Name: Badanie immunohistopatologiczne mające na celu profilowanie receptora kwasu foliowego beta makrofagów i naczyniowego mikrośrodowiska immunologicznego w olbrzymiokomórkowym zapaleniu tętnic (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemiczną do profilowania receptora kwasu foliowego beta makrofagów w bioptatach tętnic skroniowych u pacjentów z olbrzymiokomórkowym zapaleniem tętnic.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była możliwa dzięki wsparciu dr Douglasa Stairsa, Marianne Klinger, Ann Benko, Wydziału Reumatologii/Wydziału Medycyny oraz Molekularnego i Histopatologicznego Laboratorium Podstawowego, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.

Wszystkie opisane metody zostały zatwierdzone przez Penn State Institutional Review Board.
1. Przygotowanie histopatologiczne i przetwarzanie po uzyskaniu biopsji tętnicy skroniowej
UWAGA: Biopsja tętnicy skroniowej (TAB) jest wykonywana w znieczuleniu miejscowym i sterylnych warunkach przez certyfikowanego chirurga. Po chirurgicznym uzyskaniu 3-centymetrowego odcinka tętniczego po bardziej dotkniętej stronie, próbkę natychmiast utrwala się w formalinie na 24 godziny, dzieli na odcinki od 3 do 4 mm i zatapia w parafinie, zwracając szczególną uwagę na prawidłowe ułożenie tkanki w bloku, który jest następnie przechowywany w temperaturze pokojowej. Selekcja próbek odbywa się po weryfikacji dokumentacji medycznej. Diagnoza opiera się na kryteriach American College of Rheumatology z 1990 roku, które wymagają, aby badani spełniali 3 z 5 domen: wiek >50 lat, nowy ból głowy, tkliwość tętnicy skroniowej, szybkość sedymentacji erytrocytów >50 mm/godzinę metodą Westergrena i nieprawidłowa TAB. Ze względów bezpieczeństwa podczas pracy z próbkami należy nosić rękawice ochronne, substancje chemiczne i przeciwciała.
<ol>
	<li>Z osadzonych bloków wyciąć odcinki o grubości 4-5 μm za pomocą mikrotomu i wybarwić hematoksyliną i eozyną (H&E). Użyj przekroju kontrolnego wybranej normalnej tkanki w celu zapewnienia jakości.</li>
	<li>Na ciepłej kąpieli wodnej podgrzanej do temperatury 40 °C należy wyciąć odcinki pływakiem w celu usunięcia zmarszczek i zebrać za pomocą mikroskopijnego szkiełka z powlekanym szkiełkiem. Umieścić szkiełka podstawowe na ciepłym talerzu w piekarniku o temperaturze 60 °C na 60 minut, aby ułatwić suszenie i przyleganie części do szkiełka.</li>
	<li>Umieść szkiełka podstawowe na ciepłym talerzu w piekarniku o temperaturze 60 °C na 60 minut, aby ułatwić suszenie i przyleganie części do szkiełka.</li>
	<li>Zamontuj 3 sekcje na szkiełkach mikroskopowych.</li>
	<li>Umieść szkiełka w pionowym ruszcie i susz przez noc w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Umieścić szkiełka w pojemniku i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie immunohistochemiczne, odparafinowanie, pobieranie antygenu i barwienie15,18,19,20
<ol>
	<li>Załaduj prowadnice do stojaka na prowadnice. Przełóż ruszt przez naczynia w następujący sposób: dwa razy w 100% ksylenie przez 5 minut z 10 sekundami delikatnego mieszania co 30 sekund, raz w 100% etanolu po 10 sekundowym mieszaniu, raz w 90% etanolu po 10 sekundowym mieszaniu, raz w 70% etanolu po 10 sekundowym mieszaniu i dwa razy w podwójnie destylowanym H2O po 10 sekundowym mieszaniu. 
	Uwaga: Obchodzenie się z ksylenem i acetonem powinno odbywać się w wentylowanych okapach, aby uniknąć wdychania i toksyczności dla dróg oddechowych.</li>
	<li>Pobrać antygen, przenosząc stojak do szklanego pojemnika z 200 ml buforu cytrynianowego o pH 10 mmol/l i pH 6,0 podgrzanym do 95 °C. Ustaw minutnik na 30 minut w łaźni wodnej, następnie schładzaj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie płucz bieżącą wodą przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń endogenną aktywność peroksydazy, inkubując w 200 ml 3% nadtlenku wodoru przez 10 minut. Przemyć szkiełka 3 razy w 200 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanego Tris (TBSS).</li>
	<li>Wyjmij szkiełka ze stojaka i delikatnie przetrzyj każdą z nich, aby wytrzeć nadmiar bufora. Do barwienia dodać 200 μl następujących przeciwciał pierwszorzędowych, dodać szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej: 
	Przeciwciało anty-FRB rozcieńczone 1:800 
	Monoklonalny mysi anty-ludzki CD68, rozcieńczenie 1:200 
	Poliklonalny królik anty-CD3 rozcieńczenie 1:100 
	Uwaga: Utrwalone w formalinie odcinki łożyska zatopione w parafinie również przetworzono zgodnie z opisem w krokach 2.1 do 2.9 i inkubowano z anty-FRB18 i zastosowano jako kontrolę pozytywną. Wyniki barwienia uzyskano poprzez znalezienie optymalnego stężenia przeciwciał i przeprowadzono je poprzez miareczkowanie przeciwciała w podwójnych rozcieńczeniach (np. 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).</li>
	<li>Po inkubacji usunąć szkiełko nakrywkowe i wyrzucić. Opłucz szkiełka 3 razy po 2 minuty za pomocą TBSS, odcedź i wytrzyj nadmiar buforu.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego zawierającego biotynylowane przeciwciało drugorzędowe anty-królika/myszy, aby zareagować z niesprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym związanym z antygenem tkankowym. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i inkubuj w wilgotnej komorze przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji usunąć szkiełko nakrywkowe i wyrzucić. Opłucz szkiełka 3 razy po 2 minuty za pomocą TBS, odcedź i wytrzyj nadmiar bufora.</li>
	<li>Dodać 200 μl systemu chromogenowego diaminobenzydyny (DAB) + buforu substratowego (Imidazol HCl) i inkubować przez 10 minut, aby uwidocznić wzór barwienia. Myć TBSS, a następnie pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.</li>
	<li>Przeciwbarwić hematoksyliną przez 3 minuty.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka, nakładając 70 μL medium montażowego na powierzchnię szkiełka. Powoli przechylaj szkiełko nakrywkowe na podłoże montażowe i unikaj tworzenia pęcherzyków podczas opuszczania go na miejsce. Odczekaj 24 godziny do wyschnięcia. </li>
</ol>
3. Analiza histopatologiczna i immunohistochemiczna (IHC)
Zbadaj wycinki zabarwione H&E i IHC od osób z pozytywnym wynikiem GCA i osób normalnych za pomocą mikroskopu świetlnego.
<ol>
	<li>Dla sekcji barwionych H&E:
	<ol>
		<li>Oceń architekturę naczyniową i zidentyfikuj komórki śródbłonka w osłonce wewnętrznej, komórki mięśni gładkich w osłonce środkowej oraz fibroblasty i naczynia krwionośne w osłonce przydankowej21,22.</li>
		<li>Zidentyfikuj cechy GCA, które obejmują infiltrację limfocytów i makrofagów/histiocytów, przerost komórkowy i degradację wewnętrznej blaszki elastycznej.</li>
		<li>Przeanalizuj naciek limfohistiocytarny, identyfikując i określając ilościowo liczbę makrofagów w stosunku do limfocytów. Oceń zakres rozerwania wewnętrznej blaszki elastycznej i zmian hiperplastycznych w komórkach rezydentnych i porównaj z kontrolnymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla sekcji barwionych IHC:
	<ol>
		<li>Zbadaj wzór barwienia FRB, zwracając uwagę na jego ekspresję przez określony typ lub typy komórek oraz jego rozmieszczenie w warstwach naczyniowych i jego związek z całkowitym naciekiem immunologicznym, całkowitym markerem makrofagów, anty-CD68 i markerem limfocytów panowych anty CD3.</li>
		<li>Określ ilościowo ekspresję komórek FRB, CD68 i CD3, licząc dodatnio wybarwione komórki na 10 wielu losowo wybranych polach dużej mocy (hpf) i zapisz średnie. 
		nuta: Identyfikacja tych normalnych i patologicznych komórek i struktur została przeprowadzona przez certyfikowanego patologa sercowo-naczyniowego (J.M.) i reumatologa (S.A.A.), a wyniki zostały zarejestrowane dla wszystkich przypadków.</li>
		<li>Przechwytywanie reprezentatywnych obrazów za pomocą aparatu cyfrowego. 
		nuta: Po wykonaniu tych czynności pozostałe podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlippel%2C+JH+%22Primer+on+the+rheumatic+diseases%22">Primer on the rheumatic diseases</a>. , Springer Science & Business Media. (2008).</li>
<li>Weyand, C. M., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+mechanisms+in+medium+and+large-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis.</a> Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).</li>
<li>Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunopathology+of+giant+cell+arteritis%3A+diagnostic+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications.</a> Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).</li>
<li>Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+and+Th1+T-cell+responses+in+giant+cell+arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis.</a> Circulation. 121, 906-915 (2010).</li>
<li>Mahr, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+methotrexate+for+treatment+of+giant+cell+arteritis%3A+an+individual+patient+data+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis.</a> Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).</li>
<li>Hoffman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial+of+adjuvant+methotrexate+treatment+for+giant+cell+arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis.</a> Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).</li>
<li>Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+of+Tocilizumab+in+Giant-Cell+Arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).</li>
<li>Milman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocilizumab+increased+sustained+glucocorticoid-free+remission+from+giant+cell+arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis.</a> Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63(2017).</li>
<li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+folate+receptor+is+induced+during+macrophage+activation+and+can+be+used+to+target+drugs+to+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages.</a> Blood. 113 (2), 438-446 (2009).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor-beta+constitutes+a+marker+for+human+proinflammatory+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).</li>
<li>Salazar, M. D., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+folate+receptor%3A+what+does+it+promise+in+tissue-targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).</li>
<li>Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+folic-acid-based+receptor+targeting+for+imaging+and+therapy+of+cancer+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).</li>
<li>Puig-Kroger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+beta+is+expressed+by+tumor-associated+macrophages+and+constitutes+a+marker+for+M2+anti-inflammatory%2Fregulatory+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.</a> Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).</li>
<li>Nakashima-Matsushita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+folate+receptor+beta+and+its+possible+role+in+methotrexate+transport+in+synovial+macrophages+from+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).</li>
<li>vander Heijden, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+beta+as+a+potential+delivery+route+for+novel+folate+antagonists+to+macrophages+in+the+synovial+tissue+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients.</a> Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).</li>
<li>Jansen, G., Peters, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+folate+receptors+and+transporters%3A+implications+for+disease+and+treatment+of+immune+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pteridines%22%5BJournal%5D)">Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer.</a> Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).</li>
<li>Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+analysis+of+folate+receptor+beta+expression+and+distribution+in+giant+cell+arteritis+-+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study.</a> American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).</li>
<li>Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+folate+receptor+isoforms+in+normal+and+malignant+tissues+in+vivo+and+in+established+cell+lines.+Physiologic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications.</a> Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).</li>
<li>Reiner, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+molecular+biology.+Macrophages+and+dendritic+cells.+Methods+and+protocols.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface.</a> Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13(2008).</li>
<li>Pawlina, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawlina%2C+W+%22Histology%3A+A+text+and+atlas+with+correlated+cell+and+molecular+biology%22">Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology</a>. , Walters Kluwer. (2016).</li>
<li>Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Robbins+and+Cotran+pathologic+basis+of+disease%22">Robbins and Cotran pathologic basis of disease</a>. , Elsevier Saunders. (2015).</li>
<li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDabbs%2C+DJ+%22Diagnostic+immunohistochemistry%22">Diagnostic immunohistochemistry</a>. , Elsevier, Inc. (2019).</li>
<li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+type+beta+is+a+neutrophilic+lineage+marker+and+is+differentially+expressed+in+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia.</a> Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).</li>
<li>Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolzapfel%2C+GA+%22Collagen.+Structure+and+Mechanics%22">Collagen. Structure and Mechanics</a>. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).</li>
<li>Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathologic+Markers+Determining+Prognosis+in+Patients+with+Treated+or+Healing+Giant+Cell+Arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis.</a> American Journal of Ophthalmology. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

GCA jest najczęstszym zapaleniem naczyń u dorosłych, a jego patologiczny znak rozpoznawczy jest przykładem silnej kombinacji limfocytów T pomocniczych i aktywowanych makrofagów, które można również znaleźć w innych chorobach ziarniniakowych lub waskulopatiach, takich jak sarkoidoza i ziarniniakowe zapalenie naczyń 2,3. W GCA tętnica skroniowa zapewnia dobrą reprezentację tętnicy średniej lub dużej wielkości, a biopsja TA daje sporą próbkę, która może być przechow...

Olbrzymiokomórkowe zapalenie tętnic (GCA) jest chorobą zapalną średnich i dużych tętnic, skierowaną do aorty i jej odgałęzień i dotykającą osoby starsze. Objawia się łagodnymi lub ciężkimi powikłaniami niedokrwiennymi, takimi jak bóle głowy, bóle szczęki, utrata wzroku, udar i zgorzel tkanek. Diagnoza jest potwierdzona przez wysokie markery stanu zapalnego, takie jak wskaźnik sedymentacji erytrocytów (ESR) i wyraźny wzór histopatologiczny w biopsji tętnicy skroniowej (TAB)1. GCA jest najczęstszym zapaleniem naczyń u dorosłych, a dostępność tętnicy skroniowej uzyskanej do diagnozy stanowi przewagę nad innymi waskulopatiami, umożliwiając w ten sposób łatwiejsze badanie jej patogenezy. Typowe wyniki TAB obejmują naciek makrofagów/histiocytów i limfocytów T znajdujących się we wszystkich warstwach naczyniowych błony wewnętrznej, pożywki i przydanki z jednoczesnym zniszczeniem elastycznej blaszki, która normalnie oddziela te przedziały2. Obecne dowody wskazują, że GCA obejmuje nieznany antygen, który aktywuje komórki dendrytyczne w przydankach naczyniowych, a następnie rekrutację pomocniczych limfocytów T (Th), w szczególności podtypów Th1 i Th17, które wydzielają odpowiednio interleukinę-17 i interferon-gamma (IFG). Następnie IFG rekrutuje i aktywuje makrofagi do produkcji cytokin i proteaz. Należą do nich cytokiny prozapalne; w tym IL-12, która wzajemnie aktywuje komórki Th1, zapewniając w ten sposób pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego; czynnik martwicy nowotworu i interleukina-6, które powodują zapalenie stawów i gorączkę oraz metaloproteazy, które uszkadzają elastyczną blaszkę. Glikokortykosteroidy (GC), które stanowią standardową terapię przewlekłą, częściowo kontrolują szlaki cytokin poprzez osłabienie Th17 / IL-17, ale nie ramienia Th1 / IFG odpowiedzi immunologicznej3,4. Niestety, przerwanie leczenia GKK powoduje nawrót choroby. Jako alternatywna metoda, metotreksat został ponownie wykorzystany w leczeniu GCA, ale pożądane kliniczne punkty końcowe nie były konsekwentnie osiągane, chociaż bardziej czułe biomarkery nie zostały wykorzystane do monitorowania terapeutycznego5,6. W 2017 r. bloker interleukiny 6, tocilizumab, został zatwierdzony do leczenia GCA, ponieważ skutecznie wykazał działanie kontrolujące chorobę i oszczędzające steroidy7,8.
Do tej pory nie ma dobrych biomarkerów dla GCA. W związku z tym trudno jest monitorować aktywność choroby i zwiększać dawki dostępnych leków, aby uniknąć działań niepożądanych i zmniejszyć obciążenie kosztami ponoszonymi przez społeczeństwo. Dlatego konieczne jest poszukiwanie potencjalnego biomarkera, który koreluje z aktywnością choroby, dostarcza nowych informacji na temat patogenezy i pomaga w podejmowaniu decyzji terapeutycznych.
Dysregulacja aktywacji makrofagów jest krytycznym czynnikiem w patogenezie GCA. Tak więc skutecznym sposobem leczenia GCA może być selektywne celowanie w aktywowane makrofagi. Receptor kwasu foliowego beta (FRB) jest glikoproteiną glikozylofosfatydyloinozytolu, która jest zakotwiczona w błonie komórkowej ulegającej ekspresji w normalnych komórkach mielomonocytarnych, komórkach białaczki szpikowej i aktywowanych makrofagach. Jego ligand, kwas foliowy, jest niezbędną witaminą w zredukowanej formie, która umożliwia syntezę DNA, metylację i naprawę DNA komórkowego9. Ekspresja FRB jest indukowana w chorobach autoimmunologicznych i podczas kancerogenezy. Jego ekspresja jest ograniczona do powierzchni monocytów lub prozapalnych makrofagów M1 w reumatoidalnym zapaleniu stawów lub do przeciwzapalnych makrofagów M2 w nowotworach złośliwych narządów litych i szpiku10,11,12,13. Oprócz potencjalnej roli jako biomarker aktywowanych makrofagów, FRB może umożliwić selektywny transport leków przez wieloetapowy proces, który rozpoczyna się od wiązania receptora z kwasem foliowym, antyfolianami lub lekami sprzężonymi z folianami na powierzchni komórki, po czym następuje internalizacja, uwalnianie i ostateczne dostarczenie pożądanego leku do wewnętrznej maszynerii komórkowej12, 14,15,16. W przeciwieństwie do FRB ulegającego ekspresji w komórkach nowotworowych i aktywowanych makrofagach, FRB ulegający ekspresji w normalnych komórkach krwiotwórczych nie jest w stanie wiązać folianów, zapewniając w ten sposób, że dostarczanie leków za pośrednictwem FRB / kwasu foliowego jest ograniczone do komórek zapalnych lub nowotworowych FRB-dodatnich.
W naszym poprzednim badaniu wykazaliśmy po raz pierwszy, że FRB ulega ekspresji w makrofagach GCA, a jego ekspresja jest skorelowana z makrofagami beta receptora CD68+ i endoteliny, które przyczyniają się do patogenezy GCA17. W niniejszym raporcie opisujemy metody histopatologiczne i immunohistochemiczne stosowane do oceny makrofagów FRB oraz analizujemy całkowitą liczbę limfocytów i makrofagów, aby uzyskać wgląd w pozycję FRB w krajobrazie naczyniowym GCA.

<table><tbody>Szkiełka mikroskopowe gładkie i matowe <tr><td>Microtome</td><td>Reichert-Jung</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regał pionowy</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Olympus BX60&nbsp; mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton w stężeniach wody</td><td></td><td></td> destylowanej <td>100%, 90%, 70%</td></tr><tr><td>Roztwor soli fizjologicznej buforowany trisem (TBS)&nbsp;</td><td>Dako Wash BufferS3006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% nadtlenek wodoru w TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzydyna (DAB)</td><td>Sigma Fast Tablet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zestaw Chemical Permount&nbsp; Średni montaż</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SP-15-100</td><td></td></tr><tr><td>Harleco Gill's III Hematoxylin</td><td>Fiisher Scientific 23-750-019</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harleco Eozyna Y 1% alkoholowy roztwór podstawowy</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>23-749-977</td><td></td></tr><tr><td>10 mM monohydrat kwasu cytrynowego (pH 6,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalny receptor antyfolianowy królika beta&nbsp;</td><td>Manohar Ratnam</td><td></td><td>zoptymalizowany w 1:800</td></tr><tr><td>Monoklonalna mysz anty-ludzka CD68</td><td>Dako&nbsp;</td><td>M071801</td><td>zoptymalizowany w skali 1:200</td></tr><tr><td>Poliklonalny królik anty-CD3</td><td>Agilent Dako</td><td>A0452</td><td>zoptymalizowany w 1:100</td></tr><tr><td>Polimerowe kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi/myszy</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tkanka</td><td></td><td></td> łożyskowa<td>&nbsp; do kontroli pozytywnej FRB</td></tr></tbody></table>

badanie immunohistopatologiczne mające na celu profilowanie receptora kwasu foliowego beta makrofagów i naczyniowego mikrośrodowiska immunologicznego w olbrzymiokomórkowym zapaleniu tętnic

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Olbrzymiokomórkowe zapalenie tętnic (GCA) jest przewlekłą chorobą o podłożu immunologicznym średnich i dużych tętnic, która dotyka osoby starsze. GCA objawia się zapaleniem stawów i objawami okluzyjnymi, takimi jak bóle głowy, udar mózgu lub utrata wzroku. Makrofagi i limfocyty T-pomocnicze naciekają ścianę naczyń krwionośnych i wytwarzają odpowiedź prozapalną, która prowadzi do uszkodzenia naczyń i niedokrwienia. Do tej pory nie ma biomarkera GCA, który mógłby monitorować aktywność choroby i kierować odpowiedzią terapeutyczną.
Receptor kwasu foliowego beta (FRB) to białko glikozylofosfatydyloinozytolu, które jest zakotwiczone na błonach komórkowych i normalnie wyrażane w linii mielomonocytowej oraz w większości komórek białaczki szpikowej, jak również w makrofagach maziowych nowotworowych i reumatoidalnych, gdzie jego ekspresja koreluje z ciężkością choroby. Zdolność FRB do wiązania związków folianowych, koniugatów kwasu foliowego i leków przeciwfoliowych sprawiła, że stał się on celem badań nad rakiem i chorobami zapalnymi. W niniejszym artykule opisano metody histopatologiczne i immunohistochemiczne stosowane do oceny ekspresji i dystrybucji FRB w odniesieniu do GCAimmunopatologii.
Biopsje tętnicy skroniowej z GCA i normalnych kontrolnych utrwalone formaliną i parafiną zostały wybarwione Hematoksyliną i Eozyną w celu przeglądu histologii tkanek i zidentyfikowania cech patognomonicznych. Do wykrycia ekspresji FRB, CD68 i CD3 wykorzystano immunohistochemię. Przeprowadzono analizę mikroskopową w celu ilościowego określenia liczby dodatnio wybarwionych komórek na 10 wybranych odcinkach pola dużej mocy i ich odpowiednich lokalizacji w ścianie tętnicy.
Zapalenie limfohistiocytarne (LH) z towarzyszącym przerostem błony wewnętrznej i zaburzoną elastyczną blaszką zaobserwowano w GCA, a w grupie kontrolnej nie stwierdzono żadnego. Naciek LH składał się w około 60% z limfocytów i w 40% z makrofagów. Ekspresja FRB była ograniczona do makrofagów, stanowiących 31% całkowitej populacji makrofagów CD68 + i zlokalizowanych w pożywkach i przydankach. W grupie kontrolnej nie zaobserwowano FRB.
Ten protokół wykazał wyraźny numeryczny i przestrzenny wzór makrofaga FRB w stosunku do naczyniowego mikrośrodowiska immunologicznego w GCA.

Wyniki histopatologiczne
Barwienia H&amp;E w prawidłowych próbkach wykazały normalną anatomię tętnic z komórkami śródbłonka w błonie wewnętrznej (tunica intima), komórkami mięśni gładkich w błonie środkowej (tunica media) oraz heterogenną macierzą kolagenową zawierającą fibroblasty i naczynia odżywcze, zwane vasa vasorum, w błonie zewnętrznej (tunica adventitia). Nie zidentyfikowano nacieku zapalnego. Tętnice sk...

Protokół ilustruje wykorzystanie badania histopatologicznego i immunohistochemii do profilowania makrofagów receptora kwasu foliowego beta i jego związku z całkowitym naciekiem komórek odpornościowych w biopsjach tętnic skroniowych w gigantycznokomórkowym zapaleniu tętnic.

Badanie immunohistopatologiczne mające na celu profilowanie receptora kwasu foliowego beta makrofagów i naczyniowego mikrośrodowiska immunologicznego w olbrzymiokomórkowym zapaleniu tętnic

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Ten protokół immunohistochemiczny i histopatologiczny można wykorzystać do zbadania receptora kwasu foliowego beta, który jest białkiem kandydującym o potencjalnej wartości prognostycznej i terapeutycznej dla mikrośrodowiska naczyniowego w olbrzymiokomórkowym zapaleniu tętnic. Protokół ten jest sprawdzony w czasie i szeroko stosowany i może być stosowany do badania atrybutów receptora kwasu foliowego beta w tkankach tętnicy skroniowej, nawet po długotrwałym przechowywaniu. Aby uzyskać skrawki tkanek, użyj mikrotomu, aby pokroić odcinki tętnic skroniowych zanurzonych w parafinie o grubości od czterech do pięciu mikrometrów, unosząc każdą sekcję w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza w miarę ich uzyskiwania, aby usunąć zmarszczki.Użyj szklanych szkiełek mikroskopowych, aby uchwycić trzy sekcje na szkiełku i podgrzej szkiełka na płycie grzewczej w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 60 minut. Gdy sekcje przykleją się do szkiełek, umieść je w pionowym stojaku do suszenia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia przenieś szkiełka do pojemnika na szkiełka w celu przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 12 godzin.Następnie załaduj szkiełka do stojaka na szkiełka i nawodnij tkanki za pomocą dwóch pięciominutowych zanurzeń w 100% ksylenu i opadającej, pięciominutowej serii zanurzeń etanolu na każde stężenie, z 10 sekundami mieszania co 30 sekund. Po zanurzeniu w 70% etanolu opłucz szkiełka dwa razy w podwójnie destylowanej wodzie przez pięć minut, z 10-sekundowym mieszaniem co 30 sekund. W celu pobrania antygenu przenieś stojak do szklanego pojemnika z 200 mikrolitrami 95 stopni Celsjusza, 10 milimolami na litr buforu cytrynianu na 30 minut.Pod koniec inkubacji pozostaw szkiełka do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 20 minut, a następnie spłukuj bieżącą wodą przez pięć minut. Aby usunąć endogenną aktywność peroksydazy, najpierw użyj markera hydrofobowego, aby narysować okrąg wokół każdej próbki tkanki, a następnie inkubuj próbki w 200 mikrolitrach 3% nadtlenku wodoru przez 10 minut, a następnie 3 przepłucz w 200 mililitrach tris-buforowanego roztworu soli fizjologicznej lub TBSS na pranie. Po ostatnim przemyciu delikatnie przetrzyj każde szkiełko, aby usunąć nadmiar buforu i dodaj 200 mikrolitrów podstawowego koktajlu przeciwciał i szkiełka nakrywkowego do każdego szkiełka na jedną godzinę inkubacji w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji wyrzucić szkiełka nakrywkowe i spłukać szkiełka trzema dwuminutowymi płukaniami w świeżej łyżce jaj. Po usunięciu nadmiaru buforu dodać 200 mikrolitrów odpowiedniego biotynylowanego roztworu przeciwciał drugorzędowych i szkiełko nakrywkowe do każdego szkiełka na 45-minutową inkubację w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Po wyrzuceniu szkiełek nakrywkowych przepłukać szkiełka podstawowe materiałem TBSS, jak pokazano.Usuń nadmiar bufora. I oznacz sekcje 200 mikrolitrami buforu substratu DAB przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć szkiełka TBSS i bieżącą wodą z kranu przez 10 minut, a następnie przeciwbarwić hematoksyliną przez trzy minuty.Następnie dodaj 70 mikrolitrów odpowiedniego podłoża montażowego do każdego szkiełka i powoli przechylaj szklany pasek maskujący na podłoże montażowe, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków podczas opuszczania szkiełka nakrywkowego na miejsce. W celu analizy histopatologicznej umieść szkiełko na stoliku mikroskopu świetlnego i oceń architekturę naczyniową pierwszego wycinka tkanki. Następnie określ ilościowo liczbę makrofagów w stosunku do liczby limfocytów na sekcję.W celu analizy immunohistochemicznej zbadaj wzór barwienia receptora kwasu foliowego beta na każdym odcinku tkanki i określ ilościowo liczbę komórek beta dodatnich receptora kwasu foliowego, CD68 dodatnich i CD3 w 10 losowo wybranych polach o dużej mocy na sekcję. Barwienie hematoksyliną i eozyną w normalnych próbkach ujawnia normalną anatomię tętnic, z komórkami śródbłonka w osłonce wewnętrznej, komórkami mięśni gładkich w osłonce środkowej i niejednorodną macierzą kolagenową, która obejmuje fibroblasty i naczynia zasilające zwane vasa vasorum w osłonce lekarskiej. Tętnice skroniowe z dodatnim zapaleniem tętnic olbrzymiokomórkowych wykazują umiarkowany lub ciężki stan zapalny, z agregatami i makrofagami lub histiocytami, limfocytami, okazjonalnymi komórkami plazmatycznymi i wielojądrowymi komórkami olbrzymimi.Obserwuje się również zwężenie światła, któremu towarzyszy pogrubienie błony wewnętrznej i 90% przerwanie wewnętrznej blaszki elastycznej. Limfocyty CD3-dodatnie i makrofagi CD68-dodatnie są również obecne we wszystkich próbkach z dodatnim zapaleniem tętnic olbrzymiokomórkowych, z podobnymi wzorcami barwienia obserwowanymi we wszystkich biopsjach. Barwienie receptora kwasu foliowego beta jest ograniczone do makrofagów i wielojądrowych komórek olbrzymich, które preferencyjnie lokalizują się w przydankach i pożywkach.Warto zauważyć, że receptor kwasu foliowego beta stanowił około 30% wszystkich makrofagów. Przetwarzanie, cięcie i odparafinowywanie biopsji tętnicy skroniowej wymaga starannej zręczności w celu wykonania kolejnych kroków. Interpretacja slajdów wymaga specjalistycznej wiedzy doświadczonego patologa układu krążenia.Przypomnij widzom, aby podczas pracy z próbkami i odczynnikami stosowali środki ostrożności dotyczące kontaktu i dróg oddechowych, takie jak rękawice i wentylowane kaptury.

an-immunohistopathologic-study-to-profile-folate-receptor-beta

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę ilościowego określania względnego stosunku makrofagów wśród wszystkich populacji infiltrowanych komórek odpornościowych w biopsji tętnicy skroniowej. Barwienie immunohistochemiczne części tkanki dotkniętej chorobą autoimmunologiczną selektywnie barwi komórki odpornościowe specyficznymi receptorami, aby wizualnie odróżnić je od reszty komórek.

Immunohistochemia w celu zbadania związku między makrofagami a infiltrującymi komórkami odpornościowymi

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Ten artykuł przedstawia użyteczny test in vitro do oceny zdolności kondycjonowanej pożywki z komórek nowotworowych do przyciągania makrofagów.

Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

Niniejsze badanie dostarcza zmodyfikowany protokół izolacji makrofagów i fibroblastów maziowych z mysiej tkanki zapalnego zapalenia stawów.

Izolacja i hodowla pierwotnych makrofagów maziowych i fibroblastów z mysiej tkanki zapalenia stawów

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Poznaj metodę immunohistochemiczną do profilowania receptora kwasu foliowego beta makrofagów w bioptatach tętnic skroniowych u pacjentów z olbrzymiokomórkowym zapaleniem tętnic.

Badanie immunohistopatologiczne mające na celu profilowanie receptora kwasu foliowego beta makrofagów i naczyniowego mikrośrodowiska immunologicznego w olbrzymiokomórkowym zapaleniu tętnic (Wideo) | JoVE Journal

Badanie immunohistopatologiczne mające na celu profilowanie receptora kwasu foliowego beta makrofagów i naczyniowego mikrośrodowiska immunologicznego w olbrzymiokomórkowym zapaleniu tętnic

Przeglądaj więcej filmów