roli biomarkerów w określonych typach komórek w celu przewidywania wyników klinicznych. Jako nowa metoda badawcza, mf-IHC jest coraz częściej stosowana do ilościowej i przestrzennej identyfikacji wielu parametrów immunologicznych komórek nowotworowych17. Wykazano, że wykrywanie mf-IHC dla koekspresji biomarkerów nowotworowych jest powtarzalne i wiarygodne5...

Nowotwory limfoidalne są spowodowane niekontrolowaną złośliwą proliferacją limfocytów. Komórki te są istotnymi składnikami układu odpornościowego i lokalizują się w pierwotnych i wtórnych narządach odpornościowych, takich jak szpik kostny, węzły chłonne, śledziona i inny układ limfatyczny związany z błoną śluzową. Nowotwory układu chłonnego to niejednorodna grupa zaburzeń, które są klasyfikowane na podstawie konstelacji cech, w tym morfologii, immunofenotypu, cech genetycznych i obrazu klinicznego. Chociaż każdy parametr odgrywa pewną rolę, pochodzenie pozostaje cechą definiującą i stanowi podstawę systemu klasyfikacji WHO, który rozpoznaje nowotwory pochodzące z limfocytów B, limfocytów T i komórek NK (natural killer)1.
Kluczem do klasyfikacji chłoniaka była charakterystyka przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym leukocytów różnych podtypów limfocytów<klasa SUP="xref">2. Immunohistochemia (IHC) jest tradycyjnie stosowana do analizy takich markerów i opiera się na zasadzie specyficznego rozpoznawania przeciwciał antygenowych w celu wykrywania cząsteczek komórkowych i tkankowych, które można zwizualizować za pomocą mikroskopu świetlnego3. Jednak identyfikacja wielu celów na jednym szkiełku za pomocą konwencjonalnego multipleksu chromogenicznego IHC w jasnym polu ma ograniczenia, ponieważ często trudno jest niezawodnie rozróżnić wiele sygnałów kolorów na jednym fragmencie tkanki - szczególnie w przypadku antygenów o bardzo niskiej ekspresji4. Wizualna ocena i kwantyfikacja barwienia może być również subiektywna, powodując zmienność w analizie i interpretacji danych5.
Dlatego konwencjonalne IHC na próbkach z zatopioną parafiną (FFPE) nie jest możliwe do jednoczesnego wykrywania wielu celów w chorobach immunologicznie zróżnicowanych, takich jak chłoniak. Ponadto odróżnienie limfocytów nowotworowych od otaczających je komórek odpornościowych jest często nieprecyzyjne. Utrudnia to badania nad znaczeniem nowych biomarkerów w chłoniaku. W tym kontekście, multipleksowy fluorescencyjny IHC (mf-IHC) stanowi obiecującą alternatywę, ponieważ umożliwia ilościową ocenę koekspresji antygenu i zależności przestrzennej z większą precyzją przy jednoczesnym zachowaniu ograniczonych próbek6,7. Gdy ta technologia obrazowania jest połączona z oprogramowaniem do cyfrowej analizy obrazu, interpretacja danych jest bardziej wydajna i ułatwia badanie niejednorodności guza i mikrośrodowiska8,9. W tym protokole w celu wzmocnienia sygnału stosuje się metodę multipleksowania immunofluorescencji opartej na tyramidzie (IF), która jest kompatybilna z dowolnym przeciwciałem zatwierdzonym przez IHC od dowolnego gatunku gospodarza, nawet tych opracowanych u tego samego gatunku5,7,10. Protokół oparty na tyramidzie pozwala na bezpośrednie sprzężenie fluoroforu z tkanką będącą przedmiotem zainteresowania, tak aby przeciwciało pierwszorzędowe i drugorzędowe mogło zostać usunięte po każdym etapie, co pozwala na sekwencyjne stosowanie wielu barwień bez reaktywności krzyżowej przeciwciał.
Strategia multipleksowania będzie przydatna do przewidywania rokowania i wyników leczenia poprzez identyfikację celów i ich wariantów immunologicznych w chłoniakach. Multipleksowy fluorescencyjny IHC został zastosowany w naszym laboratorium do badania panelu markerów limfocytów T i B oraz markerów pomocniczych pęcherzyków T w angioimmunoblastycznym chłoniaku z komórek T (AITL), podtypie obwodowego chłoniaka z komórek T, charakteryzującego się agresywnym zachowaniem klinicznym i niejednorodnością guza11. Użyteczność tej metody jest również zilustrowana w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B (DLBCL), gdzie zwiększona sygnalizacja receptora komórek B z jednoczesną ekspresją C-MYC i BCL-2 sugeruje potencjalne zastosowanie terapeutyczne hamowania kinazy tyrozynowej Brutona12. 
Tutaj opisujemy cały protokół, od walidacji przeciwciał do wyboru odpowiednich tkanek kontrolnych i multipleksowania za pomocą tkanek chłoniaka FFPE, z ostateczną analizą wybarwionych preparatów za pomocą skaningowego automatycznego systemu obrazowania ilościowego patologii.

<table><tbody><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>DAKO</td><td>REF S3022</td><td>Blokujący</td></tr><tr><td>roztwór blokujący peroksydazę</td><td>DAKO</td><td>S2023</td><td>Do blokowania nadtlenków</td></tr><tr><td>Wielospektralny mikroskop automatyczny Vectra</td><td>Perkin Elmer</td><td>Vectra2.0.8</td><td>Obrazowanie spektralne</td></tr><tr><td>absolutnego etanolu</td><td>EMSURE</td><td>1.00983.2500</td><td>Alkohol etylowy do ponownego nawodnienia</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik wzmacniający</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1135</td><td>Bufor rozcieńczalnika fluoroforowego</td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG [Koza] Znakowane HRP</td><td>PERKIN ELMER</td><td>NEF822001EA</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Anty-królicze IgG [Koza] Znakowane HRP</td><td>PERKIN ELMER</td><td>NEF812001EA</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>BCL2</td><td>DAKO</td><td>klon 124 (nr partii 20031561)(RRID-AB578693)</td><td>pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>BCL6</td><td>LEICA</td><td>NCL-L-Bcl6-564 (nr partii 6050438) (RRID-AB563429)</td> <td>przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>CD20</td><td>DAKO</td><td>klon L26 (nr partii 20028627) (RRID-AB442055)</td> <td>przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>c-MYC</td><td>ABCAM</td><td>Y 69 klon ab32072 (nr partii GR29511133)(RRID-AB731658)przeciwciało</td> <td>pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Cy 5</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1171</td><td>Odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 7</td><td>Graph pad</td><td></td><td>Oprogramowanie statystyczne</td></tr><tr><td>HistoClear Clearing Agent</td><td>SIGMA</td><td>H2779-1L</td><td>Histoclear do odparafinowania i czyszczenia</td></tr><tr><td>inForm Advanced Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Perkin Elmer</td><td>Inform Software 2.2.1</td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>KI67</td><td>DAKO</td><td>Clone MIB-1 (nr partii 20040401) (RRID-AB2314699)przeciwciało</td> <td>pierwotne</td></tr><tr><td>KOS MILESTONE wielofunkcyjny procesor tkankowy</td> Milestone <td>Mikrofalówka do indukowanego ciepłem pobierania epitopów</td><td>Mikrofalówka</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PANASONIC</td><td>NN-ST651M</td><td>Usuwanie mikrofalowe</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>81381 Aldrich Mowiol&reg; 4-88</td><td>Nośnik montażowy</td></tr><tr><td>Opal 570</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1488</td><td>Odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu</td></tr><tr><td>Opal520</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1487B21</td><td>Odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu</td></tr><tr><td>Opal540</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1494</td><td>Odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu</td></tr><tr><td>Opal620</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1495</td><td>Odpowiedni tyramid odczynnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Szkiełko pokryte poli-L-lizyną</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>120-550-15</td><td>Szkiełko do adhezji przekrojów tkanek w rutynowym zastosowaniu histologicznym</td></tr><tr><td>Spectral DAPI</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1490</td><td>barwienie kwasem nukleinowym</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania celu, pH9,0 (10x)</td> <td>DAKO</td><td>S2367</td><td>Do HIER</td></tr><tr><td>Tris Bufor sól fizjologiczna (TBS)</td><td>1. BAZA</td><td>BUF3030 20X4L</td><td>do buforu wash</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>P1379-1L</td><td>Tween</td></tr></tbody></table>

multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Metody immunohistochemiczne (IHC) do analizy in-situ ekspresji białek za pomocą mikroskopii świetlnej są potężnym narzędziem zarówno do celów badawczych, jak i diagnostycznych. Jednak wizualizacja i kwantyfikacja wielu antygenów w jednym wycinku tkanki przy użyciu konwencjonalnego chromogennego IHC jest wyzwaniem. Obrazowanie multipleksowe jest szczególnie istotne w badaniach i diagnostyce chłoniaków, gdzie markery muszą być interpretowane w kontekście złożonego mikrośrodowiska guza. W tym miejscu opisujemy protokół multipleksowanego barwienia fluorescencyjnego IHC, aby umożliwić ilościową ocenę wielu celów w określonych typach komórek będących przedmiotem zainteresowania w chłoniaku. Metoda obejmuje aspekty walidacji przeciwciał, optymalizacji przeciwciał, optymalizacji multipleksu z markerami podtypów chłoniaka, barwienia szkiełek z mikromacierzy tkankowej (TMA) oraz skanowania szkiełek, a następnie analizy danych, ze szczególnym odniesieniem do chłoniaka. Za pomocą tej metody generowane są wyniki zarówno dla średniej intensywności markera zainteresowania, jak i procentowej pozytywności, aby ułatwić dalszą analizę ilościową. Multipleksowanie minimalizuje wykorzystanie próbki i dostarcza informacji przestrzennych dla każdego markera będącego przedmiotem zainteresowania.

Obrazy mf-IHC dla próbki DLBCL z rearanżacją genów C-MYC i BCL2 (chłoniak double-hit) przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2 ilustruje symulowane obrazy immunohistochemiczne w jasnym polu. Rysunek 3 wskazuje sposób generowania danych procentowych. Rysunek 4 przedstawia szczegóły wzoru na medianę służącego do generowania danych liczbowych. Rysunek 5</s...

Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Chłoniaki są histologicznie złożonymi nowotworami. Dlatego multipleksowana immunohistochemia fluorescencyjna oferuje przewagę nad konwencjonalną immunohistochemią chromogenną w badaniu markerów zainteresowania w komórkach nowotworowych i mikrośrodowisku. Technika ta ma potencjał do standaryzacji punktacji barwienia na podstawie przeciwciał w próbkach chłoniaka histologicznego, procesu, który w przeszłości był wyzwaniem ze względu na złożoność mikrośrodowiska guza.W szczególności multipleksowana immunohistochemia fluorescencyjna i obrazowanie spektralne umożliwiają ilościowy pomiar wielu barwników na jednym szkiełku, umożliwiając w ten sposób ocenę ekspresji antygenu i relacji przestrzennej w materiale klinicznym. Zacznij od zanurzenia odwoskowanych i ponownie uwodnionych szkiełek w standardowym buforze do odzyskiwania antygenu w szklanym słoiku do kuchenki mikrofalowej i przeprowadzenia indukowanego ciepłem pobierania epitopów w odpowiedniej kuchence mikrofalowej. Wykonaj dodatkowe rundy odpędzania mikrofalowego w oparciu o położenie przeciwciała w końcowej sekwencji multipleksu.Na przykład czwarte przeciwciało wymaga trzech dodatkowych rund usuwania mikrofalowego przed barwieniem. Po zakończeniu procesu zdejmowania izolacji za pomocą kleszczy i rękawic żaroodpornych przenieś szkiełka do wody destylowanej o temperaturze pokojowej na co najmniej 10 minut schładzania. Gdy roztwór do pobierania antygenu ostygnie, zablokuj aktywność peroksydazy tkankowej za pomocą komercyjnego bloku peroksydazy na 10 minut, a następnie przepłucz pięciominutowym roztworem soli fizjologicznej buforowanej trisem lub TBS i niejonowym detergentem.Zablokować wszelkie niespecyficzne barwienie za pomocą 10-minutowej inkubacji w buforze blokującym, a następnie inkubacji z głównym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut i trzech pięciominutowych płukań buforem TBS-D. Następnie inkubować próbki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przemywać buforem TBS-D, jak pokazano. Po ostatnim przemyciu nanieść odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu na szkiełka na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie trzy pięciominutowe płukanie TBS-D.Wykonać dodatkowe oddzielanie na bazie mikrofal w celu usunięcia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych ze świeżego roztworu do pobierania antygenu, jak pokazano. Pod koniec pobierania schłodzić szkiełka w wodzie destylowanej i osuszyć obszary na szkiełkach bez chusteczek chusteczkami laboratoryjnymi. Inkubować szkiełko z dappy przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy przemycia TBS-D.Następnie ostrożnie osusz szkiełka chusteczkami laboratoryjnymi bez kontaktu z tkankami i zamontuj próbki za pomocą odpowiedniego podłoża montażowego do obrazowania. W przypadku skanowania szkiełkami monopleksowymi należy wybrać odpowiednie filtry z fluoroforów używanych do znakowania próbek i zbadać każdy marker oraz odpowiadający mu kanał fluorescencyjny, aby określić odpowiedni czas ekspozycji w celu uzyskania czystego sygnału, koncentrując się na składniku tkanki, który powinien mieć najsilniejszy sygnał dla markera. Aby umożliwić porównanie intensywności pikseli między próbkami, użyj ustawienia kamery na żywo, aby dostosować czas ekspozycji w każdym pojedynczym kanale, aż do momentu, gdy na obrazie z kamery na żywo nie będzie prześwietlonych obszarów.Po zeskanowaniu wszystkich preparatów należy uzyskać symulowane obrazy w jasnym polu, aby wizualnie porównać je z normalnym wzorcem immunohistochemicznym i określić, czy wzór barwienia jest prawidłowy. Aby zeskanować szkiełka z mikromacierzy tkankowej, należy użyć trybu skanowania mikromacierzy tkankowej w systemie obrazowania i odpowiedniego algorytmu automatycznego ustawiania ostrości. W przypadku preparatów z całego przekroju tkanki należy zlecić przegląd szkiełek wykwalifikowanemu patologowi, aby wybrać optymalne obrazy z najbardziej reprezentatywnych obszarów guza.Przed rozpoczęciem analizy należy wybrać marker nowotworowy, aby zidentyfikować komórki będące przedmiotem zainteresowania do analizy. Poproś patologa, aby przejrzał obrazy i zdecydował, czy wymagana jest segmentacja tkanek. W razie potrzeby wybierz odpowiednie regiony kontrolne do segmentacji i sprawdź, czy oprogramowanie do analizy obrazu może poprawnie zidentyfikować takie obszary.Po segmentacji komórek poproś patologa, aby przejrzał mapę segmentacji, aby upewnić się o wierności zamierzonego podejścia do segmentacji i przejrzał poszczególne obrazy, aby określić, czy segmentacja komórek jest odpowiednia, czy też wymagana jest dodatkowa segmentacja tkanek w celu wybrania regionów wzbogaconych o komórki nowotworowe, zrąb i/lub martwicę. Następnie określ dodatnią wartość odcięcia intensywności optycznej dla każdego markera we współpracy z patologiem i wygeneruj histogramy w odpowiednim oprogramowaniu statystycznym, aby przeanalizować rozkład częstotliwości intensywności markera na komórkę. Aby wygenerować dane procentowe dla określonych markerów zainteresowania w zdefiniowanych komórkach, wstaw tabelę przestawną do arkusza danych i wybierz opcję Suma, aby obliczyć procent dodatniości pojedynczego znacznika zainteresowania.Zostanie obliczona całkowita liczba komórek dodatnich markerów podzielona przez całkowitą liczbę. Wynikiem jest odsetek komórek z dodatnim markerem z jednym rdzeniem lub jednym numerem badania. Aby wygenerować dane liczbowe, należy uzyskać średnią intensywność każdego markera będącego przedmiotem zainteresowania we wszystkich badanych komórkach w próbce, aby wyodrębnić medianę znormalizowanej liczby dla każdego markera każdego rdzenia lub numeru badania.Tutaj pokazano reprezentatywne multipleksowe fluorescencyjne obrazy immunohistochemiczne dla rozlanej próbki chłoniaka z dużych komórek B z rearanżacją genu c-MYC i BCL2. Symulowane obrazy immunohistochemiczne w jasnym polu wykazują podobny wzór barwienia markerów nowotworowych. Zastosowanie multipleksowych fluorescencyjnych obrazów immunohistochemicznych do panelu komórek T w angioimmunoblastycznych chłoniakach z komórek T ujawnia niejednorodność komórek w próbce guza.W tym miejscu pokazano optymalizację próbki kontrolnej migdałków i wynikającą z niej analizę danych. Po etapie rozmieszania można użyć różnych programów do analizy obrazu w celu ilościowego określenia ekspresji i lokalizacji markerów w komórkach nowotworowych i mikrośrodowisku guza. Technika ta toruje naukowcom drogę do badania koekspresji wielu markerów w określonych typach komórek w pojedynczych odcinkach tkanki chłoniaka.Uważaj, aby zapobiec obrażeniom spowodowanym wysoką temperaturą podczas podgrzewania w kuchence mikrofalowej i pamiętaj o ryzyku upadku podczas etapów skanowania, które są wykonywane na pokładzie.

multiplexed-fluorescent-immunohistochemical-staining-imaging-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Multiplex fluorescencyjna immunohistochemia to nowa technologia, która umożliwia wizualizację wielu typów komórek w nienaruszonej, utrwalonej formaliną, zatopionej parafinie tkance (FFPE). Przedstawiono wytyczne dotyczące zapewnienia udanego 7-kolorowego multipleksu wraz z instrukcjami dotyczącymi optymalizacji przeciwciał i odczynników, przygotowaniem preparatów, projektem i wskazówkami dotyczącymi unikania typowych problemów.

Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprowadzana jest charakterystyka komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza za pomocą multipleksowej immunohistochemii.

Multipleksowa analiza immunohistochemiczna przestrzennego krajobrazu komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.

Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia pozwala na wykrywanie in situ wielu markerów jednocześnie przy użyciu wielokrotnej inkubacji przeciwciał antygenowych, skanowania obrazu oraz dopasowywania i integracji obrazu. W tym miejscu przedstawiamy protokół operacyjny identyfikacji substratów komórek odpornościowych za pomocą tej technologii w próbkach raka płuc i sparowanych próbkach przerzutów do mózgu.

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Poznaj technikę multipleksowanego fluorescencyjnego barwienia immunohistochemicznego do lokalizacji antygenów nowotworowych w chłoniaku. Ta metoda umożliwia ilościową analizę współekspresji markerów w pojedynczym preparacie.

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

Przeglądaj więcej filmów