Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii makrofagów, takie jak jak scharakteryzowanie stanu aktywacji w różnych środowiskach na poziomie białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona możliwość uzyskania różnej ekspresji wielu białek w ludzkich makrofagach przy użyciu metody kwantyfikacji bez znaczników. Procedurę zademonstrują Marie Malier i Magali Court z mojego laboratorium.

Na początek dodaj 15 mililitrów roztworu do separacji komórek z gradientem gęstości do każdej z dwóch 50-mililitrowych probówek wirówek, aby roztwór mógł ogrzać się do temperatury pokojowej przed otrzymaniem LRSC. Jest to niezbędne, ponieważ gęstość zależy od temperatury. Opróżnij LRSC do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Dodaj 1x PBS do 50 mililitrów i wymieszaj. Następnie, bardzo powoli, dodaj 25 mililitrów mieszanki na wierzch 15 mililitrów roztworu o zrównoważonym gradiencie gęstości. Uważaj, aby nie wymieszać faz na tym etapie.

Krew musi być dodana do roztworu gradientu gęstości bez jakiegokolwiek zakłócenia tej fazy. Odwirować obie probówki wirówkowe przez 25 minut przy sile 700 G bez przerw. Pod koniec wirowania w gradiacji gęstości warstwy od dołu do góry to erytrocyty i granulocyty, tworzące osad, fazę roztworu gradientu gęstości, warstwę PBMC i rozcieńczone osocze.

Za pomocą pipety przepuścić przez fazę plazmy bez jej zasysania. Następnie zbierz warstwę PBMC do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj do 50 mililitrów 1x PBS do PBMC jako zestawu do mycia i wiruj przez 10 minut przy 300 G. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 mililitrach pożywki makrofagowej.

Po umieszczeniu PBMC w komorze Malasseza, przenieś ilość PBMC niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu do probówki wirówkowej. Odwirować komórki przez 10 minut przy stężeniu 300 G. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 mikrolitrach buforu sortującego na 10 milionów PBMC. Następnie dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek CD14 na 10 milionów PBMC.

Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza pod ciągłym mieszaniem. Po inkubacji dodać jeden mililitr buforu sortującego na 10 milionów PBMC jako etap płukania i odwirować jak poprzednio. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu sortującego na 100 milionów PBMC.

Teraz umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora. Przygotować kolumnę, przepłukując ją trzema mililitrami buforu sortującego. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę.

Następnie zbierz przepływ przez zawierające nieoznakowane komórki do późniejszego barwienia, jeśli to konieczne. Przemyć kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami buforu sortującego. Uważaj, aby nie wysuszyć kolumny.

Następnie umieść rurkę zbiorczą pod kolumną i wyjmij ją z separatora. Po przepłukaniu odpipetować pięć mililitrów buforu sortującego do kolumny. Natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane ogniwa, mocno wciskając tłok do kolumny.

Na koniec powtórz te kroki z nową kolumną przed posiewem monocytów i wykonaniem polaryzacji makrofagów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Utrzymuj monocyty i makrofagi w środowisku kontrolowanym tlenem, aby przeprowadzić analizę warunków niedotlenienia. Użyj stacji roboczej do hipoksji, aby utrzymać komórki pod pożądanym ciśnieniem parcjalnym tlenu podczas eksperymentu.

Podczas pracy pod niskim ciśnieniem tlenu ważne jest, aby przygotować wszystkie media i myjące pod stacją i odczekać wystarczająco dużo, aby uzyskać prawidłowe ciśnienie parcjalne w cieczy. Przeprowadź lizę komórek w buforze pod przystosowanym kapturem. Załaduj białkowy odpowiednik 300 000 komórek dla każdej próbki na 4-12% bis-tris żele akrylamidowe.

Kontroluj czas trwania migracji elektroforetycznej, aby umożliwić każdej próbce białka rozdzielenie się na sześć pasm żelowych, jak pokazano tutaj. Po utrwaleniu i wybarwieniu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy wyciąć prążki białkowe czystym skalpelem. Pokrój w kostkę każdą wyciętą prążek przed umieszczeniem jej w probówkach o pojemności 500 mikrolitrów.

Teraz umyj plastry żelu trzy razy w 200 mikrolitrach 25-milimolowego wodorowęglanu amonu przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odrzucając wodorowęglan amonu między każdym krokiem. Następnie wykonaj jedno pranie w 25-milimolowym wodorowęglanie amonu i acetonitrylu. Następnie odwodnić kawałki żelu 200 mikrolitrami 100% acetonitrylu przez 10 minut.

Inkubować każdy kawałek żelu z 10-milimolowym wodorowęglanem cyfrowym i 25-milimolowym wodorowęglanem amonu przez 45 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć DTT i inkubuj kawałek żelu z 55-milimolowym jodoacetamidem w 25-milimolowym wodorowęglanie amonu przez 35 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać alkilację, wyrzuć zużyty roztwór i inkubuj każdy kawałek żelu z 200 mikrolitrami 10 milimolowego DTT w 25 milimolowym wodorowęglanie amonu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Umyj kawałki żelu w 200 mikrolitrach 25-milimolowego wodorowęglanu amonu. Następnie odwodnić 200 mikrolitrami 100% acetonitrylu przez 10 minut. Białka trawić przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszanki trypsyny/Lys-C zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyekstrahuj powstałe peptydy z kawałków żelu, dodając 50 mikrolitrów 50% acetonitrylu przez 15 minut w probówkach o niskiej absorpcji. Po dodaniu 50 mikrolitrów 5% kwasu mrówkowego przez 15 minut, dodaj 50 mikrolitrów 100% acetonitrylu na 15 minut. Wyciągnij i wysusz każdą frakcję w probówkach o niskiej absorpcji, aby ograniczyć wchłanianie peptydów i utratę próbki.

Próbki należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pokazano tutaj reprezentatywną czystość ocenianą za pomocą cytometrii przepływowej po selekcji kulek magnetycznych monocytów CD14-dodatnich. Obrazowanie z kontrastem fazowym zróżnicowanych ludzkich makrofagów wykazuje niejednorodność uzyskanych morfologii dla dwóch różnych polaryzacji po dziewięciu dniach hodowli.

Pokazano przykład trawienia poza żelem przy użyciu zabarwionych srebrem żeli SDS. Ocena białka z lizy komórkowej i po trawieniu w roztworze wykazuje brak degradacji podczas lizy i efektywność trawienia. Pokazano tutaj przykład widma dysocjacji wywołanego zderzeniem peptydu znajdującego się przy stosunku masy do ładunku 597,29 w widmie MS z ładunkiem elektrycznym dodatnim dwa.

Na podstawie tego widma wyznaczono odpowiednią sekwencję. Końcowym wynikiem po analizie jest mapa cieplna reprezentująca hierarchiczne grupowanie wszystkich stanów polaryzacji przy użyciu białek o zróżnicowanej ekspresji. Analiza ujawnia klaster białek o nadmiernej ekspresji we wszystkich polaryzacjach w warunkach 3%tlenu.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że najpierw należy zdecydować, jaki rodzaj frakcjonowania zostanie przeprowadzony na nowych próbkach, aby odpowiednio dostosować swój protokół. Podejście proteomiczne wykorzystujące tę pracę jest komplementarne z podejściami genomicznymi, które były stosowane w ostatnich latach w dziedzinie badań polaryzacji biologii makrofagów. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do badania różnych stanów aktywacji komórek odpornościowych u ludzi, a także u innych ssaków.

Nie zapominaj, że praca z naziemną telewizją cyfrową może być niebezpieczna, więc aby wykonać tę procedurę, musisz pracować pod przystosowanym kapturem.