Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Ta nowa metoda analizy odwrotnej transkrypcji może nam powiedzieć nowe rzeczy o dziedzinie retrowirusologii. Na przykład możemy dowiedzieć się o szczegółach działania czynników ograniczeń komórkowych lub o tym, jak leki antyretrowirusowe hamują syntezę DNA HIV1. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie tylko dostarcza informacji o sekwencji powstających skryptów Reverse Tran, ale także umożliwia mapowanie ich precyzyjnych 3-pierwszych końców DNA w pojedynczej, ścisłej rozdzielczości jądrowej.

Wzbogacanie uzupełniających się DNA HIV1 z hurtowego DNA komórek zakażonych wirusem HIV1 odbywa się metodą wychwytywania hybrydowego i powinno być przeprowadzane na stacji roboczej PCR. Przygotować główną mieszankę magnetycznych kulek streptawidyny przez nagłówek rury, sto mikrolitrów kulek na próbkę do jednej mikroprobówki wirówkowej, umieścić probówkę na magnesie odpowiednim dla mikroprobówek wirówkowych. Po tym, jak kulki osiądą w kierunku strony magnesu tuby, usuń bufor do przechowywania, wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w pięciuset mikrolitrach płynu do płukania spoiwa lub buforu BW.

Umieść rurkę z powrotem na magnesie, poczekaj, aż koraliki przeniosą się do magnesu i usuń supernatant. Wyjmij rurkę z magnesu, dodaj pięćset mikrolitrów roztworu kazeiny, ponownie zawieś kulki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Po dziesięciu minutach umyj koraliki buforem BW.

Umieść rurkę z powrotem na magnesie, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w pięciuset mikrolitrach buforu BW. Dodać pięćdziesiąt pikomoli każdego wychwyconego biotynylowanego oligonukleotydu na próbkę. Inkubować w temperaturze pokojowej, kołysząc się na końcu miksera przez trzydzieści minut.

Następnie włóż rurkę z powrotem do magnesu, usuń supernatant, wyjmij rurkę z magnesu, dodaj pięćset mikrolitrów buforu 1x dziesięć i ponownie zawieś kulki. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić kulki z unieruchomionymi oligonukleotydami w dziesięciu mikrolitrach 1x dziesięć na próbkę. Dla każdej próbki oznacz jedną probówkę mikrocetrofużu i dodaj dziesięć mikrolitrów zawiesiny kulek, sto siedemdziesiąt mikrolitrów DNA i dziewięćdziesiąt mikrolitrów buforu 3x dziesięć.

Inkubuj w suchym bloku ciepła w temperaturze dziewięćdziesięciu dwóch stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby odtworzyć DNA. Przenieś probówki do innego suchego bloku grzewczego, który jest ustawiony na pięćdziesiąt dwa stopnie Celsjusza i inkubuj przez godzinę. Co dziesięć minut podczas tej inkubacji odwracaj probówki, aby się wymieszały.

Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji umyj kulki raz pięciuset mikrolitrami buforu 1x dziesięć i ponownie zawiesić w trzydziestu pięciu mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Upewnij się, że koraliki dobrze się osadzają, pozostawiając rurki na magnesie na około trzy minuty przed usunięciem płynu. Aby wymyć, inkubuj probówki w temperaturze dziewięćdziesięciu dwóch stopni Celsjusza w suchym bloku grzewczym przez dwie minuty.

Następnie szybko przesuń rurki na magnes, po jednej rurce na raz. Gdy kulki zostaną przywiązane do boku probówki, przenieś supernatant zawierający DNA HIV1 do nowej probówki. Aby rozpocząć tę procedurę, ponownie zawiesić liofilizowany adapter na poziomie stu mikromolów w wodzie wolnej od nukleaz i przekręcić rurkę.

Na próbkę plus jedną próbkę kontrolną połącz punkt zerowy cztery pięć mikrolitrów 10x bufora ligazy DNA T4, cztery mikrolitry adaptera i punkt zero pięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Podgrzej do dziewięćdziesięciu dwóch stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie pozwól mu powoli ostygnąć do szesnastu stopni Celsjusza w maszynie do PCR. Umożliwi to adapterowi uformowanie struktury szpilki do włosów.

Kluczowym krokiem w tej procedurze jest skuteczna i bezstronna ligacja dostosowanych cząsteczek w celu otwarcia 3-pierwszych końców DNA. Oczyszczone powstające cząsteczki cDNA o różnej długości są ligowane do jednoniciowego adaptera DNA typu spinka do włosów przy użyciu ligazy DNA T4. Adapter przenosi losową sekwencję kodów kreskowych z sześcioma nukleotydami, która pozwala na parowanie w celu ułatwienia ligacji, a jednocześnie służy jako identyfikator dla unikalnych odczytów.

Adapter 3-prime endi posiada element dystansowy, który zapobiega samoligacjonowaniu. Aby ustawić sześćdziesiąt mikrolitrów reakcji ligacji końcowej objętości, dodaj następujące elementy do każdej probówki PCR: sześć mikrolitrów 10x buforu ligazy DNA T4, dwadzieścia cztery mikrolitry czterdziestu procent PEG, sześć mikrolitrów pięcioprocentowej betainy, cztery pięć mikrolitrów adaptora, jeden punkt dwa mikrolitry ligazy DNA T4 i osiemnaście punktów trzynastu mikrolitrów DNA. Po dokładnym wymieszaniu reakcji inkubować w maszynie PCR w temperaturze szesnastu stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia po podwiązaniu adaptora, w trzydziestu mikrolitrach formamidu zawierającego żel DNA, należy umieścić bufor ładujący do każdej reakcji ligacji i dobrze wymieszać przez główkę rury. Podgrzej w maszynie do PCR w temperaturze dziewięćdziesięciu czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie natychmiast połóż na lodzie. Kolejnym krokiem jest przygotowanie się do denaturacji elektroforezy żelowej.

Umieść wstępnie odtworzony sześcioprocentowy żel poliakryloamidowy z mocznikiem i KZM w odpowiednim zbiorniku żelu i dodaj 1x bufor do biegania TBE. Uruchom żel przez dwadzieścia minut. Następnie za pomocą strzykawki i igły o rozmiarze dwadzieścia jeden należy wypłukać kieszenie żelowe za pomocą buforu do biegania.

Następnie załaduj trzydzieści mikrolitrów tej samej próbki na studzienkę do trzech studzienek. Zaleca się badanie tylko jednej próbki na żel, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Biegnij przez dwadzieścia minut.

Podczas pracy żelu przygotuj trzy pięciomililitrowe probówki wirówkowe do mikrowirówek w punkcie zerowym na próbkę, używając igły strzykawkowej o rozmiarze dwudziestu jeden, aby zrobić otwory w dnie. Włóż każdą z przygotowanych probówek do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej i oznacz je nazwą próbki oraz niską, średnią lub wysoką. Gdy ciemnoniebieski przód barwnika znajdzie się mniej więcej w połowie żelu, przerwij elektroforezę i wyjmij kasetę z żelem.

Podważ kasetę i przetnij żel pionowo żyletką. Aby obficie wyciąć pasek z trzema dołkami załadowanych próbek. Dodaj pasek żelu do pojemnika z 1x TBE i pięcioma mikrolitrami barwienia cyjaninowym kwasem nukleinowym i inkubuj przez trzy do pięciu minut.

Upewnij się, że barwienie jest wystarczające, aby łatwo zidentyfikować górną część wolnego adaptera, którą należy później usunąć. Następnie dokładnie oczyść powierzchnię transiluminatora światła niebieskiego destylowaną wodą dejonizowaną. Następnie wyjmij kawałek żelu z pojemnika do barwienia i umieść go na pudełku świetlnym.

Włącz kaseton świetlny i sprawdź poplamione kwasy nukleinowe przez pomarańczowy filtr. Reprezentatywna próbka podwiązanego DNA na barwionym żelu jest pokazana tutaj. Adapter zazwyczaj wydaje się przeciążony i działa jak duża plama z ligowanym DNA HIV1 biegnącym powyżej jako smuga.

Czerwone linie wskazują miejsca, w których żel ma zostać przecięty w celu usunięcia wolnego adaptera i podzielenia próbki na trzy równe części. Za pomocą nowej żyletki odetnij boki żelu, jeśli nadal nie ma obszarów, w których nie ma załadowanej próbki. Następnie przetnij tuż nad adapterem, aby usunąć adapter i dolne części żelu.

Na koniec odetnij samą górę żelu, w tym około jednego milimetra kieszeni żelowych, które często mają ostry, intensywny sygnał DNA o większej masie cząsteczkowej. Pozostałą cząstkę żelu zawierającą próbkę podzielić poziomo na trzy równe części. Obszary o niskiej, średniej i wysokiej masie cząsteczkowej.

Następnie pokrój każdy z trzech fragmentów żelu na dwa na dwa milimetrowe kawałki i przenieś je do przygotowanych pięciomililitrowych probówek wirówek w punkcie zerowym. Wiruj z maksymalną prędkością z otwartymi pokrywkami przez minutę. Aby wycisnąć kawałki żelu przez otwór do dwumililitrowej tubki, aby utworzyć żelową breję.

Jeśli jakiekolwiek cząstki żelu pozostaną na dnie pięciomililitrowej probówki w punkcie zerowym, przenieś je ręcznie do dwumililitrowej probówki za pomocą igły. Procedurę ekstrakcji DNA należy rozpocząć od dodania jednego mililitra buforu ekstrakcyjnego żelu mocznikowego do błota pośniegowego w każdej probówce do mikrowirówki. Obracaj rurki mikserem typu end over end w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny.

Przygotuj kolumny filtru. Użyj czystego zestawu pęsety, aby dodać jeden mały okrągły filtr z włókna szklanego do każdej kolumny wirówkowej z filtrami membranowymi z octanu celulozy, co zapobiega zatykaniu się membrany. Umieść filtr na miejscu z odwróconą końcówką głowicy rury.

Krótko odwirować dwie mililitrowe probówki z żelowym błotem pośniegowym i buforem ekstrakcyjnym w mikrowirówce i przenieść siedemset mikrolitrów supernatantu do przygotowanych kolumn filtracyjnych. Odwirować kolumny filtracyjne w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Następnie przenieś przepływ do nowej dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Ponownie załaduj kolumny pozostałym supernatantem. Staraj się uzyskać jak najwięcej płynu z błota pośniegowego i nie przejmuj się, jeśli w zestawie znajdują się kawałki żelu. Zakręć ponownie.

Połączyć przepływ tych samych próbek ekstrakcyjnych i postępować zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Protokół ten zastosowano w próbkach z komórek CEMS-ST zakażonych HIV-1 z niedoborem Vif-1 przy braku lub obecności antyretrowirusowego białka ludzkiego A3G. Wykres całkowitej liczby unikalnych odczytów uzyskanych z każdej próbki wskazuje, że rosnące poziomy A3G zmniejszają całkowitą liczbę odczytów.

Odzwierciedlając hamujący wpływ A3G na syntezę cDNA za pośrednictwem odwrotnej transkryptazy. Na tych trzech następnych wykresach frakcja cząsteczek o każdej możliwej długości w obrębie pierwszych stu osiemdziesięciu dwóch nukleotydów jest pokazana na niebieskich histogramach. Dodanie A3G kosztowało gwałtowny wzrost krótszych, skróconych cząsteczek cdna w kilku bardzo specyficznych, powtarzalnych pozycjach.

Przerywane czerwone linie pokazują procentowy odsetek odczytów zawierających mutacje C do T w odpowiedniej pozycji. Kontrolę pozytywną można uzyskać, przetwarzając pulę syntetycznych oligonukleotydów o znanej kolejności, długości i stężeniu. Wszystkie cząsteczki powinny pojawiać się w prawie równej obfitości z niewielkimi zmianami.

Jeśli przebieg biblioteki powoduje niewielkie odchylenie długości, podczas sekwencjonowania zaleca się zastosowanie współczynnika normalizacji, który jest uzyskiwany na podstawie nachylenia reprezentującego odchylenie rozmiaru. Procedura ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów, w których określenie trzech pierwszych końców cząsteczek DNA dostarczyłoby kluczowych informacji na temat metabolizmu kwasów nukleinowych. Nie zapominaj, że praca z HIV może być bardzo niebezpieczna, a niektóre infekcje powinny być przeprowadzane tylko w wyznaczonych laboratoriach bezpieczeństwa.