Name: Oznaczanie 3-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Poznaj metodę głębokiego sekwencjonowania do mapowania 3'-końców nascencyjnych cDNA HIV-1 z zakażonych komórek. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę odwrotnej transkrypcji wirusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony członków laboratorium Malim, Luisa Apolonii, Jernej Ule i Rebecci Oakey. Autorzy dziękują Mattowi Arno z King's College London Genomic Centre i Debbie Hughes z University College London (UCL), Institute for Neurology Next Generation Sequencing Facility, za pomoc w sekwencjonowaniu MiSeq. Prace były wspierane przez brytyjską Radę ds. Badań Medycznych (G1000196 i MR/M001199/1 do M.M.), Wellcome Trust (106223/Z/14/Z do M.M.), Siódmy Program Ramowy Komisji Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr. PIIF-GA-2012-329679 (do DP) oraz Departament Zdrowia za pośrednictwem nagrody National Institutes for Health Research Comprehensive Biomedical Research Center dla Guy's and St. Thomas' NHS Foundation Trust we współpracy z King's College London i King's College Hospital NHS Foundation Trust.

<ol><li>Herschhorn, A., Hizi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+reverse+transcriptases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Retroviral reverse transcriptases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).</li>
<li>Hu, W. S., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reverse+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reverse transcription.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), (2012).</li>
<li>Levin, J. G., Mitra, M., Mascarenhas, A., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21160280">Role of HIV-1 nucleocapsid protein in HIV-1 reverse transcription.</a> RNA Biology. 7 (6), 754-774 (2010).</li>
<li>Menendez-Arias, L., Sebastian-Martin, A., Alvarez, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28043823">Viral reverse transcriptases.</a> Virus Research. , (2016).</li>
<li>Telesnitsky, A., Goff, S. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19376/">Retroviruses</a>. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).</li>
<li>Pollpeter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+of+HIV-1+reverse+transcripts+reveals+the+multifaceted+antiviral+functions+of+APOBEC3G%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G.</a> Nature Microbiology. 3 (2), 220-233 (2018).</li>
<li>Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+production+of+full-length+cDNAs+from+rare+transcripts%3A+amplification+using+a+single+gene-specific+oligonucleotide+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (23), 8998-9002 (1988).</li>
<li>Liu, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+5%27+and+3%27+ends+of+Tetrahymena+thermophila+mRNAs+using+RNA+ligase+mediated+amplification+of+cDNA+ends+%28RLM-RACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping the 5' and 3' ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE).</a> Nucleic Acids Research. 21 (21), 4954-4960 (1993).</li>
<li>Ince, I. A., Ozcan, K., Vlak, J. M., van Oers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+classification+and+mapping+of+non-polyadenylated+transcripts+of+an+invertebrate+iridovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Temporal classification and mapping of non-polyadenylated transcripts of an invertebrate iridovirus.</a> Journal of General Virology. 94, Pt 1 187-192 (2013).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li>
<li>Kwok, C. K., Ding, Y., Sherlock, M. E., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybridization-based+approach+for+quantitative+and+low-bias+single-stranded+DNA+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A hybridization-based approach for quantitative and low-bias single-stranded DNA ligation.</a> Analytical Biochemistry. 435 (2), 181-186 (2013).</li>
<li>Abram, M. E., Tsiang, M., White, K. L., Callebaut, C., Miller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+strategy+to+assess+intrinsic+inhibition+efficiencies+of+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A cell-based strategy to assess intrinsic inhibition efficiencies of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (2), 838-848 (2015).</li>
<li>Bishop, K. N., Verma, M., Kim, E. Y., Wolinsky, S. M., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APOBEC3G+inhibits+elongation+of+HIV-1+reverse+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">APOBEC3G inhibits elongation of HIV-1 reverse transcripts.</a> PLoS Pathogens. 4 (12), 1000231(2008).</li>
<li>Zack, J. A., Haislip, A. M., Krogstad, P., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompletely+reverse-transcribed+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomes+in+quiescent+cells+can+function+as+intermediates+in+the+retroviral+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle.</a> Journal of Virology. 66 (3), 1717-1725 (1992).</li>
<li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> Journal of Virology. 59 (2), 284-291 (1986).</li>
<li>Shah, V. B., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+uncoating+of+HIV-1+cores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro uncoating of HIV-1 cores.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education-library/2/basic-methods-in-cellular-and-molecular-biology">Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education-library/2/basic-methods-in-cellular-and-molecular-biology">JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Using a Hemocytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11464915">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Mangeat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+antiretroviral+defence+by+human+APOBEC3G+through+lethal+editing+of+nascent+reverse+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts.</a> Nature. 424 (6944), 99-103 (2003).</li>
<li>Gillick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+HIV-1+infection+by+APOBEC3+proteins+in+primary+human+CD4%28%2B%29+T+cells+is+associated+with+inhibition+of+processive+reverse+transcription+as+well+as+excessive+cytidine+deamination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Suppression of HIV-1 infection by APOBEC3 proteins in primary human CD4(+) T cells is associated with inhibition of processive reverse transcription as well as excessive cytidine deamination.</a> Journal of Virology. 87 (3), 1508-1517 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytidine+deaminase+CEM15+induces+hypermutation+in+newly+synthesized+HIV-1+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA.</a> Nature. 424 (6944), 94-98 (2003).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Troutt, A. B., McHeyzer-Williams, M. G., Pulendran, B., Nossal, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-anchored+PCR%3A+a+simple+amplification+technique+with+single-sided+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9823-9825 (1992).</li>
<li>Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+Methanobacterium+thermoautotrophicum+RNA+ligase+-+engineering+a+thermostable+ATP+independent+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of Methanobacterium thermoautotrophicum RNA ligase - engineering a thermostable ATP independent enzyme.</a> BMC Molecular Biology. 13 (24), (2012).</li>
<li>Li, T. W., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-independent+and+quantitative+ligation+of+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-independent and quantitative ligation of single-stranded DNA.</a> Analytical Biochemistry. 349 (2), 242-246 (2006).</li>
<li>Gansauge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).</li>
<li>Ding, Y., Kwok, C. K., Tang, Y., Bevilacqua, P. C., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+in+vivo+RNA+structure+at+single-nucleotide+resolution+using+structure-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of in vivo RNA structure at single-nucleotide resolution using structure-seq.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1050-1066 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Dostępność szybkiego, niezawodnego i opłacalnego głębokiego sekwencjonowania zrewolucjonizowała wiele aspektów w dziedzinie nauk przyrodniczych, umożliwiając bardzo szczegółowe analizy oparte na sekwencjonowaniu. Pozostałym wyzwaniem pozostaje innowacyjne zaprojektowanie i stworzenie reprezentatywnych bibliotek sekwencjonowania. W tym miejscu opisujemy protokół wychwytywania powstających cząsteczek cDNA wirusa, w szczególności produktów pośrednich procesu odwrotnej transkrypcji HIV-1.
Najważniejszym krokiem w tej strategii jest podwiązanie adaptera do otwartych końców 3' w sposób ilościowy i bezstronny. Skuteczność ligacji między dwoma końcami ssDNA, zarówno międzycząsteczkowymi, jak i wewnątrzcząsteczkowymi, została zbadana i zoptymalizowana pod kątem różnych zastosowań 11,26,27,28,29. Wybór użycia adaptera spinki do włosów z ligazą DNA T4 w warunkach opisanych w kroku 3.3 jest wynikiem optymalizacji empirycznej, w której oceniliśmy różne ligazy, adaptory i odczynniki do ligacji syntetycznych oligonukleotydów reprezentujących sekwencje HIV-1 (tabela 2) (dane nie pokazane). W tych reakcjach badań in vitro potwierdziliśmy, że ligacja adaptera spinki do włosów za pośrednictwem ligazy DNA T4, jak opisano przez Kwok i wsp. 11, ma bardzo niskie odchylenie i osiąga prawie całkowitą ligację cząsteczek akceptora, gdy adapter jest używany w nadmiarze. Na wydajność ligacji nie miało wpływu dodanie sekwencji nukleotydów, aby adapter był kompatybilny z systemem starterów multipleksowych (patrz rysunek 4). Dla porównania, stwierdziliśmy, że termostabilna ligaza 5'DNA / RNA ("Ligaza A", patrz Tabela materiałów dla dokładnych ligaz porównanych tutaj), która jest zmodyfikowaną ligazą RNA, która została opracowana częściowo w celu poprawy wydajności ligacji z ssDNA jako akceptorem27, była rzeczywiście bardziej skuteczna w ligowaniu dwóch cząsteczek ssDNA niż ligaza RNA ("Ligaza B"), ale miała znaczne odchylenie, z dużymi różnicami w skuteczności ligacji nawet między oligonukleotydami o pojedynczych różnicach długości zasad [tab. 2; HTP con mid G (a) i (b)]. Co więcej, znaleźliśmy tylko minimalne odchylenie w reakcjach z "Ligazą C" w połączeniu z adaptorem przenoszącym losowe 5'-końce (strategia stosowana do kompensacji znanego odchylenia nukleotydowego "Ligazy C"; patrz na przykład Ding i wsp.Jednak ligacje międzycząsteczkowe, w których pośredniczy "ligaza C", były niekompletne, co sprawiało, że system ligazy DNA T4 był lepszym wyborem.
Kilka etapów kontroli jakości w trakcie trwania protokołu oraz włączenie kontroli pozytywnych i ujemnych pozwala na wykrycie potencjalnych problemów przed kontynuacją testu i zapewnia wskazówki dotyczące działań związanych z rozwiązywaniem problemów. Oznaczanie ilościowe qPCR w etapach 2.2.2 i 2.3.12 zapewnia, że ilość materiału wejściowego jest wystarczająca. Typowa liczba kopii cDNA w elucji 200 μl (od kroku 2.1) waha się od około 10 000 do 300 000 na μl. Etap wychwytywania hybrydowego może spowodować pewną utratę całkowitej ilości cDNA HIV-1, ale powinien skutkować silnym wzbogaceniem specyficznego cDNA HIV-1 w stosunku do DNA komórkowego, co można określić przy użyciu odpowiednich starterów do ilościowego określenia genomowego DNA przed i po wzbogaceniu przez qPCR lub poprzez pomiar całkowitego stężenia DNA. Odzyskane cDNA HIV-1 po etapach wychwytywania hybrydowego powinno stanowić co najmniej 10% danych wejściowych. Niski poziom materiału wyjściowego może w przeciwnym razie wyjaśniać udaną kontrolę dodatnią oligonukleotydów (zob. etap 3.3.2), ale tylko ograniczone odczyty uzyskane w próbkach. Niska ogólna liczba odczytów może być również wyjaśniona przeszacowaniem koncentracji w bibliotece z powodu obecności nieistotnych gatunków DNA bez adapterów MiSeq. Skutkowałoby to niską gęstością klastrów i można je poprawić, określając stężenie sekwencji HIV-1 w bibliotece za pomocą qPCR oprócz całkowitej ilości DNA za pomocą testów fluorometrycznych. Ze względu na bardzo czuły charakter metody, należy zachować szczególną ostrożność w celu uniknięcia nawet niskiego poziomu zanieczyszczenia, zarówno z innych próbek (w szczególności z kontrolnych zapasów oligonukleotydów o wysokim stężeniu), jak i ze sprzętu laboratoryjnego. Praca na stanowisku do sterylizacji UV PCR jest pod tym względem korzystna. Zautomatyzowana elektroforeza żelowa w bibliotece końcowej (krok 6.1.2) jest kolejnym środkiem kontroli jakości. Zwykle obserwowany zakres wielkości kwasów nukleinowych wynosi od 150 do 500 nt. Startery, które można wykryć w opcjonalnej kontroli po PCR i przed oczyszczeniem (patrz uwaga w kroku 5.2), powinny być teraz nieobecne. W reprezentatywnym wyniku krzywa intensywności próbki ma pik około 160 do 170 nt i drugi ostrzejszy pik około 320 do 350 nt. Prawdopodobnie odzwierciedla to często obserwowaną większą obfitość zarówno w stosunkowo krótkich (1 do 20 nt długości wkładki) odwrotnych transkrypcjach, jak i pełnometrażowych strong-stop (180 do 182 nt długości insertu) (Figura 3b).
Chociaż przedstawiony protokół i wybrane startery są specyficzne dla wczesnych konstruktów odwrotnej transkrypcji HIV-1, metoda ta ma ogólne zastosowanie w każdym badaniu mającym na celu określenie otwartych 3'-końców DNA. Głównymi modyfikacjami wymaganymi w innych kontekstach będą metoda wychwytywania hybrydowego oraz strategia projektowania podkładów. Na przykład, jeśli cel ma być przystosowany do późnych transkryptów HIV-1, wskazana byłaby większa liczba różnych wychwytujących biotynylowanych oligonukleotydów wyżarzających się na całej długości cDNA, co prawdopodobnie zmniejszy straty na etapie wychwytywania hybrydy. Jak wspomniano we wprowadzeniu, ważne jest, aby wziąć pod uwagę ograniczenia podczas projektowania zakresu, w którym mają być wykrywane 3'-końce, aby uniknąć różnych źródeł odchylenia. Po pierwsze, może wystąpić błąd systematyczny w reakcjach PCR, jeśli matryce z adapterem mają znacznie różną długość. Po drugie, zastosowana tutaj platforma sekwencjonowania (np. MiSeq) ma preferowany zakres długości wkładek dla optymalnego grupowania, a znacznie krótsze i dłuższe produkty mogą nie być sekwencjonowane z taką samą wydajnością. Częściowo można temu zaradzić obliczeniowo, tak jak to zrobiono, obliczając współczynnik korekcyjny dla liniowego odchylenia długości (patrz rysunek 4, dolny wykres). Jeśli jednak obszar, w którym pożądane jest mapowanie 3'-końców, jest długi (> 1000 nt), bardziej wskazane jest podzielenie reakcji za pomocą ligowanych transkryptów i użycie wielu starterów w górę do oceny 3'-końców w sekcjach.
Program analityczny został napisany wewnętrznie w konkretnym celu analizy zarówno ostatniego nukleotydu sekwencji HIV-1 sąsiadującego z ustaloną sekwencją adaptorową, jak i zmienności zasad wszystkich zasad w celu zidentyfikowania wszelkich mutacji. Poszczególne kroki obejmują następujące kroki: po pierwsze, sekwencje adapterów są przycinane za pomocą zestawu narzędzi fastx-0.0.13; Następnie wszystkie sekwencje, które są zduplikowane (co oznacza identyczne sekwencje, w tym kod kreskowy), są usuwane. Wszystkie pozostałe unikalne odczyty są następnie wyrównywane do sekwencji HIV-1 za pomocą muszki (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) z maksymalnym niedopasowaniem ustawionym na trzy podstawy. Sekwencja matrycy składa się z pierwszych 635 nt cDNA HIV-1 (szczep NL4.3), który obejmuje sekwencję -sss i produkt transferu pierwszej nici do ścieżki polipurynowej (U5-R-U3-PPT; patrz rysunek 1). W związku z tym dostarczone oprogramowanie i szablony są bezpośrednio odpowiednie tylko wtedy, gdy metoda jest stosowana do tego samego zastosowania (wykrywanie wczesnych odwrotnych transkryptów HIV-1NL4.3). Konieczne będzie wprowadzenie zmian w przypadku innych sekwencji docelowych. Pozycje 3'-końcówek dla każdego odczytu zostały określone przez pozycję w wyrównaniu. Wywołania bazowe dla każdej pozycji są rejestrowane, a współczynniki mutacji są obliczane na podstawie całkowitego pokrycia każdej zasady, które jest różne, ponieważ odczyty mają różną długość, a długie wstawki mogą nie być w pełni pokryte przez sekwencjonowanie 125 zasad w Read2.
Podsumowując, uważamy, że opisana metoda jest cennym narzędziem dla wielu rodzajów badań. Oczywiste zastosowania obejmują badania mechanizmów leżących u podstaw hamowania odwrotnej transkrypcji przez leki przeciwretrowirusowe lub czynniki restrykcyjne komórkowe. Jednak tylko stosunkowo niewielkie dostosowania powinny być konieczne w celu dostosowania systemu do mapowania 3'-końców w obrębie innych jednoniciowych produktów pośrednich wirusa DNA, które są obecne, na przykład, w replikacji parwowirusa. Co więcej, zasada działania metody, a w szczególności jej zoptymalizowany etap ligacji, może stanowić kluczową część projektu przygotowania biblioteki do charakteryzowania dowolnych rozszerzeń 3'-DNA, w tym elongacji katalizowanych przez komórkowe dwuniciowe polimerazy DNA.

Aby w pełni przeanalizować i zrozumieć replikację wirusa, potrzebne są coraz bardziej wyrafinowane techniki wychwytywania produktów pośrednich replikacji. W szczególności dokładna definicja wirusowych kwasów nukleinowych w kontekście zakażonych komórek może dostarczyć nowych informacji, ponieważ do tej pory zbadano wiele mechanizmów replikacji wirusa w izolowanych reakcjach in vitro. Doskonałym przykładem jest proces odwrotnej transkrypcji w retrowirusach, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności1 (HIV-1). Różne etapy odwrotnej transkrypcji HIV-1, podczas których enzym wirusowy odwrotna transkryptaza (RT) kopiuje jednoniciowy genom RNA do dwuniciowego DNA, były badane głównie w testach rozszerzenia starterów z oczyszczonymi białkami i kwasami nukleinowymi1,2,3,4,5. Chociaż ustalono podstawowe zasady, takie testy nie obejmują wszystkich składników wirusowych i komórkowych i mogą nie odzwierciedlać biologicznie istotnych stechiometrii zaangażowanych czynników. Dlatego zaprojektowaliśmy potężną technikę określania widm produktów pośrednich odwrotnej transkrypcji z ich precyzyjnymi końcami cDNA 3' (tj. określając ich dokładną długość) i sekwencjami nukleotydowymi w kontekście infekcji żywych komórek6. Gromadzenie danych z eksperymentów w czasie może być wykorzystane do porównania profilu transkryptów w różnych warunkach, takich jak obecność cząsteczek lub białek przeciwwirusowych, które mogą wpływać na wydajność i procesywność syntezy i akumulacji DNA. Pozwala to na bardziej szczegółowe zrozumienie naturalnego cyklu życiowego patogenu, który często stanowi podstawę do projektowania ukierunkowanych leków i skutecznej interwencji terapeutycznej.
Odwrotna transkrypcja HIV-1 składa się z serii następujących po sobie zdarzeń zainicjowanych przez wyżarzanie startera tRNA do matrycy genomowego RNA, która jest następnie przedłużana przez RT w celu wytworzenia krótkiego, jednoniciowego transkryptu cDNA zwanego minus-nicią strong-stop (-sss) (patrz Rysunek 1). Następnie cDNA -sss jest przenoszone z 5'-długiego końcowego powtórzenia (LTR) do 3'-LTR genomowego RNA, gdzie wyżarza się i służy jako starter do dalszego wydłużania nici ujemnej DNA za pośrednictwem RT (patrz recenzje na temat odwrotnej transkrypcji1,2,3,4). Ten pierwszy transfer nici jest jednym z etapów ograniczających szybkość odwrotnej transkrypcji; w związku z tym wiadomo, że cDNA -sss się gromadzi. Podstawowy przepływ pracy i projekt biblioteki do przechwytywania produktów odwrotnej transkrypcji w zainfekowanych komórkach przedstawiono na rysunku 2a. Specyficzne startery i ustawienia analizy, które są używane w protokole i wymienione w tabeli 1, są ukierunkowane na wszystkie wczesne produkty pośrednie cDNA z odwrotną transkrypcją w zakresie długości od 23 do ~ 650 nt, który obejmuje DNA 180-182 nt -sss. Jednak odpowiednie drobne dostosowania strategii pozwolą na zastosowanie nie tylko do późnych produktów odwrotnej transkrypcji, ale także do innych wirusów i systemów, których celem jest wykrycie końcówek DNA zawierających 3'-OH. Ważne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę, obejmują zakres długości końcowego produktu PCR w bibliotece; W szczególności szablony, w których odległość między adapterem na otwartym końcu 3' a miejscem startera górnego przekracza ~1000 NT, będą prawdopodobnie mniej efektywnie sekwencjonowane, co potencjalnie wprowadzi wprowadzające w błąd błędy techniczne podczas przygotowywania biblioteki (zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej szczegółów i sugestie dotyczące adaptacji).
Wcześniej opisywane techniki systematycznego oznaczania 3'-końców nici kwasu nukleinowego koncentrowały się na cząsteczkach RNA, a nie DNA. Jednym z przykładów jest 3' RACE (szybka amplifikacja końców cDNA)7, która opiera się na poliadenylacji mRNA. Ponadto opracowano strategie oparte na ligacji adaptorowej z wykorzystaniem ligaz RNA, które obejmowały RLM-RACE (RACE, w którym pośredniczy ligaza RNA)8 lub LACE (amplifikacja końców cDNA oparta na ligacji)9. Ważne jest, aby podkreślić, że amplifikacje oparte na ligacji są wrażliwe na wszelkie odchylenia wprowadzone przez samą reakcję ligacji. Na przykład ligacja może być mniej lub bardziej wydajna w zależności od konkretnego nukleotydu w pozycji 3', sekwencji, całkowitej długości cząsteczki lub lokalnej struktury. Takie preferencje ligazy prowadzą do niepełnego wychwytywania cząsteczek i błędnej reprezentacji w odczycie, co zaobserwowaliśmy my i inni9,10. Aby zminimalizować błąd systematyczny ligacji podczas etapów dodawania adaptera w opisanym tutaj protokole, przetestowaliśmy szereg strategii ligacji i znaleźliśmy zastosowanie ligazy DNA T4 z jednoniciowym adapterem DNA typu spinka do włosów (zgodnie z opisem Kwok i wsp.11) jako jedyna procedura z niemal ilościową ligacją, która nie powodowała istotnych różnic w skuteczności ligacji, gdy była oceniana za pomocą specjalnie wybranego zestawu kontrolnych oligonukleotydów<klasa SUP = "xref">6. Wybór tej strategii podwiązywania jest zatem kluczową cechą sukcesu tego protokołu.
Do tej pory, monitorowanie progresji HIV-1 RT w zakażonych komórkach było głównie realizowane poprzez pomiar produktów odwrotnej transkrypcji o różnej długości za pomocą ilościowego PCR (qPCR) przy użyciu zestawów starter-probe, które jednoznacznie mierzą krótsze lub dłuższe (odpowiednio wczesne i późne) produkty cDNA12,13,14. Chociaż to podejście qPCR jest odpowiednie do określenia wewnętrznej skuteczności procesu odwrotnej transkrypcji w systemach komórkowych, dane wyjściowe mają stosunkowo niską rozdzielczość, bez uzyskiwania informacji o sekwencji. Nasze nowe podejście, oparte na zoptymalizowanej ligacji adaptora, generowaniu bibliotek za pośrednictwem PCR i głębokim sekwencjonowaniu, wypełnia lukę technologiczną i oferuje możliwość monitorowania odwrotnej transkrypcji podczas zakażenia HIV-1 ilościowo i z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.
Zilustrowaliśmy użyteczność tej metody w badaniu, które rozróżniało dwa proponowane modele zdolności czynnika ograniczającego HIV-1 APOBEC3G (apolipoproteiny B mRNA edytującego enzym katalityczny polipeptyd podobny do 3G) do zakłócania produkcji wirusowych odwrotnych transkryptów6.

<table><tbody><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15150-122</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 HeraCell Vios 250i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030966</td><td></td></tr><tr><td>Laminar okap przepływowy - CAS BioMAT2</td><td>Wolflabs</td><td>CAS001-C2R-1800</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane z TC 10 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&trade; Ekspresowy (1x), Stabilny enzym zastępujący trypsynę</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM&reg; (Minimalny niezbędny nośnik)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 Zakaźny klon molekularny (pNL4-3)</td> <td>NIH Program odczynników AIDS</td><td>114</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenimina (PEI) - MW: 25000</td><td>PolySciences Inc</td><td>23966-2</td><td>rozpuszczony w 1 mg / ml i dostosowany do pH7</td></tr><tr><td>RQ1- Filtr Dnazy Promega</td><td></td><td>M6101</td><td></td>bez rnazy</tr><tr><td>0,22 i mu; m</td><td>Triple Red Limited</td><td>FPE404025</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki polipropylenowe</td><td>Corning</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Sorval</td><td>WX Ultra Series</td><td>Wirnik TH-641</td></tr><tr><td>Antygen ELISA Alliance HIV-1 p24</td><td>zestaw Perkin Elmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>Komórki CEM-SS</td><td>NIH Program odczynników na AIDS</td><td>776</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>CoStar&reg; Płytki wielodołkowe poddane działaniu TC</td><td>Corning</td><td>CLS3513-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa: Heraus & trade; Multifuge &trade; X3 FR</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004536</td><td></td></tr><tr><td>TX-1000 Wahadłowy wirnik kubełkowy</td><td>Mikrowirówka Thermo Scientific</td><td>75003017</td><td></td></tr><tr><td>: 5424R</td><td></td> Zestaw do ekstrakcji całkowitego <td>DNA Eppendorf</td> 5404000060 <td></td></tr><tr><td>(zestaw do krwi i tkanek DNeasy)</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Bez nukleazy H2O</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td> <td>CutsmartNew England Biolabs (część enzymu DpnI)</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy do qPCR</td><td>MWG Eurofins</td><td>N/A</td><td>HPSF Purification</td></tr><tr><td>TaqMan PCR Universal Mastermix</td><td>Thermo</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>LoBind Eppendorf&reg; probówki</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>Axygen i handel; Końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 1000 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>TF-000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&trade; końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 200 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>TF-200-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&trade; końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 20 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&trade; końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 10 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>TF-10-R-S</td><td></td></tr><tr><td>PCR czysty kaptur</td><td>LabCaire</td><td>Model PCR-62</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&handel; 2-magnes</td><td>Thermo</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna MagneSphere&reg; cząstki paramagnetyczne</td><td>Promega</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Thermo Scientific</td><td>37582</td><td></td></tr><tr><td>Rotator typu end over end, Rewolwer&trade; 360&deg;</td><td>Labnet</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma</td><td>H1758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa dwuwodna</td><td>Electran (VWR)</td><td>443885J</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dri-Block&reg; Analogowa grzałka blokowa</td><td>Techne</td><td>UY-36620-13</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR i wypukłe nakrętki</td><td>Maszyna do PCR Thermo Scientific</td><td>AB0266</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Mastercycler&reg; seria</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór glikolu polietylenowego (PEG) w H2O, MW: 8000</td><td>Sigma</td><td>P1458-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Betaina roztwór, 5M</td><td>Sigma</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładujący żel II (bufor formamidowy)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>Prefabrykowane żele mocznikowe 6% TBE</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy komórkowej</td><td>Invitrogen, Novex</td><td>XCell SureLock&trade;</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Tris/Boranu/EDTA (10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10031223</td><td></td></tr><tr><td>Igła 21 G x1 1/2</td><td>VWR</td><td>613-2022</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold barwnik kwasu nukleinowego (10000x)</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader Nadajnik DR46B</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9800797</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Merck</td><td>101116</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór SDS 20% (w/v)</td><td>Biorad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Filtr probówkowy do wirówek</td><td>Appleton Woods</td><td>BC591</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Włókno szklane Gf/D 10mm</td><td>Whatman (VWR)</td><td>512-0427</td><td></td></tr><tr><td>kwas poliadenylowy (poliA) RNA</td><td>Sigma</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen, klasa biologii molekularnej</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol (2-propanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15809665</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, klasa biologii molekularnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>10041814</td><td></td></tr><tr><td>Accuprime&trade; Supermix I (premiks polimerazy DNA)</td><td>Life Technologies</td><td>12342-010</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext&reg; Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 i 2)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S; E7500S</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation D1000 Taśma ekranowa o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067- 5584</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki Tapestation D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067- 5585</td><td></td></tr><tr><td>2200 Tapestation - zautomatyzowany system elektroforezy żelowej</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; koraliki XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 2.0 Fluorometr</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Topo&trade; Zestaw do klonowania TA</td><td>Invitrogen</td><td>450071</td><td></td></tr><tr><td>Platforma sekwencjonowania: MiSeq System</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experiment Manager (oprogramowanie do pobierania próbek)</td><td>Illumina</td><td>Uwaga: Użyj TruSeq LT jako szablonu</td><td></td></tr><tr><td>Miseq&trade; Zestaw odczynników V3 (150 cykli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator sekwencjonowania: Basespace</td><td>Illumina</td><td>https://basespace.illumina.com</td><td></td></tr><tr><td>Ligase A: Termostabilny 5' App DNA/RNA ligaza</td><td>NEB</td><td>M0319S</td><td>Nie używany w tym protokole, ale testowany w procesie optymalizacji z wynikami opisanymi w dyskusji.</td></tr><tr><td>Ligaza B: Ligaza RNA T4 1</td><td>NEB</td><td>M0204</td><td>Nie stosowana w tym protokole, ale testowana w procesie optymalizacji z wynikami opisanymi w dyskusji.</td></tr><tr><td>Ligaza C: CircLigase</td><td>Epicentre</td><td>CL4111K</td><td>Nie jest używany w tym protokole, ale testowany w procesie optymalizacji z wynikami opisanymi w dyskusji.</td></tr></tbody></table>

oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego dna podczas odwrotnej transkrypcji hiv-1 w zakażonych komórkach

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitorowanie produktów pośrednich kwasów nukleinowych podczas replikacji wirusa dostarcza wglądu w efekty i mechanizmy działania związków przeciwwirusowych i białek komórek gospodarza na syntezę DNA wirusa. W tym miejscu zajmiemy się brakiem testu komórkowego o wysokim pokryciu i wysokiej rozdzielczości, który byłby w stanie zdefiniować retrowirusowe produkty pośrednie odwrotnej transkrypcji w fizjologicznym kontekście infekcji wirusowej. Opisana metoda wychwytuje 3'-końce powstających cząsteczek komplementarnego DNA (cDNA) w komórkach zakażonych wirusem HIV-1 w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Protokół obejmuje pobieranie DNA całej komórki, ukierunkowane wzbogacanie DNA wirusa poprzez wychwytywanie hybrydowe, ligację adaptora, frakcjonowanie wielkości poprzez oczyszczanie żelu, amplifikację PCR, głębokie sekwencjonowanie i analizę danych. Kluczowym krokiem jest skuteczna i bezstronna ligacja cząsteczek adaptorowych w celu otwarcia końców 3'-DNA. Zastosowanie opisanej metody pozwala na określenie liczebności odwrotnych transkryptów o każdej określonej długości w danej próbce. Dostarcza również informacji o (wewnętrznej) zmienności sekwencji w odwrotnych transkryptach, a tym samym o wszelkich potencjalnych mutacjach. Ogólnie rzecz biorąc, test jest odpowiedni dla wszelkich pytań związanych z przedłużeniem DNA 3', pod warunkiem, że znana jest sekwencja matrycy.

Technika opisana w niniejszym artykule została zastosowana w szerszym badaniu mającym na celu wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw inhibicji odwrotnej transkrypcji HIV-1 przez ludzkie białko antyretrowirusowe APOBEC3G (A3G)6. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane po zastosowaniu protokołu w próbkach limfocytów T CEM-SS zainfekowanych wirusem HIV-1 z deficytem vif w obecności lub przy braku A3G. Całkowita liczba unikalnych odczytów uzyskanych z każdej próbki po odfiltrowaniu duplikatów PCR posiadających ten sam 6 nt kod kreskowy oraz tę samą długość (wykonane przez dostarczone oprogramowanie analityczne) została przedstawiona na Rysunku 3a. Wzrost poziomu A3G redukuje całkowitą liczbę odczytów, co odzwierciedla hamujący wpływ A3G na syntezę cDNA zapośredniczoną przez RT, opisany i zmierzony wcześniej za pomocą qPCR6,13,21,22. Na Rysunku 3b przedstawiono frakcję cząsteczek o każdej możliwej długości w obrębie pierwszych 182 nt. W przypadku infekcji HIV-1 przy braku A3G najliczniejszym gatunkiem jest sama główna cząsteczka strong-stop o długości 180 nt, z pewną akumulacją odczytów w krótszym zakresie (23 do 40 nt) (wykres górny, histogramy niebieskie). Dodanie A3G zmienia ten profil, gdyż wykrywany jest gwałtowny wzrost liczby krótszych, utrąconych cząsteczek cDNA w kilku bardzo specyficznych, powtarzalnych pozycjach (wykresy środkowy i dolny). Ponieważ A3G jest cytidyno-deaminazą, mutacje cytozyny na urydynę (identyfikowane jako C-to-T) w cDNA występują, gdy A3G jest obecne w zakaźnych wirionach21,23,24. Wykorzystując uzyskane informacje z sekwencjonowania, procent mutacji C-to-T naniesiono na ten sam wykres (czerwona linia przerywana). Należy zauważyć, że profil mutacyjny został wyprowadzony ze wszystkich połączonych unikalnych odczytów, a pokrycie każdego nukleotydu będzie się różnić. Jednakże, jeśli jest to wymagane, informacje o sekwencji mogą zostać powiązane z każdą cząsteczką i skorelowane z konkretnym końcem 3'. Przedstawione dane pochodzą z pracy Pollpeter et al.6, a wykazano, że korelacja między profilami mutacyjnymi a długością cDNA wynika z wykrywania i rozcinania deaminowanego cDNA przez komórkowy aparat naprawy DNA.
Kontrolę pozytywną dla metody mapowania końców 3' można łatwo przygotować, przetwarzając pulę syntetycznych oligonukleotydów o znanej sekwencji, długości i stężeniu. Kontrolę tę dodaje się podczas ligacji adapterów w kroku 3.3.2 i zaleca się jej uwzględnienie we wszystkich bibliotekach multipleksowanych. Dane uzyskane z próbki kontrolnej powinny wykazać wszystkie oligonukleotydy w oczekiwanych stosunkach wejściowych, przy bardzo niskim poziomie odczytów tła. Rycina 4 przedstawia wyniki zestawu kontroli pozytywnej składającego się z 17 chemicznie syntetyzowanych oligonukleotydów (sekwencje podano w Tabeli 2), które zostały zmieszane w stosunkach ekimolarnych. Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie cząsteczki występują w niemal jednakowej liczebności z jedynie niewielkimi odchyleniami (wykres górny). Podczas gdy większość pozycji w sekwencji DNA -sss, które nie były reprezentowane przez oligonukleotyd, zwraca zerową liczbę odczytów, zaobserwowaliśmy niewielką ilość produktów, które są o 1 lub 2 nt krótsze od rzeczywistych oligonukleotydów kontrolnych. Nie badaliśmy dalej tych produktów pobocznych, przyjmując, że reprezentują one produkty zdegradowane lub niekompletne, które potencjalnie znajdowały się w dostarczonych zapasach oligonukleotydów w momencie zakupu (oligonukleotydy zamówiono jako oczyszczone metodą HPLC, dla których producent wskazał czystość &#62; 80%). Wykres dolny przedstawia próbkę kontrolną z innego przebiegu biblioteki, gdzie zmienność między 17 oligonukleotydami jest nieco większa i koreluje z całkowitą długością – dłuższe cząsteczki kontrolne są wykrywane wydajniej niż krótsze. Może to wynikać z niewielkiego błędu (bias) w reakcjach PCR lub podczas klastrowania w sekwencjonowaniu MiSeq, które posiada optymalną wielkość insertu i może wystąpić w bibliotekach o szczególnie szerokim zakresie wielkości insertów. Podstawowym sposobem na skorygowanie tego błędu jest zastosowanie czynnika normalizacji opartego na nachyleniu linii, która wskazuje błąd korelujący z długością cząsteczki (różowa linia). Wymagane obliczenia są zawarte w programie analitycznym (patrz krok 8.3 w protokole).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig1.jpg" /> 
Rycina 1:&#160;Schemat przedstawiający pierwsze etapy odwrotnej transkrypcji HIV-1. Proces rozpoczyna się od hybrydyzacji tRNA(Lys,3) (pomarańczowy) z miejscem wiązania startera (PBS) w wirusowym RNA genomicznym (krok 1), co umożliwia inicjację i elongację wirusowego cDNA (niebieski, krok 2).&#160;Jednocześnie matrycowe RNA genomiczne jest degradowane przez aktywność RNaseH odwrotnej transkryptazy (RT) (krok 3). Pierwszym pełnym produktem pośrednim w procesie odwrotnej transkrypcji jest cDNA silnego stopu nici minus (-)sss, który powstaje, gdy polimeryzacja katalizowana przez RT osiąga koniec 5' regionu powtórzeń (R) gRNA (krok 3). Pośrednik (-)sss jest przenoszony na koniec 3' matrycy RNA genomicznego poprzez hybrydyzację z komplementarnym regionem R długiego powtórzenia końcowego (LTR) 3'. Stąd polimeryzacja jest kontynuowana (krok 4). W opisanym metodzie postęp odwrotnej transkrypcji jest określany poprzez mapowanie dokładnej długości nowo powstałego wirusowego cDNA (niebieski). PPT, trakt polipurynowy; U5, unikalna sekwencja 5'; U3, unikalna sekwencja 3'. Rycina została przedrukowana z wcześniejszej publikacji6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3.jpg" /> 
Rysunek 2: Schemat przebiegu prac oraz schemat strategii ligacji adapterów i amplifikacji PCR. (a) Schemat przebiegu prac przedstawiający główne etapy opisanej techniki służącej do wyznaczania końców 3' transkryptów odwrotnych HIV-1 w zainfekowanych komórkach. Rysunek został zaadaptowany z wcześniejszej publikacji6. (b) Schemat strategii ligacji adapterów i amplifikacji PCR. Nowo powstałe cząsteczki cDNA o różnej długości, które zostały oczyszczone w poprzednich etapach, są ligowane z jednoniciowym adapterem DNA przy użyciu ligazy T4 DNA. Projekt adaptera w formie spinki do włosów (nazwanego „full Kwok + MiSeq”, patrz Tabela 1) był inspirowany pracami Kwok et al.11. Adapter zawiera losową 6 nt sekwencję kodu kreskowego (barcode), która umożliwia parowanie zasad ułatwiające ligację i jednocześnie służy jako identyfikator dla unikalnych odczytów. Końce 3' adaptera posiadają łącznik (SpC3) w celu zapobiegania samoligacji. Produkty ligacji są oddzielane od nadmiaru adaptera za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE). Kwasy nukleinowe w żelu są barwione i wycinane w trzech oddzielnych, równych fragmentach żelu w obszarze od poziomu powyżej adaptera do studzienki, zgodnie z metodą opisaną w25. Po elucji, wytrąceniu i resuspensji, produkty są amplifikowane metodą PCR z użyciem starterów przyłączających się do znanej sekwencji adaptera (starter 1, zestaw oligonukleotydów multipleksowych, patrz Tabela materiałów) oraz startera zawierającego pierwsze 22 nt sekwencji 5'-LTR HIV-1 bezpośrednio następującej po tRNA (starter 2, MP1.0 + 22HIV). Końce 5' wybranych starterów zawierają adaptery dla wybranej platformy sekwencjonowania (P5 i P7) oraz sekwencję indeksową w celu rozróżnienia poszczególnych próbek analizowanych w tej samej bibliotece. Oznaczono punkty startowe starterów odczytu sekwencjonowania. Niebieska ramka wskazuje region zainteresowania w celu wyznaczenia oryginalnych końców 3' uchwyconej cząsteczki. Rysunek ten został zaadaptowany z wcześniejszej publikacji6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig3.jpg" /> 
Rysunek 3Reprezentatywne wyniki. (a) Całkowita liczba odczytów reprezentatywnych próbek przetworzonych zgodnie z opisanym protokołem. Obejmuje to wszystkie sekwencje zidentyfikowane jako unikalne odczyty cząsteczek HIV-1, których końce 3' znajdowały się w obrębie pierwszych 635 nt cDNA nici minus (do PPT, patrz Rycina 1). Zakażenie wirusem HIV-1 nieprzenoszącym A3G daje najwyższą liczbę odczytów, podczas gdy A3G hamuje syntezę cDNA, a tym samym zmniejsza całkowitą liczbę odczytów. Niezakażone komórki posłużyły jako kontrola negatywna, natomiast zestaw syntetycznych oligonukleotydów stanowi kontrolę pozytywną. b) Względna liczebność cDNA dla każdej długości między pozycjami nukleotydowymi 23 a 182 (pełnowymiarowe cDNA sss ma od 180 do 182 nt) HIV-1NL4.3 sekwencja (oś X) jest przedstawiona na niebieskich histogramach (skala na lewej osi Y). Względną obfitość cDNA obliczono, dzieląc bezwzględną liczbę sekwencji kończących się na danym nukleotydzie w obrębie sekwencji cDNA -sss przez sumę wszystkich odczytów o długości 182 nt lub mniejszej. Czerwone linie przerywane przedstawiają procent odczytów z mutacjami C-na-T/U w odpowiedniej pozycji (skala na prawej osi Y)-osie). Rycina 3b zostało przedrukowane z poprzedniej publikacji6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki próbek kontrolnych. Przedstawiono dwa profile dla pul zawierających ekimolowe ilości 17 syntetycznych oligonukleotydów o różnych długościach. Oligonukleotydy te mają sekwencje pochodzące z HIV-1NL4.3 i zostały dobrane tak, aby obejmowały różne długości oraz prezentowały wszystkie 4 zasady jako nukleotyd 3'-końcowy (patrz Tabela 2). Górny wykres przedstawia próbkę kontrolną pozytywną z Rysunku 3a. Nie stwierdzono istotnego odchylenia w zależności od długości cząsteczek lub otwartych końców 3'. Dolny wykres przedstawia inny przebieg sekwencjonowania biblioteki, który spowodował niewielkie odchylenie długości w sekwencjonowaniu. W takim przypadku zaleca się zastosowanie współczynnika normalizacji, który jest wyprowadzony z nachylenia (zaznaczonego na różowo) reprezentującego odchylenie wielkości. Rysunek ten został przedrukowany z wcześniejszej publikacji6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Nazwa oligonukleotydu</td>
			<td>Długość w nt</td>
			<td colspan="12">Sekwencja</td>
			<td colspan="2">Cel</td>
			<td colspan="2">Producent (oczyszczanie)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">pełny Kwok + MiSeq</td>
			<td>61</td>
			<td colspan="12">5’-PHO-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3’</td>
			<td colspan="2">Adapter</td>
			<td colspan="2">Technologie DNA IDT (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Przynęta 2xBiotin SS</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5’-biotyna-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-biotyna-3’</td>
			<td colspan="2">Wzbogacanie hybrydyzacyjne</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Biotyna 1-16 ss</td>
			<td>22</td>
			<td colspan="12">5’-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3’</td>
			<td colspan="2">Hybrydyzacyjne wychwytywanie</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Biotynilowany tRNA + CTG</td>
			<td>16</td>
			<td colspan="12">5’-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3’</td>
			<td colspan="2">Hybrydowe wychwytywanie</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">MP1.0 + 22HIV</td>
			<td>82</td>
			<td colspan="12">5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3’</td>
			<td colspan="2">Amplifikacja PCR</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela oligonukleotydów zawierająca długość, sekwencje oraz modyfikacje wykorzystywane w opisanym protokole. Tabela została opracowana na podstawie wcześniejszej publikacji6.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table1_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako plik&#160;excel.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="2">Nazwa oligonu</td>
			<td >Długość w nt</td>
			<td colspan="12">Sekwencja</td>
			<td colspan="2">Producent (Oczyszczanie)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con long C</td>
			<td >120</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con long G</td>
			<td >119</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con long T</td>
			<td >116</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con long A</td>
			<td >118</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con mid C</td>
			<td >76</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con mid G (a)</td>
			<td >71</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con mid G (b)</td>
			<td >72</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con mid A&#160;</td>
			<td >69</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con mid T</td>
			<td >85</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con short A</td>
			<td >40</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con short T</td>
			<td >33</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con short G</td>
			<td >41</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP con short C</td>
			<td >34</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP Con 46 (T)</td>
			<td >46</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP Con 83 (C)</td>
			<td >83</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="7">5’-ctgctagagattttccacactg&#160;actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP Con 103 (C)</td>
			<td >103</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactg&#160;actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HTP Con 107 (A)</td>
			<td >107</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactg&#160;actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Tabela 17 syntetycznych oligonukleotydów kontrolnych użytych jako próbka kontrolna dodatnia. Pierwsze 13 oligonukleotydów wybrano na podstawie wielkości [długie (116 do 120 nt), średnie (69 do 85 nt), krótkie (33 do 41 nt)] oraz ich końców 3'. Tabela została opracowana na podstawie wcześniejszej publikacji6.&#160;&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table2_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako plik&#160;excel.</a>

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Ta nowa metoda analizy odwrotnej transkrypcji może nam powiedzieć nowe rzeczy o dziedzinie retrowirusologii. Na przykład możemy dowiedzieć się o szczegółach działania czynników ograniczeń komórkowych lub o tym, jak leki antyretrowirusowe hamują syntezę DNA HIV1. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie tylko dostarcza informacji o sekwencji powstających skryptów Reverse Tran, ale także umożliwia mapowanie ich precyzyjnych 3-pierwszych końców DNA w pojedynczej, ścisłej rozdzielczości jądrowej.Wzbogacanie uzupełniających się DNA HIV1 z hurtowego DNA komórek zakażonych wirusem HIV1 odbywa się metodą wychwytywania hybrydowego i powinno być przeprowadzane na stacji roboczej PCR. Przygotować główną mieszankę magnetycznych kulek streptawidyny przez nagłówek rury, sto mikrolitrów kulek na próbkę do jednej mikroprobówki wirówkowej, umieścić probówkę na magnesie odpowiednim dla mikroprobówek wirówkowych. Po tym, jak kulki osiądą w kierunku strony magnesu tuby, usuń bufor do przechowywania, wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w pięciuset mikrolitrach płynu do płukania spoiwa lub buforu BW.Umieść rurkę z powrotem na magnesie, poczekaj, aż koraliki przeniosą się do magnesu i usuń supernatant. Wyjmij rurkę z magnesu, dodaj pięćset mikrolitrów roztworu kazeiny, ponownie zawieś kulki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Po dziesięciu minutach umyj koraliki buforem BW.Umieść rurkę z powrotem na magnesie, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w pięciuset mikrolitrach buforu BW. Dodać pięćdziesiąt pikomoli każdego wychwyconego biotynylowanego oligonukleotydu na próbkę. Inkubować w temperaturze pokojowej, kołysząc się na końcu miksera przez trzydzieści minut.Następnie włóż rurkę z powrotem do magnesu, usuń supernatant, wyjmij rurkę z magnesu, dodaj pięćset mikrolitrów buforu 1x dziesięć i ponownie zawieś kulki. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić kulki z unieruchomionymi oligonukleotydami w dziesięciu mikrolitrach 1x dziesięć na próbkę. Dla każdej próbki oznacz jedną probówkę mikrocetrofużu i dodaj dziesięć mikrolitrów zawiesiny kulek, sto siedemdziesiąt mikrolitrów DNA i dziewięćdziesiąt mikrolitrów buforu 3x dziesięć.Inkubuj w suchym bloku ciepła w temperaturze dziewięćdziesięciu dwóch stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby odtworzyć DNA. Przenieś probówki do innego suchego bloku grzewczego, który jest ustawiony na pięćdziesiąt dwa stopnie Celsjusza i inkubuj przez godzinę. Co dziesięć minut podczas tej inkubacji odwracaj probówki, aby się wymieszały.Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji umyj kulki raz pięciuset mikrolitrami buforu 1x dziesięć i ponownie zawiesić w trzydziestu pięciu mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Upewnij się, że koraliki dobrze się osadzają, pozostawiając rurki na magnesie na około trzy minuty przed usunięciem płynu. Aby wymyć, inkubuj probówki w temperaturze dziewięćdziesięciu dwóch stopni Celsjusza w suchym bloku grzewczym przez dwie minuty.Następnie szybko przesuń rurki na magnes, po jednej rurce na raz. Gdy kulki zostaną przywiązane do boku probówki, przenieś supernatant zawierający DNA HIV1 do nowej probówki. Aby rozpocząć tę procedurę, ponownie zawiesić liofilizowany adapter na poziomie stu mikromolów w wodzie wolnej od nukleaz i przekręcić rurkę.Na próbkę plus jedną próbkę kontrolną połącz punkt zerowy cztery pięć mikrolitrów 10x bufora ligazy DNA T4, cztery mikrolitry adaptera i punkt zero pięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Podgrzej do dziewięćdziesięciu dwóch stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie pozwól mu powoli ostygnąć do szesnastu stopni Celsjusza w maszynie do PCR. Umożliwi to adapterowi uformowanie struktury szpilki do włosów.Kluczowym krokiem w tej procedurze jest skuteczna i bezstronna ligacja dostosowanych cząsteczek w celu otwarcia 3-pierwszych końców DNA. Oczyszczone powstające cząsteczki cDNA o różnej długości są ligowane do jednoniciowego adaptera DNA typu spinka do włosów przy użyciu ligazy DNA T4. Adapter przenosi losową sekwencję kodów kreskowych z sześcioma nukleotydami, która pozwala na parowanie w celu ułatwienia ligacji, a jednocześnie służy jako identyfikator dla unikalnych odczytów.Adapter 3-prime endi posiada element dystansowy, który zapobiega samoligacjonowaniu. Aby ustawić sześćdziesiąt mikrolitrów reakcji ligacji końcowej objętości, dodaj następujące elementy do każdej probówki PCR: sześć mikrolitrów 10x buforu ligazy DNA T4, dwadzieścia cztery mikrolitry czterdziestu procent PEG, sześć mikrolitrów pięcioprocentowej betainy, cztery pięć mikrolitrów adaptora, jeden punkt dwa mikrolitry ligazy DNA T4 i osiemnaście punktów trzynastu mikrolitrów DNA. Po dokładnym wymieszaniu reakcji inkubować w maszynie PCR w temperaturze szesnastu stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia po podwiązaniu adaptora, w trzydziestu mikrolitrach formamidu zawierającego żel DNA, należy umieścić bufor ładujący do każdej reakcji ligacji i dobrze wymieszać przez główkę rury. Podgrzej w maszynie do PCR w temperaturze dziewięćdziesięciu czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie natychmiast połóż na lodzie. Kolejnym krokiem jest przygotowanie się do denaturacji elektroforezy żelowej.Umieść wstępnie odtworzony sześcioprocentowy żel poliakryloamidowy z mocznikiem i KZM w odpowiednim zbiorniku żelu i dodaj 1x bufor do biegania TBE. Uruchom żel przez dwadzieścia minut. Następnie za pomocą strzykawki i igły o rozmiarze dwadzieścia jeden należy wypłukać kieszenie żelowe za pomocą buforu do biegania.Następnie załaduj trzydzieści mikrolitrów tej samej próbki na studzienkę do trzech studzienek. Zaleca się badanie tylko jednej próbki na żel, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Biegnij przez dwadzieścia minut.Podczas pracy żelu przygotuj trzy pięciomililitrowe probówki wirówkowe do mikrowirówek w punkcie zerowym na próbkę, używając igły strzykawkowej o rozmiarze dwudziestu jeden, aby zrobić otwory w dnie. Włóż każdą z przygotowanych probówek do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej i oznacz je nazwą próbki oraz niską, średnią lub wysoką. Gdy ciemnoniebieski przód barwnika znajdzie się mniej więcej w połowie żelu, przerwij elektroforezę i wyjmij kasetę z żelem.Podważ kasetę i przetnij żel pionowo żyletką. Aby obficie wyciąć pasek z trzema dołkami załadowanych próbek. Dodaj pasek żelu do pojemnika z 1x TBE i pięcioma mikrolitrami barwienia cyjaninowym kwasem nukleinowym i inkubuj przez trzy do pięciu minut.Upewnij się, że barwienie jest wystarczające, aby łatwo zidentyfikować górną część wolnego adaptera, którą należy później usunąć. Następnie dokładnie oczyść powierzchnię transiluminatora światła niebieskiego destylowaną wodą dejonizowaną. Następnie wyjmij kawałek żelu z pojemnika do barwienia i umieść go na pudełku świetlnym.Włącz kaseton świetlny i sprawdź poplamione kwasy nukleinowe przez pomarańczowy filtr. Reprezentatywna próbka podwiązanego DNA na barwionym żelu jest pokazana tutaj. Adapter zazwyczaj wydaje się przeciążony i działa jak duża plama z ligowanym DNA HIV1 biegnącym powyżej jako smuga.Czerwone linie wskazują miejsca, w których żel ma zostać przecięty w celu usunięcia wolnego adaptera i podzielenia próbki na trzy równe części. Za pomocą nowej żyletki odetnij boki żelu, jeśli nadal nie ma obszarów, w których nie ma załadowanej próbki. Następnie przetnij tuż nad adapterem, aby usunąć adapter i dolne części żelu.Na koniec odetnij samą górę żelu, w tym około jednego milimetra kieszeni żelowych, które często mają ostry, intensywny sygnał DNA o większej masie cząsteczkowej. Pozostałą cząstkę żelu zawierającą próbkę podzielić poziomo na trzy równe części. Obszary o niskiej, średniej i wysokiej masie cząsteczkowej.Następnie pokrój każdy z trzech fragmentów żelu na dwa na dwa milimetrowe kawałki i przenieś je do przygotowanych pięciomililitrowych probówek wirówek w punkcie zerowym. Wiruj z maksymalną prędkością z otwartymi pokrywkami przez minutę. Aby wycisnąć kawałki żelu przez otwór do dwumililitrowej tubki, aby utworzyć żelową breję.Jeśli jakiekolwiek cząstki żelu pozostaną na dnie pięciomililitrowej probówki w punkcie zerowym, przenieś je ręcznie do dwumililitrowej probówki za pomocą igły. Procedurę ekstrakcji DNA należy rozpocząć od dodania jednego mililitra buforu ekstrakcyjnego żelu mocznikowego do błota pośniegowego w każdej probówce do mikrowirówki. Obracaj rurki mikserem typu end over end w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny.Przygotuj kolumny filtru. Użyj czystego zestawu pęsety, aby dodać jeden mały okrągły filtr z włókna szklanego do każdej kolumny wirówkowej z filtrami membranowymi z octanu celulozy, co zapobiega zatykaniu się membrany. Umieść filtr na miejscu z odwróconą końcówką głowicy rury.Krótko odwirować dwie mililitrowe probówki z żelowym błotem pośniegowym i buforem ekstrakcyjnym w mikrowirówce i przenieść siedemset mikrolitrów supernatantu do przygotowanych kolumn filtracyjnych. Odwirować kolumny filtracyjne w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Następnie przenieś przepływ do nowej dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.Ponownie załaduj kolumny pozostałym supernatantem. Staraj się uzyskać jak najwięcej płynu z błota pośniegowego i nie przejmuj się, jeśli w zestawie znajdują się kawałki żelu. Zakręć ponownie.Połączyć przepływ tych samych próbek ekstrakcyjnych i postępować zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Protokół ten zastosowano w próbkach z komórek CEMS-ST zakażonych HIV-1 z niedoborem Vif-1 przy braku lub obecności antyretrowirusowego białka ludzkiego A3G. Wykres całkowitej liczby unikalnych odczytów uzyskanych z każdej próbki wskazuje, że rosnące poziomy A3G zmniejszają całkowitą liczbę odczytów.Odzwierciedlając hamujący wpływ A3G na syntezę cDNA za pośrednictwem odwrotnej transkryptazy. Na tych trzech następnych wykresach frakcja cząsteczek o każdej możliwej długości w obrębie pierwszych stu osiemdziesięciu dwóch nukleotydów jest pokazana na niebieskich histogramach. Dodanie A3G kosztowało gwałtowny wzrost krótszych, skróconych cząsteczek cdna w kilku bardzo specyficznych, powtarzalnych pozycjach.Przerywane czerwone linie pokazują procentowy odsetek odczytów zawierających mutacje C do T w odpowiedniej pozycji. Kontrolę pozytywną można uzyskać, przetwarzając pulę syntetycznych oligonukleotydów o znanej kolejności, długości i stężeniu. Wszystkie cząsteczki powinny pojawiać się w prawie równej obfitości z niewielkimi zmianami.Jeśli przebieg biblioteki powoduje niewielkie odchylenie długości, podczas sekwencjonowania zaleca się zastosowanie współczynnika normalizacji, który jest uzyskiwany na podstawie nachylenia reprezentującego odchylenie rozmiaru. Procedura ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów, w których określenie trzech pierwszych końców cząsteczek DNA dostarczyłoby kluczowych informacji na temat metabolizmu kwasów nukleinowych. Nie zapominaj, że praca z HIV może być bardzo niebezpieczna, a niektóre infekcje powinny być przeprowadzane tylko w wyznaczonych laboratoriach bezpieczeństwa.

determining-3-termini-sequences-nascent-single-stranded-viral-dna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Ilościowe oznaczenie poziomu RNA HIV-1 w osoczu oraz sekwencjonowanie pojedynczych genomów HIV-1 u osób z wiremią poniżej granicy wykrywalności (50-75 kopii/ml) jest trudne. W niniejszym materiale opisujemy sposób izolacji i oznaczania ilościowego wirusowego RNA z osocza przy użyciu testu real-time PCR, który wiarygodnie mierzy poziom RNA HIV-1 aż do 0,3 kopii/ml, a także metodę amplifikacji genomów wirusowych poprzez sekwencjonowanie pojedynczych genomów z próbek o bardzo niskiej ładunku...

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Ten protokół opisuje NAZWĘ, test, który pozwala na szybką identyfikację cząsteczek zdolnych do hamowania in vitro aktywności opiekuńczej białka nukleokapsydu HIV-1.

Test elektroforezy za pośrednictwem wyżarzania nukleokapsydu (NAME) umożliwia szybką identyfikację inhibitorów nukleokapsydu HIV-1

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Ten raport opisuje test in vitro do pomiaru aktywności integracyjnej ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) związanego z kompleksem preintegracji () w ekstraktach cytoplazmatycznych ostro zakażonych komórek. Integracja DNA HIV-1 związanego z z heterologicznym docelowym DNA jest określana ilościowo przy użyciu zagnieżdżonej strategii reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Poznaj metodę głębokiego sekwencjonowania do mapowania 3'-końców nascencyjnych cDNA HIV-1 z zakażonych komórek. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę odwrotnej transkrypcji wirusa.

Oznaczanie 3-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Przeglądaj więcej filmów