Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka
9 stycznia 2019
Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.
Chłoniaki są histologicznie złożonymi nowotworami. Dlatego multipleksowana immunohistochemia fluorescencyjna oferuje przewagę nad konwencjonalną immunohistochemią chromogenną w badaniu markerów zainteresowania w komórkach nowotworowych i mikrośrodowisku. Technika ta ma potencjał do standaryzacji punktacji barwienia na podstawie przeciwciał w próbkach chłoniaka histologicznego, procesu, który w przeszłości był wyzwaniem ze względu na złożoność mikrośrodowiska guza.
W szczególności multipleksowana immunohistochemia fluorescencyjna i obrazowanie spektralne umożliwiają ilościowy pomiar wielu barwników na jednym szkiełku, umożliwiając w ten sposób ocenę ekspresji antygenu i relacji przestrzennej w materiale klinicznym. Zacznij od zanurzenia odwoskowanych i ponownie uwodnionych szkiełek w standardowym buforze do odzyskiwania antygenu w szklanym słoiku do kuchenki mikrofalowej i przeprowadzenia indukowanego ciepłem pobierania epitopów w odpowiedniej kuchence mikrofalowej. Wykonaj dodatkowe rundy odpędzania mikrofalowego w oparciu o położenie przeciwciała w końcowej sekwencji multipleksu.
Na przykład czwarte przeciwciało wymaga trzech dodatkowych rund usuwania mikrofalowego przed barwieniem. Po zakończeniu procesu zdejmowania izolacji za pomocą kleszczy i rękawic żaroodpornych przenieś szkiełka do wody destylowanej o temperaturze pokojowej na co najmniej 10 minut schładzania. Gdy roztwór do pobierania antygenu ostygnie, zablokuj aktywność peroksydazy tkankowej za pomocą komercyjnego bloku peroksydazy na 10 minut, a następnie przepłucz pięciominutowym roztworem soli fizjologicznej buforowanej trisem lub TBS i niejonowym detergentem.
Zablokować wszelkie niespecyficzne barwienie za pomocą 10-minutowej inkubacji w buforze blokującym, a następnie inkubacji z głównym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut i trzech pięciominutowych płukań buforem TBS-D. Następnie inkubować próbki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przemywać buforem TBS-D, jak pokazano. Po ostatnim przemyciu nanieść odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu na szkiełka na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie trzy pięciominutowe płukanie TBS-D.
Wykonać dodatkowe oddzielanie na bazie mikrofal w celu usunięcia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych ze świeżego roztworu do pobierania antygenu, jak pokazano. Pod koniec pobierania schłodzić szkiełka w wodzie destylowanej i osuszyć obszary na szkiełkach bez chusteczek chusteczkami laboratoryjnymi. Inkubować szkiełko z dappy przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy przemycia TBS-D.
Następnie ostrożnie osusz szkiełka chusteczkami laboratoryjnymi bez kontaktu z tkankami i zamontuj próbki za pomocą odpowiedniego podłoża montażowego do obrazowania. W przypadku skanowania szkiełkami monopleksowymi należy wybrać odpowiednie filtry z fluoroforów używanych do znakowania próbek i zbadać każdy marker oraz odpowiadający mu kanał fluorescencyjny, aby określić odpowiedni czas ekspozycji w celu uzyskania czystego sygnału, koncentrując się na składniku tkanki, który powinien mieć najsilniejszy sygnał dla markera. Aby umożliwić porównanie intensywności pikseli między próbkami, użyj ustawienia kamery na żywo, aby dostosować czas ekspozycji w każdym pojedynczym kanale, aż do momentu, gdy na obrazie z kamery na żywo nie będzie prześwietlonych obszarów.
Po zeskanowaniu wszystkich preparatów należy uzyskać symulowane obrazy w jasnym polu, aby wizualnie porównać je z normalnym wzorcem immunohistochemicznym i określić, czy wzór barwienia jest prawidłowy. Aby zeskanować szkiełka z mikromacierzy tkankowej, należy użyć trybu skanowania mikromacierzy tkankowej w systemie obrazowania i odpowiedniego algorytmu automatycznego ustawiania ostrości. W przypadku preparatów z całego przekroju tkanki należy zlecić przegląd szkiełek wykwalifikowanemu patologowi, aby wybrać optymalne obrazy z najbardziej reprezentatywnych obszarów guza.
Przed rozpoczęciem analizy należy wybrać marker nowotworowy, aby zidentyfikować komórki będące przedmiotem zainteresowania do analizy. Poproś patologa, aby przejrzał obrazy i zdecydował, czy wymagana jest segmentacja tkanek. W razie potrzeby wybierz odpowiednie regiony kontrolne do segmentacji i sprawdź, czy oprogramowanie do analizy obrazu może poprawnie zidentyfikować takie obszary.
Po segmentacji komórek poproś patologa, aby przejrzał mapę segmentacji, aby upewnić się o wierności zamierzonego podejścia do segmentacji i przejrzał poszczególne obrazy, aby określić, czy segmentacja komórek jest odpowiednia, czy też wymagana jest dodatkowa segmentacja tkanek w celu wybrania regionów wzbogaconych o komórki nowotworowe, zrąb i/lub martwicę. Następnie określ dodatnią wartość odcięcia intensywności optycznej dla każdego markera we współpracy z patologiem i wygeneruj histogramy w odpowiednim oprogramowaniu statystycznym, aby przeanalizować rozkład częstotliwości intensywności markera na komórkę. Aby wygenerować dane procentowe dla określonych markerów zainteresowania w zdefiniowanych komórkach, wstaw tabelę przestawną do arkusza danych i wybierz opcję Suma, aby obliczyć procent dodatniości pojedynczego znacznika zainteresowania.
Zostanie obliczona całkowita liczba komórek dodatnich markerów podzielona przez całkowitą liczbę. Wynikiem jest odsetek komórek z dodatnim markerem z jednym rdzeniem lub jednym numerem badania. Aby wygenerować dane liczbowe, należy uzyskać średnią intensywność każdego markera będącego przedmiotem zainteresowania we wszystkich badanych komórkach w próbce, aby wyodrębnić medianę znormalizowanej liczby dla każdego markera każdego rdzenia lub numeru badania.
Tutaj pokazano reprezentatywne multipleksowe fluorescencyjne obrazy immunohistochemiczne dla rozlanej próbki chłoniaka z dużych komórek B z rearanżacją genu c-MYC i BCL2. Symulowane obrazy immunohistochemiczne w jasnym polu wykazują podobny wzór barwienia markerów nowotworowych. Zastosowanie multipleksowych fluorescencyjnych obrazów immunohistochemicznych do panelu komórek T w angioimmunoblastycznych chłoniakach z komórek T ujawnia niejednorodność komórek w próbce guza.
W tym miejscu pokazano optymalizację próbki kontrolnej migdałków i wynikającą z niej analizę danych. Po etapie rozmieszania można użyć różnych programów do analizy obrazu w celu ilościowego określenia ekspresji i lokalizacji markerów w komórkach nowotworowych i mikrośrodowisku guza. Technika ta toruje naukowcom drogę do badania koekspresji wielu markerów w określonych typach komórek w pojedynczych odcinkach tkanki chłoniaka.
Uważaj, aby zapobiec obrażeniom spowodowanym wysoką temperaturą podczas podgrzewania w kuchence mikrofalowej i pamiętaj o ryzyku upadku podczas etapów skanowania, które są wykonywane na pokładzie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wieloparametrycznego fluorescencyjnego barwienia immunohistochemicznego oraz obrazowania w celu lokalizacji wielu antygenów związanych z nowotworami w chłoniaku. Metoda ta umożliwia analizę kolokalizacji biomarkerów w obrębie przekrojów tkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunohistochemia
- Biologia nowotworów
Wstęp
- Chłoniaki są histologicznie złożonymi nowotworami.
- Multipleksowa fluorescencyjna immunohistochemia oferuje istotne zalety w stosunku do metod konwencjonalnych.
- Technika ta wspomaga badania markerów nowotworowych oraz mikrośrodowiska.
- Standaryzacja oceny barwień opartych na przeciwciałach stanowiła historycznie duże wyzwanie.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do jednoczesnej lokalizacji antygenów związanych z nowotworami.
- Ułatwienie oceny koekspresji antygenów.
- Poprawa zrozumienia relacji przestrzennych w materiale klinicznym.
Zastosowane metody
- Zanurzenie odparafinowanych i rehydratowanych preparatów w buforze do odzyskiwania antygenów.
- HIE (Heat-induced epitope retrieval) – termiczne odzyskiwanie epitopów z wykorzystaniem kuchenki mikrofalowej.
- Dodatkowe usuwanie przeciwciał w kuchence mikrofalowej w zależności od ich rozmieszczenia.
- Ilościowy pomiar wielu barwień na jednym preparacie.
Główne wyniki
- Skuteczna lokalizacja wielu antygenów związanych z nowotworami.
- Zwiększona zdolność do oceny koekspresji antygenów.
- Ulepszona standaryzacja punktacji w próbkach histologicznych.
- Ułatwiona analiza mikrośrodowiska guza.
Wnioski
- Multipleksowa immunohistochemia fluorescencyjna jest cennym narzędziem w badaniach nad chłoniakami.
- Protokół ten można dostosować do różnych przekrojów tkanek.
- Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia biologii nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multipleksowa fluorescencyjna immunohistochemia umożliwia ilościową ocenę wielu białek docelowych w złożonych przekrojach tkanek chłoniaka, rozwiązując kluczowy problem w walidacji biomarkerów. Dzięki zachowaniu kontekstu przestrzennego i minimalizacji zużycia próbek, metoda ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania oraz zwiększa pewność prognostyczną przy priorytetyzacji celów. Możliwość ta wzmacnia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania, poprzez ewaluację przedkliniczną w procesach rozwoju leków onkologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez analizę koekspresji markerów podtypów chłoniaka w określonych typach komórek.
- Wartość operacyjna: Ogranicza zużycie próbek dzięki możliwości jednoczesnego odczytu wielu parametrów z pojedynczych przekrojów tkankowych, co zwiększa przepustowość w procesach walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wyjaśnienie przestrzennych relacji między antygenami w mikrośrodowisku guza, co dostarcza informacji niezbędnych do funkcjonalnej walidacji celów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje wyniki ilościowe, w tym średnią intensywność oraz procent pozytywności dla każdego markera, co umożliwia ustandaryzowaną ocenę próbek histologicznych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację analizy poprzez zoptymalizowane cykle usuwania przeciwciał i barwienia, co poprawia powtarzalność testów biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Kompatybilność ze skanowaniem mikrotablic tkankowych (TMA) oraz analizą całych przekrojów tkankowych, co wspiera skalowalne kampanie przesiewowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje wierność przestrzenną i ilościową od próbek odkrywczych po walidację przedkliniczną, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dane poprzez ilościowe określenie ekspresji markerów w zdefiniowanych przedziałach komórkowych modeli chłoniaka.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza niejednoznaczność w interpretacji szlaków poprzez rozstrzygnięcie wzorców koekspresji antygenów w złożonym zrębie guza.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkryć naukowych, wspierając testowanie hipotez we wczesnych etapach biologii, umożliwiając tworzenie gotowych do analiz paneli biomarkerów do przesiewu oraz zapewniając analitykę ilościową niezbędną do podejmowania decyzji translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację celów poprzez multipleksową detekcję markerów chłoniaka w przedziałach nowotworowych i mikrośrodowiskowych.
- Przesiew: Umożliwia powtarzalną, ilościową ocenę biomarkerów za pomocą standaryzowanych protokołów barwienia i obrazowania, odpowiednich do analizy wysokotreściowej (high-content analysis).
- Analityka: Dostarcza znormalizowane odczyty intensywności i procenta pozytywności, które ułatwiają analizę porównawczą między różnymi warunkami i próbkami.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkrywcze z ciągłością przedkliniczną poprzez zachowanie kontekstu przestrzennego i umożliwienie korelacji z efektami fenotypowymi.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody immunostainingu i obrazowania, którą można zastosować w różnych podtypach chłoniaka i panelach celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki multipleksowaniu przestrzennemu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację oceny IHC, zmniejszając zmienność międzyoperatorową w ocenie biomarkerów.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez maksymalizację uzysku danych z jednej próbki i umożliwienie równoległej oceny biomarkerów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów skorygowaną o ryzyko dzięki ilościowym, rozdzielonym przestrzennie danym o ekspresji w modelach chłoniaka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunohistochemii, obrazowania spektralnego oraz analizy obrazu w wielopleksowych procesach fluorescencyjnych.
- Zależne od infrastruktury do mikrofalowego odsłaniania antygenów i usuwania przeciwciał, z koniecznością optymalizacji dla każdej sekwencji przeciwciał.
- Wymaga standaryzacji między zespołami patomorfologii, obrazowania i analizy danych w celu zapewnienia spójnej segmentacji i ustawienia progów.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania protokołu przy rozszerzaniu go na nowe typy tkanek lub panele przeciwciał poza modele chłoniaków.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potencjalna degradacja sygnału podczas iteracyjnego usuwania przeciwciał oraz potrzeba precyzyjnej kontroli termicznej w celu zapobiegania uszkodzeniom tkanek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:57
Monoplex Tyramide-Based Immunofluorescence
3:22
Monoplex Slide and Tissue Microarray (TMA) Scanning
4:36
Data Analysis
6:28
Results: Representative Mutiplexed Fluorescent Immunohistochemical (mf-IHC) Staining, Imaging, and Analysis
7:10
Conclusion
