Name: Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę analizy proteomicznej polaryzacji ludzkich makrofagów w warunkach niedotlenienia. Technika umożliwia charakteryzację stanów aktywacji na poziomie białek bez znakowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AM jest finansowany przez Young Group Leader Program (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), przez la Ligue Nationale contre le Cancer i la Fondation ARC pour la recherche sur le Cancer. Dziękujemy Mariette Matondo z platformy Mass Spectrometry for Biology (UTECHS MSBIO, Pasteur Institute, Paryż). Dziękujemy Lauren Anderson za przeczytanie manuskryptu.

Próbki krwi ludzkiej (LRSC) od zdrowych, anonimowych dawców zostały pobrane z EFS (Francuska Narodowa Służba Krwi) w ramach autoryzowanego protokołu (CODECOH DC-2018–3114). Dawcy wyrazili podpisaną zgodę na wykorzystanie krwi.
1. Przygotowanie podłoża i bufora
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę makrofagową [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1x endogenne aminokwasy (NEAA)] i podgrzej ją do 37 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę makrofagową + 10% surowicy ludzkiej z osocza AB (SAB), przefiltrować (filtr 0,22 μm), a następnie ogrzać do 37 °C (zwanej dalej pożywką makrofagową + 10% SAB).</li>
	<li>Przygotować bufor sortujący [1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)], przefiltrować go (filtr 0,22 μm) i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z komory systemu leukoredukcji (LRSC)
<ol>
	<li>Umieścić 15 ml roztworu do separacji komórek z gradientem gęstości (patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, aby mogła ogrzać się do temperatury pokojowej (RT) przed otrzymaniem LRSC. 
	UWAGA: Gęstość zależy od temperatury. Ponieważ produkt ten jest przechowywany w temperaturze 4 °C, ten krok należy wykonać z wyprzedzeniem, aby mógł zrównoważyć się z RT.</li>
	<li>Opróżnij LRSC do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dodaj do 50 ml 1x PBS i wymieszaj. Bardzo powoli dodać 25 ml mieszanki przygotowanej w kroku 2.2 na 15 ml roztworu gradientu gęstości podgrzanego w kroku 2.1. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie mieszać faz na tym etapie. Krew musi być dodana do roztworu gradientu gęstości bez jakiegokolwiek zakłócenia tej fazy.</li>
	<li>Odwirować obie probówki wirówkowe przez 25 minut przy 700 x g bez przerw. 
	UWAGA: Pod koniec wirowania w gradiacji gęstości warstwy od dołu do góry to: erytrocyty i granulocyty tworzące osad, faza roztworu gradientu gęstości, warstwa PBMC i osocze.</li>
	<li>Za pomocą pipety przepuścić przez fazę plazmową bez jej zasysania i zebrać warstwę PBMC do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj do 50 ml 1x PBS do PBMC jako etap płukania i wiruj przez 10 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 ml pożywki makrofagowej.</li>
</ol>
3. Magnetyczne znakowanie i izolacja komórek CD14+ (monocytów)
<ol>
	<li>Policz PBMC w komorze Malasseza. Pobrać ilość PBMC niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu (zwykle 100 do 300 x 106 komórek), umieścić je w probówce wirówkowej i wirować przez 10 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 μl buforu sortującego przygotowanego w kroku 1.3 na 10-7 PBMCs. Dodać 20 μl mikrogranulek CD14 na 10-7 PBMCs. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C przy ciągłym mieszaniu.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu sortującego na 107 PBMC jako etap płukania i odwirować przez 10 minut przy 300 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu sortującego na 108 PBMCs.</li>
	<li>Umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora. Przygotować kolumnę, przepłukując ją 3 ml buforu sortującego.</li>
	<li>Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę. Kolumna zależy od liczby komórek, które mają zostać wyizolowane (w tym przypadku używane są kolumny LS dla maksymalnie 109 PBMC). Zbierz przepływ zawierający nieoznakowane komórki. 
	UWAGA: Począwszy od tego etapu, wszystkie probówki (selekcja ujemna i dodatnia) są przechowywane do późniejszego sprawdzenia różnych etapów za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 3 x 3 ml buforu sortującego. Zbierz nieoznakowane komórki przechodzące przez tę samą probówkę z kroku 3.12. Wykonaj kroki mycia, dodając bufor sortujący, uważając, aby nie wysuszyć kolumny. Umieść probówkę zbiorczą pod kolumną i wyjmij ją z separatora.</li>
	<li>Odpipetować 5 ml buforu sortującego do kolumny. Natychmiast wypłukać magnetycznie oznaczone ogniwa, mocno wciskając tłok do kolumny. Aby zwiększyć czystość komórek CD14+, eluowaną frakcję wzbogaca się w drugiej kolumnie.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.4 do 3.7 z nową kolumną.</li>
</ol>
4. Posiewy monocytów
<ol>
	<li>Policz monocyty w komorze Malasseza. Sprawdź czystość komórek CD14 + za pomocą cytometrii przepływowej. Pobrać ilość monocytów niezbędną do eksperymentu i umieścić je w probówce wirówkowej.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 300 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad monocytów w pożywce makrofagowej. Płytki komórek i pozwól im osiąść przez 50 minut do 1 godziny. Odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką makrofagową + 10% SAB + 25 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) w celu wywołania różnicowania.</li>
</ol>
5. Polaryzacja makrofagów w dniu 6
<ol>
	<li>Zassać pożywkę. Zastąp go pożywką makrofagową + 10% SAB z różnymi bodźcami. Na przykład dodaj 10 ng/ml interferonu gamma (INFγ) + 1 ng/ml lipopolisacharydu (LPS), aby uzyskać polaryzację M1, lub 20 ng/ml interleukiny 4 (IL4) + 20 ng/ml interleukiny 13 (IL13) dla polaryzacji M2. 
	UWAGA: Stymulację można wykonać w okresie od 24 do 48 godzin przed przystąpieniem do innych testów.</li>
	<li>Zbieraj komórki za pomocą roztworu oddzielającego lub skrobaka do komórek.</li>
</ol>
6. Hodowla komórkowa w warunkach niskiej zawartości tlenu
<ol>
	<li>Zaczynając od kroku 4, utrzymuj monocyty, a następnie makrofagi w środowisku kontrolowanym tlenem, aby przeprowadzić analizę stanu niedotlenienia. Użyj stacji roboczej do hipoksji, aby utrzymać komórki pod pożądanym ciśnieniem parcjalnym tlenu podczas eksperymentu. 
	UWAGA: Podczas pracy pod niskim ciśnieniem tlenu ważne jest, aby przygotować wszystkie media i myjące pod stacją i odczekać wystarczająco dużo, aby uzyskać prawidłowe ciśnienie parcjalne w cieczy. Na przykład 10 ml PBS na szalce Petriego o średnicy 60 mm potrzebuje około 2 godzin, aby osiągnąć 25 mmHg dla ciśnienia parcjalnegoO2, zaczynając od ciśnienia atmosferycznego (jak zmierzyliśmy za pomocą światłowodowego czujnika tlenu). W wielu stacjach hipoksyjnych lub inkubatorach ciśnienie tlenu jest ustawione jako procent ciśnienia atmosferycznego. Jeśli konieczne są precyzyjne pomiary, lepiej skorzystać ze stacji upoważniającej do bezpośredniego ustawienia ciśnienia tlenu w mmHg.</li>
</ol>
7. Liza i trawienie w żelu (Protokół 1)
UWAGA: W tej i następnych sekcjach opisane są dwa protokoły używane do otrzymywania peptydów i przeprowadzania analizy LC-MS/MS. Protokół 1 opisuje lizę komórek oraz frakcjonowanie i trawienie w żelu, a protokół 2 opisuje lizę komórek w roztworze, po której następuje trawienie i frakcjonowanie w roztworze przy użyciu metody ogniskowania izoelektrycznego.
<ol>
	<li>Przeprowadzić lizę komórek w buforze Laemmli [234 mM Tris-HCL (pH 6,8), 7,5% SDS, 37% glicerol, 33,3% (v/v) β-merkaptoetanol, błękit bromofenolowy 0,2% w/v]. Załaduj odpowiednik białka 300 000 komórek dla każdej próbki na 4-12% żelach akrylamidowych bis-Tris.</li>
	<li>Kontroluj czas trwania migracji elektroforetycznej, aby umożliwić podzielenie każdej próbki białka na 6 pasm żelowych, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
	<li>Utrwalić żel roztworem utrwalającym (30% etanol + 7,5% kwas octowy przez 20 min), a następnie dodać roztwór barwiący (R-250 Coomassie blue przez 45 min). Dodaj roztwór odbarwiający (30% etanolu + 7,5% octu, aż pojawią się prążki) przed wycięciem pasm białkowych czystym skalpelem.</li>
	<li>Każdą wyciętą prążek pokrój w kostkę przed wprowadzeniem do probówek o pojemności 500 μl. Gwarantowana jest czysta szklana powierzchnia, aby uniknąć zanieczyszczenia keratynami (do czyszczenia powierzchni można użyć 5% roztworu SDS w wodzie dejonizowanej).</li>
	<li>Umyj plastry żelu 3 razy w 200 μl 25 mM wodorowęglanu amonu przez 20 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przemyj je raz w 25 mM wodorowęglanu amonu i acetonitrylu (50% v/v). Odwodnić kawałki żelu za pomocą 200 μl 100% acetonitrylu przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować każdy kawałek żelu z 10 mM DTT (ditiotreitol) w 25 mM wodorowęglanie amonu przez 45 minut w temperaturze 56 °C (200 μl), a następnie 55 mM jodoacetamidu w 25 mM wodorowęglanu amonu (200 μl) przez 35 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby zatrzymać alkilację, inkubować każdy kawałek żelu z 200 μl 10 mM naziemnej telewizji cyfrowej w 25 mM wodorowęglanie amonu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj kawałki żelu w 200 μl 25 mM wodorowęglanu amonu, a następnie odwodnić 200 μl 100% acetonitrylu przez 10 minut.</li>
	<li>Białka trawić przez noc w temperaturze 37 °C za pomocą mieszanki trypsyny/Lys-C zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Ekstrahuj powstałe peptydy z kawałków żelu, dodając 50 μl 50% acetonitrylu przez 15 minut, następnie 50 μl 5% kwasu mrówkowego przez 15 minut, a na koniec 50 μl 100% acetonitrylu przez 15 min. Połącz i wysusz każdą frakcję w probówkach o niskiej absorpcji, aby ograniczyć adsorpcję peptydów i utratę próbki. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>
8. Ekstrakcja białka i trawienie w roztworze (Protokół 2)
<ol>
	<li>Przeprowadzić lizę komórek (2 x 106 komórek) za pomocą 150 μl następującego buforu do lizy:
	<ol>
		<li>7 M mocznik, 2 M tiomocznik, 40 mM Tris i 4% CHAPS, uzupełnione inhibitorami proteazy (kompletny mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizować roztwory przez 30 minut w temperaturze pokojowej za pomocą termoshakera. Odwirować przy 13 800 x g przez 20 min RT i zachować supernatant.</li>
	<li>Usuń zanieczyszczenia za pomocą zestawu do czyszczenia 2D:
	<ol>
		<li>Zestaw zawiera roztwór strącający, roztwór współstrącający, bufor do płukania i dodatek do mycia.</li>
		<li>Dodać 300 μl roztworu strącającego i dobrze wymieszać. Inkubować na lodzie przez 15 minut. Dodać 300 μl roztworu współstrącającego. Odwirować probówki (co najmniej) o masie 12 000 x g przez 5 minut. Powinna być widoczna mała granulka. Przejdź szybko do następnego kroku, aby uniknąć ponownego zawieszenia lub dyspersji granulki. Usunąć supernatant bez naruszania osadu.</li>
		<li>Ponownie odwirować probówki z zawiasem nasadki i granulką skierowaną na zewnątrz, aby sprowadzić pozostały płyn na dno probówki. Wystarczy krótki impuls. W probówkach nie powinien pozostać żaden widoczny płyn.</li>
		<li>Nie naruszając osadu, dodać 40 μl roztworu współstrącającego. Pozostaw probówkę na lodzie na 5 minut. Wirować przez 5 minut, a następnie wyjąć i wyrzucić mycie. Dodać 25 μl wody dejonizowanej. Wiruj każdą rurkę przez 5-10 s. Granulki powinny się rozproszyć, ale nie rozpuszczać się w wodzie.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu do płukania (wstępnie schłodzonego przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -20°C) i 5 μl dodatku do mycia. Wirować, aż granulka zostanie całkowicie zdyspergowana. Inkubować probówki w temperaturze -20°C przez co najmniej 30 minut. Wiruj przez 20-30 s co 10 min 
		UWAGA: Probówki można przechowywać w temperaturze -20°C przez okres do 1 tygodnia przy minimalnej degradacji lub modyfikacji białka.</li>
		<li>Odwirować probówki (co najmniej) o masie 12 000 × g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powinna być widoczna biała granulka. Pozostaw pellet do wyschnięcia na powietrzu nie dłużej niż 5 minut (jeśli pellet jest zbyt suchy, trudno będzie go ponownie zawiesić).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić osad białkowy w 300 μl 8 M mocznika i 0,1 M wodorowęglanu amonu. Mocno wirować przez 1 min. Określ stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego.</li>
</ol>
9. Trawienie w roztworze (Protokół 2)
<ol>
	<li>Zredukować mostki dwusiarczkowe przez dodanie 5,1 μl wodnego roztworu DTT o stężeniu 700 mM (stężenie końcowe 12,5 mM) do zawieszonych białek z kroku 8.4 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut za pomocą termoshakera. Reszty alkilatowo-cysteinowe przez dodanie 20,3 μl wodnego roztworu jodoacetamidu o stężeniu 700 mM (stężenie końcowe 40 mM) i inkubację w temperaturze 25°C przez 30 minut w ciemności za pomocą termoshakera.</li>
	<li>Dodać 990 μl 0,1 M wodorowęglanu amonu do próbki. Dodać odpowiednią objętość mieszanki trypsyny/Lys-C (stosunek enzym do substratu 1:100 w/w). Inkubować w temperaturze 37°C przez noc za pomocą termoshakera.</li>
</ol>
10. Kaseta czyszcząca (Protokół 2)
<ol>
	<li>Zwilżyć wkład 1 objętością kolumny (1 ml) metanolu. Wyczyść wkład 1 objętością kolumny (1 ml) 80% acetonitrylu/wody klasy HPLC i wyrzuć przepływ. Zrównoważyć wkład z 4 objętościami kolumny (4 ml) 0,1% kwasu mrówkowego/wody klasy HPLC i odrzucić przepływ</li>.
	<li>Zakwasić próbki 90 μl 10% kwasu mrówkowego lub wodą do pH 2-3 (sprawdzić pH za pomocą wskaźnika pH). Załadować zakwaszone próbki i zebrać przepływ. Ponownie załaduj przepływowy (zawierający niezatrzymane peptydy). Umyj wkład 6 objętościami kolumn (6 ml) 0,1% kwasu mrówkowego/wody klasy HPLC.</li>
	<li>Elute peptydy z wkładu z 1 objętością kolumny (1 ml) 0,1% kwasu mrówkowego/50% acetonitrylu/wody klasy HPLC. Przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zagęścić próbkę za pomocą koncentratora próżniowego (150 x g, próżnia przy ciśnieniu 160 mBar).</li>
</ol>
11. Frakcjonowanie przez ogniskowanie izoelektryczne (Protokół 2)
UWAGA: Peptydy są rozdzielane według ich punktów izoelektrycznych za pomocą frakcjonatora off-gel na 13 cm pasku pokrywającym zakres pH od 3 do 10. Skorzystaliśmy z następującego protokołu dostarczonego przez dostawcę (podsumowanego poniżej):
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory: roztwór A (600 μl roztworu glicerolu, 60 μl buforu OFFGEL, 4,34 ml wody ultraczystej) i roztwór B (1,776 ml roztworu A i 444 μl wody ultraczystej).</li>
	<li>Zmontuj paski, ramki i elektrody IPG zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zawiesić próbkę w 1,8 ml roztworu B. Dodać 40 μl roztworu B do każdej studzienki. Załadować 150 μl próbki do każdego dołka.</li>
	<li>Wybierz domyślną metodę dla peptydów: OG12PE00 (domyślna metoda OFFGEL dla peptydów do stosowania z zestawem 3100 OFFGEL Low Res Kit, pH 3-10, ramki 12-dołkowe. Poczekaj, aż ta metoda zostanie zakończona (~20 godzin). Zbierz frakcje w odpowiednio oznakowanych tubach.</li>
</ol>
12. Porządkowanie kolumny aparatury Harvarda Odwrócony C18 Post-IEF (Protokół 2)
<ol>
	<li>Stopniowo dodawaj po kilka μl jednorazowo 1% TFA w wodzie dejonizowanej do każdej frakcji w celu zakwaszenia próbki. Sprawdź za pomocą papieru pH, czy pH wynosi około 3 lub mniej.</li>
	<li>Przygotuj następujące roztwory: roztwór 1 (5 ml acetonitrylu, 10 μl kwasu mrówkowego, 4,99 ml wody ultraczystej) i roztwór 2 (0,5 ml acetonitrylu, 10 μl kwasu mrówkowego, 9,49 ml wody ultraczystej).</li>
	<li>Wstępnie zwilżyć kolumnę wirową 150 μl roztworu 1. Wirować przez 90 s przy 750 x g i odrzucić przepływ. Przemyć kolumnę wirową 150 μl roztworu 2. Wirować przez 90 s przy 750 x g i odrzucić przepływ.</li>
	<li>Przepuść ułamek przez kolumnę. Wirować przez 90 s przy 750 x g i odrzucić przepływ. Przemyć 150 μl roztworu 2. Wirować przez 90 s przy 750 x g i odrzucić przepływ.</li>
	<li>Eluować frakcję za pomocą 50 μl roztworu 1. Wirować przez 90 s przy 750 x g. Powtórz te kroki jeszcze raz.</li>
	<li>Suchą frakcję za pomocą koncentratora próżniowego (150 x g, próżnia 160 mBar) i przechowywać w temperaturze -80°C</li>
</ol>
13. Analiza danych proteomicznych i bioinformatyki18
<ol>
	<li>Analizuj dane uzyskane przez spektrometr masowy nano-LC MS/MS za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji, takiego jak MaxQuant (wersja 1.5.2.8) i wyszukiwarki Andromeda.</li>
	<li>Ustaw współczynnik fałszywych odkryć (FDR) na 1% zarówno dla białek, jak i peptydów oraz minimalną długość 7 aminokwasów. Ustaw swoistość enzymu jako C-koniec na Arg i Lys. Pozwól na 2 pominięte rozszczepienia na wiązaniach prolinowych. Wybierz karbamidometylację cysteiny jako ustaloną modyfikację oraz N-końcową acetylację białek i utlenianie metioniny jako modyfikacje zmienne.</li>
	<li>Kontynuuj analizę danych za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Przeprowadź analizę wzbogacenia funkcjonalnego za pomocą oprogramowania FunRich (www.funrich.org/). Wykonaj analizę wzbogacenia ontologii genów za pomocą oprogramowania DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).</li>
</ol>

<ol><li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+biology+perspective+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders%3A+functions+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li>
<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li>
<li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li>
<li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+morphological%2C+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li>
<li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li>
<li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926(2013).</li>
<li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction%2C+termed+MaxLFQ%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li>
<li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li>
<li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informed-Proteomics%3A+open-source+software+package+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li>
<li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li>
<li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ponieważ proteomika jest potężnym narzędziem do badania ekspresji różnych białek z całej komórki lub przedziałów subkomórkowych, optymalizacja protokołu lizy komórek i trawienia białek była przedmiotem wielu badań. Istnieją trzy główne klasy metod, które obejmują trawienie w żelu (trawienie białek w matrycy żelu poliakrylamidowego)17, trawienie w roztworze18 i przygotowywanie próbek wspomagane filtrem19. Doniesiono, że ta ostatnia metoda, początkowo ...

Makrofagi to wrodzone komórki odpornościowe zaangażowane w szereg funkcji fizjologicznych, począwszy od reakcji na zakaźne patogeny, a skończywszy na homeostazie tkanek, w tym usuwaniu komórek apoptotycznych i przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej1. Komórki te charakteryzują się silną plastycznością fenotypową2, co przekłada się na wiele możliwych stanów aktywacji, które nazywane są również polaryzacjami. Dokładny molekularny opis tych różnych polaryzacji jest priorytetem w dziedzinie biologii makrofagów3. Zaproponowano klasyfikację tych polaryzacji za pomocą tzw. dychotomii M1/M2, w której M1 reprezentuje makrofagi prozapalne, a M2 przeciwzapalne. Ten model dobrze pasuje do różnych sytuacji patologicznych, takich jak ostre infekcje, alergie i otyłość4. Jednak w przypadku tkanek z przewlekłym stanem zapalnym i nowotworami wykazano, że ta klasyfikacja nie jest w stanie uchwycić szerokiego repertuaru fenotypowego, który makrofagi występują w określonych środowiskach komórkowych5,6,7. Obecny konsensus jest taki, że polaryzacja makrofagów jest lepiej opisana za pomocą wielowymiarowego modelu do integracji określonych sygnałów mikrośrodowiskowych8. Wniosek ten został potwierdzony przez analizę transkryptomiczną ludzkich makrofagów, która wykazała, że model M1/M2 jest nieefektywny w opisywaniu uzyskanych polaryzacji9.
Przedstawione badanie ma na celu dostarczenie protokołu do uzyskania proteomicznych sygnatur różnych polaryzacji u ludzkich makrofagów. Opisujemy, jak różnicować ludzkie makrofagi w środowiskach o różnych poziomach tlenu i uzyskiwać peptydy z całego proteomu makrofagów w celu przeprowadzenia kwantyfikacji bez znaczników. Ta kwantyfikacja pozwala na porównanie poziomów ekspresji różnych białek. Ponieważ badania nad komórkami macierzystymi ujawniły znaczenie tlenu jako kluczowego parametru środowiskowego10, staramy się zrozumieć, w jaki sposób ten parametr tkankowy może wpływać na polaryzację makrofagów u ludzi. Stwierdzono, że ciśnienie parcjalne tlenu waha się od 3 do 20% (całkowitego ciśnienia atmosferycznego) w ludzkim ciele, gdzie 20% odpowiada mniej więcej temu, co jest powszechnie stosowane w inkubatorze do hodowli komórkowych (dokładna wartość wynosi około 18,6%, biorąc pod uwagę obecność wody).
Poprzednie prace wykazały, że pęcherzyki płucne różnią się od makrofagów śródmiąższowych z funkcjonalnego i morfologicznego punktu widzenia11 i że te różnice są prawdopodobnie częściowo spowodowane różnymi poziomami tlenu, na które są narażone12. Co więcej, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego wykazują zwiększoną zdolność do fagocytyzacji bakterii po wystawieniu na działanie środowiska o niskiej zawartości tlenu12. Odwrotny efekt stwierdzono w przypadku ludzkich makrofagów zróżnicowanych pod kątem THP113, ale wyniki te wspierają ideę, że tlen jest regulatorem biologii makrofagów i że konieczne jest wyjaśnienie tej roli na poziomie molekularnym w ludzkich makrofagach. W poprzednim badaniu zastosowaliśmy podejście proteomiczne, aby rozwiązać te problemy. Mierząc poziomy ekspresji tysięcy białek jednocześnie, podkreśliliśmy wpływ tlenu na polaryzację i dostarczyliśmy listę nowych markerów molekularnych. Udało nam się również odnieść te odkrycia do niektórych funkcji makrofagów. Warto zauważyć, że szybkość fagocytozy komórek apoptotycznych była zwiększona w makrofagach spolaryzowanych IL4 / IL13, co było związane z regulacją w górę ALOX15, jak ujawniono w analizie proteomicznej14. W niniejszym opracowaniu opisujemy, w jaki sposób przeprowadzić taką analizę.

<table><tbody><tr><td>Stacja robocza do hipoksji</td><td>Oxford Optronix</td><td>Hypoxylab</td><td></td></tr><tr><td>C6 Cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6435</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (FA)</td><td>ARISTAR</td><td>450122M</td><td></td></tr><tr><td>R-250 Coomassie niebieski</td><td>Biorad</td><td>1,610,436</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd, E.Coli (LPS)</td><td>Zestaw</td> do czyszczenia 2D Calbiochem <td>437627</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 podłoże, suplement glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (NEAA) 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna aparatury Harvard Odwrócona kolumna mikrospinowa C18</td><td>Aparatura Harvard</td><td>74-4601</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Zainstaluj</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-tris 4-12%</td><td>Life Technologies SAS</td><td>NP0321 BOX</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Mikrokulki ludzkie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna separacyjna MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina 4 (IL4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-917</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina 13 (IL13)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-410</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma (INF&gamma;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-482</td><td></td></tr><tr><td>CD14-FITC (klon T&Uuml; K4)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Pierce</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka trypsyny/Lys-C</td><td>PROMEGA</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór gradientu gęstości ( Histopaque 1077)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7089-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Surowica ludzka z ludzkiego męskiego osocza AB (SAB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 30%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trisma-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>114405</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylowy siarczan sodu (SDS) 20%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34888</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Tiomocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania mikro BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>5 ml sterylna pipeta plastikowa</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C Eppendorf</td><td>VWR</td><td>460-0223</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 wkłady z odwróconą fazą, 100 mg</td><td>wody</td><td>WAT036820</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Makrofagi to wrodzone komórki odpornościowe zaangażowane w szereg funkcji fizjologicznych, począwszy od reakcji na zakaźne patogeny, a skończywszy na homeostazie tkanek. Różne funkcje tych komórek są związane z ich stanami aktywacji, co nazywa się również polaryzacją. Dokładny opis molekularny tych różnych polaryzacji jest priorytetem w dziedzinie biologii makrofagów. Obecnie uznaje się, że konieczne jest wielowymiarowe podejście do opisania, w jaki sposób polaryzacja jest kontrolowana przez sygnały środowiskowe. W tym raporcie opisujemy protokół mający na celu uzyskanie proteomicznej sygnatury różnych polaryzacji w ludzkich makrofagach. Protokół ten opiera się na bezznacznikowej kwantyfikacji ekspresji białka makrofagów uzyskanej z frakcjonowanej w żelu i trawionej Lys C/trypsyny zawartości lizy komórkowej. Udostępniamy również protokół oparty na trawieniu w roztworze i frakcjonowaniu izoelektrycznym do wykorzystania jako alternatywa. Ponieważ stężenie tlenu jest istotnym parametrem środowiskowym w tkankach, używamy tego protokołu do zbadania, w jaki sposób skład atmosfery lub środowisko o niskim poziomie tlenu wpływa na klasyfikację polaryzacji makrofagów.

Wychodząc od mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs) otrzymanych poprzez wirowanie różnicowe, protokół umożliwia uzyskanie populacji monocytów CD14+ o czystości ocenionej metodą cytometrii przepływowej na ponad 98% (Rysunek 1). Monocyty te są następnie różnicowane w kierunku różnych polaryzacji (Rysunek 2). W przypadku wyboru frakcjonowania na żelu, migrację w żelach SDS-PAGE dostosowuje się tak, aby uzyskać poż...

Przedstawiamy protokół uzyskiwania sygnatur proteomicznych ludzkich makrofagów i stosowania go do określania wpływu środowiska o niskiej zawartości tlenu na polaryzację makrofagów.

Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii makrofagów, takie jak jak scharakteryzowanie stanu aktywacji w różnych środowiskach na poziomie białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona możliwość uzyskania różnej ekspresji wielu białek w ludzkich makrofagach przy użyciu metody kwantyfikacji bez znaczników. Procedurę zademonstrują Marie Malier i Magali Court z mojego laboratorium.Na początek dodaj 15 mililitrów roztworu do separacji komórek z gradientem gęstości do każdej z dwóch 50-mililitrowych probówek wirówek, aby roztwór mógł ogrzać się do temperatury pokojowej przed otrzymaniem LRSC. Jest to niezbędne, ponieważ gęstość zależy od temperatury. Opróżnij LRSC do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Dodaj 1x PBS do 50 mililitrów i wymieszaj. Następnie, bardzo powoli, dodaj 25 mililitrów mieszanki na wierzch 15 mililitrów roztworu o zrównoważonym gradiencie gęstości. Uważaj, aby nie wymieszać faz na tym etapie.Krew musi być dodana do roztworu gradientu gęstości bez jakiegokolwiek zakłócenia tej fazy. Odwirować obie probówki wirówkowe przez 25 minut przy sile 700 G bez przerw. Pod koniec wirowania w gradiacji gęstości warstwy od dołu do góry to erytrocyty i granulocyty, tworzące osad, fazę roztworu gradientu gęstości, warstwę PBMC i rozcieńczone osocze.Za pomocą pipety przepuścić przez fazę plazmy bez jej zasysania. Następnie zbierz warstwę PBMC do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj do 50 mililitrów 1x PBS do PBMC jako zestawu do mycia i wiruj przez 10 minut przy 300 G. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 mililitrach pożywki makrofagowej.Po umieszczeniu PBMC w komorze Malasseza, przenieś ilość PBMC niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu do probówki wirówkowej. Odwirować komórki przez 10 minut przy stężeniu 300 G. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 mikrolitrach buforu sortującego na 10 milionów PBMC. Następnie dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek CD14 na 10 milionów PBMC.Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza pod ciągłym mieszaniem. Po inkubacji dodać jeden mililitr buforu sortującego na 10 milionów PBMC jako etap płukania i odwirować jak poprzednio. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu sortującego na 100 milionów PBMC.Teraz umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora. Przygotować kolumnę, przepłukując ją trzema mililitrami buforu sortującego. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę.Następnie zbierz przepływ przez zawierające nieoznakowane komórki do późniejszego barwienia, jeśli to konieczne. Przemyć kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami buforu sortującego. Uważaj, aby nie wysuszyć kolumny.Następnie umieść rurkę zbiorczą pod kolumną i wyjmij ją z separatora. Po przepłukaniu odpipetować pięć mililitrów buforu sortującego do kolumny. Natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane ogniwa, mocno wciskając tłok do kolumny.Na koniec powtórz te kroki z nową kolumną przed posiewem monocytów i wykonaniem polaryzacji makrofagów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Utrzymuj monocyty i makrofagi w środowisku kontrolowanym tlenem, aby przeprowadzić analizę warunków niedotlenienia. Użyj stacji roboczej do hipoksji, aby utrzymać komórki pod pożądanym ciśnieniem parcjalnym tlenu podczas eksperymentu.Podczas pracy pod niskim ciśnieniem tlenu ważne jest, aby przygotować wszystkie media i myjące pod stacją i odczekać wystarczająco dużo, aby uzyskać prawidłowe ciśnienie parcjalne w cieczy. Przeprowadź lizę komórek w buforze pod przystosowanym kapturem. Załaduj białkowy odpowiednik 300 000 komórek dla każdej próbki na 4-12% bis-tris żele akrylamidowe.Kontroluj czas trwania migracji elektroforetycznej, aby umożliwić każdej próbce białka rozdzielenie się na sześć pasm żelowych, jak pokazano tutaj. Po utrwaleniu i wybarwieniu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy wyciąć prążki białkowe czystym skalpelem. Pokrój w kostkę każdą wyciętą prążek przed umieszczeniem jej w probówkach o pojemności 500 mikrolitrów.Teraz umyj plastry żelu trzy razy w 200 mikrolitrach 25-milimolowego wodorowęglanu amonu przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odrzucając wodorowęglan amonu między każdym krokiem. Następnie wykonaj jedno pranie w 25-milimolowym wodorowęglanie amonu i acetonitrylu. Następnie odwodnić kawałki żelu 200 mikrolitrami 100% acetonitrylu przez 10 minut.Inkubować każdy kawałek żelu z 10-milimolowym wodorowęglanem cyfrowym i 25-milimolowym wodorowęglanem amonu przez 45 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć DTT i inkubuj kawałek żelu z 55-milimolowym jodoacetamidem w 25-milimolowym wodorowęglanie amonu przez 35 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać alkilację, wyrzuć zużyty roztwór i inkubuj każdy kawałek żelu z 200 mikrolitrami 10 milimolowego DTT w 25 milimolowym wodorowęglanie amonu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Umyj kawałki żelu w 200 mikrolitrach 25-milimolowego wodorowęglanu amonu. Następnie odwodnić 200 mikrolitrami 100% acetonitrylu przez 10 minut. Białka trawić przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszanki trypsyny/Lys-C zgodnie z instrukcjami producenta.Wyekstrahuj powstałe peptydy z kawałków żelu, dodając 50 mikrolitrów 50% acetonitrylu przez 15 minut w probówkach o niskiej absorpcji. Po dodaniu 50 mikrolitrów 5% kwasu mrówkowego przez 15 minut, dodaj 50 mikrolitrów 100% acetonitrylu na 15 minut. Wyciągnij i wysusz każdą frakcję w probówkach o niskiej absorpcji, aby ograniczyć wchłanianie peptydów i utratę próbki.Próbki należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pokazano tutaj reprezentatywną czystość ocenianą za pomocą cytometrii przepływowej po selekcji kulek magnetycznych monocytów CD14-dodatnich. Obrazowanie z kontrastem fazowym zróżnicowanych ludzkich makrofagów wykazuje niejednorodność uzyskanych morfologii dla dwóch różnych polaryzacji po dziewięciu dniach hodowli.Pokazano przykład trawienia poza żelem przy użyciu zabarwionych srebrem żeli SDS. Ocena białka z lizy komórkowej i po trawieniu w roztworze wykazuje brak degradacji podczas lizy i efektywność trawienia. Pokazano tutaj przykład widma dysocjacji wywołanego zderzeniem peptydu znajdującego się przy stosunku masy do ładunku 597,29 w widmie MS z ładunkiem elektrycznym dodatnim dwa.Na podstawie tego widma wyznaczono odpowiednią sekwencję. Końcowym wynikiem po analizie jest mapa cieplna reprezentująca hierarchiczne grupowanie wszystkich stanów polaryzacji przy użyciu białek o zróżnicowanej ekspresji. Analiza ujawnia klaster białek o nadmiernej ekspresji we wszystkich polaryzacjach w warunkach 3%tlenu.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że najpierw należy zdecydować, jaki rodzaj frakcjonowania zostanie przeprowadzony na nowych próbkach, aby odpowiednio dostosować swój protokół. Podejście proteomiczne wykorzystujące tę pracę jest komplementarne z podejściami genomicznymi, które były stosowane w ostatnich latach w dziedzinie badań polaryzacji biologii makrofagów. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do badania różnych stanów aktywacji komórek odpornościowych u ludzi, a także u innych ssaków.Nie zapominaj, że praca z naziemną telewizją cyfrową może być niebezpieczna, więc aby wykonać tę procedurę, musisz pracować pod przystosowanym kapturem.

proteomic-analysis-human-macrophage-polarization-under-low-oxygen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Makrofagi są kluczowymi komórkami zaangażowanymi w patogeniczność gospodarza. Makrofagi wykazują różnorodność fenotypową i funkcjonalną, którą można analizować i wykrywać za pomocą analizy proteomicznej. W artykule opisano, jak przeprowadzić elektroforezę 2D pierwotnych kultur ludzkich makrofagów zróżnicowanych do fenotypu M1 lub M2.

Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Ten protokół pozwala badaczowi na wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów rezydujących w tkankach w różnych charakterystycznych tkankach objętych stanem zapalnym, pobranych z modeli zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą.

Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół dostarcza metodę badania zakażenia Mycobacterium tuberculosis w ludzkich makrofagach spolaryzowanych M1 lub M2 w oparciu o różnicowanie monocytów krwi obwodowej do komórek podobnych do makrofagów, które są zakażone znakowanym przez GFP wirulentnym szczepem H37Rv, i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu 10-kolorowego panelu, w tym ekspresji wybranych markerów M1/M2.

Polaryzacja ludzkich komórek pochodzących z monocytów M1 i M2 oraz analiza za pomocą cytometrii przepływowej po zakażeniu Mycobacterium tuberculosis

Makrofagi podobne do M2 związane z nowotworami (TAM) są związane z progresją guza i złym rokowaniem w raku. Protokół ten służy jako szczegółowy przewodnik do powtarzalnego różnicowania i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w makrofagi podobne do M2 w ciągu 14 dni. Model ten jest podstawą do badania przeciwzapalnego działania TAM w mikrośrodowisku guza.

Różnicowanie i polaryzacja makrofagów do fenotypu podobnego do M2 przy użyciu ludzkiej linii komórkowej białaczki THP-1 podobnej do monocytów

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Poznaj metodę analizy proteomicznej polaryzacji ludzkich makrofagów w warunkach niedotlenienia. Technika umożliwia charakteryzację stanów aktywacji na poziomie białek bez znakowania.

Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Przeglądaj więcej filmów