Badanie immunohistopatologiczne mające na celu profilowanie receptora kwasu foliowego beta makrofagów i naczyniowego mikrośrodowiska immunologicznego w olbrzymiokomórkowym zapaleniu tętnic

Ten protokół immunohistochemiczny i histopatologiczny można wykorzystać do zbadania receptora kwasu foliowego beta, który jest białkiem kandydującym o potencjalnej wartości prognostycznej i terapeutycznej dla mikrośrodowiska naczyniowego w olbrzymiokomórkowym zapaleniu tętnic. Protokół ten jest sprawdzony w czasie i szeroko stosowany i może być stosowany do badania atrybutów receptora kwasu foliowego beta w tkankach tętnicy skroniowej, nawet po długotrwałym przechowywaniu. Aby uzyskać skrawki tkanek, użyj mikrotomu, aby pokroić odcinki tętnic skroniowych zanurzonych w parafinie o grubości od czterech do pięciu mikrometrów, unosząc każdą sekcję w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza w miarę ich uzyskiwania, aby usunąć zmarszczki.

Użyj szklanych szkiełek mikroskopowych, aby uchwycić trzy sekcje na szkiełku i podgrzej szkiełka na płycie grzewczej w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 60 minut. Gdy sekcje przykleją się do szkiełek, umieść je w pionowym stojaku do suszenia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia przenieś szkiełka do pojemnika na szkiełka w celu przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 12 godzin.

Następnie załaduj szkiełka do stojaka na szkiełka i nawodnij tkanki za pomocą dwóch pięciominutowych zanurzeń w 100% ksylenu i opadającej, pięciominutowej serii zanurzeń etanolu na każde stężenie, z 10 sekundami mieszania co 30 sekund. Po zanurzeniu w 70% etanolu opłucz szkiełka dwa razy w podwójnie destylowanej wodzie przez pięć minut, z 10-sekundowym mieszaniem co 30 sekund. W celu pobrania antygenu przenieś stojak do szklanego pojemnika z 200 mikrolitrami 95 stopni Celsjusza, 10 milimolami na litr buforu cytrynianu na 30 minut.

Pod koniec inkubacji pozostaw szkiełka do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 20 minut, a następnie spłukuj bieżącą wodą przez pięć minut. Aby usunąć endogenną aktywność peroksydazy, najpierw użyj markera hydrofobowego, aby narysować okrąg wokół każdej próbki tkanki, a następnie inkubuj próbki w 200 mikrolitrach 3% nadtlenku wodoru przez 10 minut, a następnie 3 przepłucz w 200 mililitrach tris-buforowanego roztworu soli fizjologicznej lub TBSS na pranie. Po ostatnim przemyciu delikatnie przetrzyj każde szkiełko, aby usunąć nadmiar buforu i dodaj 200 mikrolitrów podstawowego koktajlu przeciwciał i szkiełka nakrywkowego do każdego szkiełka na jedną godzinę inkubacji w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji wyrzucić szkiełka nakrywkowe i spłukać szkiełka trzema dwuminutowymi płukaniami w świeżej łyżce jaj. Po usunięciu nadmiaru buforu dodać 200 mikrolitrów odpowiedniego biotynylowanego roztworu przeciwciał drugorzędowych i szkiełko nakrywkowe do każdego szkiełka na 45-minutową inkubację w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Po wyrzuceniu szkiełek nakrywkowych przepłukać szkiełka podstawowe materiałem TBSS, jak pokazano.

Usuń nadmiar bufora. I oznacz sekcje 200 mikrolitrami buforu substratu DAB przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć szkiełka TBSS i bieżącą wodą z kranu przez 10 minut, a następnie przeciwbarwić hematoksyliną przez trzy minuty.

Następnie dodaj 70 mikrolitrów odpowiedniego podłoża montażowego do każdego szkiełka i powoli przechylaj szklany pasek maskujący na podłoże montażowe, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków podczas opuszczania szkiełka nakrywkowego na miejsce. W celu analizy histopatologicznej umieść szkiełko na stoliku mikroskopu świetlnego i oceń architekturę naczyniową pierwszego wycinka tkanki. Następnie określ ilościowo liczbę makrofagów w stosunku do liczby limfocytów na sekcję.

W celu analizy immunohistochemicznej zbadaj wzór barwienia receptora kwasu foliowego beta na każdym odcinku tkanki i określ ilościowo liczbę komórek beta dodatnich receptora kwasu foliowego, CD68 dodatnich i CD3 w 10 losowo wybranych polach o dużej mocy na sekcję. Barwienie hematoksyliną i eozyną w normalnych próbkach ujawnia normalną anatomię tętnic, z komórkami śródbłonka w osłonce wewnętrznej, komórkami mięśni gładkich w osłonce środkowej i niejednorodną macierzą kolagenową, która obejmuje fibroblasty i naczynia zasilające zwane vasa vasorum w osłonce lekarskiej. Tętnice skroniowe z dodatnim zapaleniem tętnic olbrzymiokomórkowych wykazują umiarkowany lub ciężki stan zapalny, z agregatami i makrofagami lub histiocytami, limfocytami, okazjonalnymi komórkami plazmatycznymi i wielojądrowymi komórkami olbrzymimi.

Obserwuje się również zwężenie światła, któremu towarzyszy pogrubienie błony wewnętrznej i 90% przerwanie wewnętrznej blaszki elastycznej. Limfocyty CD3-dodatnie i makrofagi CD68-dodatnie są również obecne we wszystkich próbkach z dodatnim zapaleniem tętnic olbrzymiokomórkowych, z podobnymi wzorcami barwienia obserwowanymi we wszystkich biopsjach. Barwienie receptora kwasu foliowego beta jest ograniczone do makrofagów i wielojądrowych komórek olbrzymich, które preferencyjnie lokalizują się w przydankach i pożywkach.

Warto zauważyć, że receptor kwasu foliowego beta stanowił około 30% wszystkich makrofagów. Przetwarzanie, cięcie i odparafinowywanie biopsji tętnicy skroniowej wymaga starannej zręczności w celu wykonania kolejnych kroków. Interpretacja slajdów wymaga specjalistycznej wiedzy doświadczonego patologa układu krążenia.

Przypomnij widzom, aby podczas pracy z próbkami i odczynnikami stosowali środki ostrożności dotyczące kontaktu i dróg oddechowych, takie jak rękawice i wentylowane kaptury.