Name: Wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (FRET) nlsGPS1 Förster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Odkryj metodę wizualizacji poziomów gibereliny w tkankach roślinnych Arabidopsis za pomocą biosensora FRET nlsGPS1. Technika ta umożliwia badanie dynamiki fitohormonów z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca otrzymała dofinansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 759282).

<ol><li>Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellin+Localization+and+Transport+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Gibberellin Localization and Transport in Plants.</a> Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).</li>
<li>Sun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellin+Metabolism%2C+Perception+and+Signaling+Pathways+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis.</a> The Arabidopsis Book. 6, 0103(2008).</li>
<li>Rieu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Analysis+Reveals+That+C19-GA+2-Oxidation+Is+a+Major+Gibberellin+Inactivation+Pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).</li>
<li>Regnault, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellin+precursor+GA12+acts+as+a+long-distance+growth+signal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis.</a> Nature Plants. 1, 15073(2015).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors.</a> Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).</li>
<li>Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Biosensors+in+Plants%3A+Pathways+to+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery.</a> Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).</li>
<li>Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gibberellin+gradients+visualized+in+rapidly+elongating+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues.</a> Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+pairings+and+detection+conditions+for+measurement+of+FRET+between+cyan+and+yellow+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins.</a> Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).</li>
<li>Ueguchi-Tanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GIBBERELLIN+INSENSITIVE+DWARF1+encodes+a+soluble+receptor+for+gibberellin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin.</a> Nature. 437, 693-698 (2005).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Fluorescence+Imaging+of+Arabidopsis+Root+Growth+with+Rapid+Manipulation+of+The+Root+Environment+Using+The+RootChip%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 34290(2012).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li>
<li>Brunoud, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+sensor+to+map+auxin+response+and+distribution+at+high+spatio-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution.</a> Nature. 482, 103-106 (2012).</li>
<li>Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GUS+reporter-aided+analysis+of+the+promoter+activities+of+Arabidopsis+ACC+synthase+genes+AtACS4%2C+AtACS5%2C+and+AtACS7+induced+by+hormones+and+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses.</a> Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).</li>
<li>Alabadi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellins+Repress+Photomorphogenesis+in+Darkness%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness.</a> Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).</li>
<li>De Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+framework+for+light+and+gibberellin+control+of+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation.</a> Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).</li>
<li>Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+life+without+phytochromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana life without phytochromes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+development+by+light+and+gibberellins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins.</a> Nature. 451, 475-479 (2008).</li>
<li>Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+Ca2%2B%2C+redox+status%2C+ROS+and+pH+using+GFP+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors.</a> Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).</li>
<li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cytosolic+zinc+in+Arabidopsis+roots+combining+FRET+sensors+and+RootChip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology.</a> New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).</li>
<li>Krebs, M., Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+cytoplasmic+and+nuclear+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots.</a> Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oparty na FRET bioczujnik GA nlsGPS1 zapewnia ilościową metodę raportowania i pomiaru gradientów hormonu GA w roślinach wielokomórkowych. Bioczujniki oparte na FRET mogą określać ilościowo dynamikę z lepszą rozdzielczością czasoprzestrzenną w porównaniu z bezpośrednim wykrywaniem za pomocą spektrometrii mas i pomiarem pośrednim za pomocą reporterów transkrypcyjnych lub metod opartych na degradacji białek sygnałowych12,13. Obrazowanie komórkowe w wysokiej rozdzielczości w różnych typach tkanek może dostarczyć znaczącego wglądu w biologię GA i zainicjować nowe hipotezy dotyczące regulacji i funkcji akumulacji GA w kontekście wielokomórkowym. Na przykład monitorowanie zmian w biosensorze nlsGPS1 w określonych mutantach biosyntetycznych, katabolicznych i transportowych GA, a także podczas perturbacji wywołanych czasoprzestrzennie, może być bardzo pouczające w celu zbadania, w jaki sposób gradienty GA są ustalane w korzeniu i dotyczą odpowiedzi komórek korzenia na gradienty GA. Czujnik może być wykorzystany w innych modelach i gatunkach roślin uprawnych do testowania zachowania mechanizmów, które kontrolują kontrolę kiełkowania nasion, wydłużania komórek i kwitnienia za pośrednictwem GA.
Kluczowe etapy obrazowania biosensora nlsGPS1 w oparciu o FRET są następujące: 1) piksele nie powinny być nasycone podczas ilościowej analizy FRET, 2) parametry obrazowania, takie jak "wzmocnienie detektora", powinny być utrzymywane na stałym poziomie dla akwizycji emisji donorowej (DxDm) i emisji akceptorowej (DxAm), 3) należy użyć kontrolnych linii nlsGPS1-NR w celu wykluczenia artefaktów, oraz 4) próbki powinny być przygotowane w celu zminimalizowania problemów z dryftem i zmianą ogniskowej. Ponadto warunki środowiskowe, w których próbki są hodowane, są ważne do kontrolowania, ponieważ poziomy GA są wrażliwe na warunki środowiskowe, takie jak czas trwania światła i natężenie światła 14,15,16,17. Kluczowym ograniczeniem tego typu analizy jest to, że do obrazowania wymagany jest wysoki stosunek sygnału do szumu ze względu na wzrost szumu nieodłącznie związany z obrazowaniem ratiometrycznym. W związku z tym obrazowanie nlsGPS1 nie będzie przydatne w przypadku tkanek i narządów, które nie są podatne na ratiometryczną mikroskopię fluorescencyjną z użyciem cyjanu i żółtych białek fluorescencyjnych - na przykład głębszych tkanek, w których białka fluorescencyjne są słabo wykrywane. Z drugiej strony, odczyty ratiometryczne są często preferowane w stosunku do odczytów intensiometrycznych, ponieważ kontrola wewnętrzna jest pomocna w wykluczeniu artefaktów wynikających ze zmian w ekspresji, stabilności, jasności lub wykrywalności biosensorów w danej komórce, tkance lub stanie. Na przykład obrazowanie biosensorem FRET i analizy obrazu zostały również wykorzystane do badania różnych ligandów w różnych tkankach 5,6,18,19,20,. Przedstawione tu eksperymenty obrazowe i analizy obrazów mogą być modyfikowane w celu dostosowania do nowych metod obrazowania, takich jak mikroskopia arkuszowa, które mogą dostarczyć nowych informacji, na przykład na temat głębszych typów tkanek korzeniowych.
Biosensor nlsGPS1 pierwszej generacji to czujnik o wysokim powinowactwie, który zapewnia mapę gradientów GA o wysokiej rozdzielczości, która może również informować o wewnątrzkomórkowym wzroście GA po egzogennym leczeniu GA. Jednym z obecnych ograniczeń nlsGPS1 jest to, że czujnik nie jest szybko odwracalny, a zatem informuje nie o poziomach GA w stanie ustalonym, ale prawdopodobnie o maksymalnym niedawnym stężeniu GA w roztworze będącym przedmiotem zainteresowania. Dokładna szybkość obrotu czujnika również nie jest znana, co w połączeniu z niską odwracalnością wyklucza wykrycie endogennych niedoborów GA, które mogą wystąpić w ciągu kilku minut do kilku godzin w niektórych typach tkanek. Ważne jest również, aby zauważyć, że nlsGPS1 ma wysokie powinowactwo do GA4 (Kd = 24 nM) w porównaniu z innymi formami GA (GA3 Kd = 240 nM, GA1 Kd = 110 nM) podczas obrazowania innych bioaktywnych GA7. Przyszłe generacje bioczujników GA mogą być zaprojektowane tak, aby zwiększyć odwracalność przy zachowaniu wysokiego powinowactwa lub wykazywać różną specyficzność dla różnych prekursorów, bioaktywnych lub katabolitycznych GA.

Hormony roślinne odgrywają fundamentalną rolę we wzroście i rozwoju roślin. Te małe, ruchome cząsteczki sygnałowe są zazwyczaj regulowane na kilku poziomach, takich jak biosynteza, katabolizm oraz transport na krótkie i długie odległości1,2,3,4. Wiedza na temat hormonalnych szlaków sygnałowych i dalszych odpowiedzi transkrypcyjnych wyostrzyła się na przestrzeni lat. Jednak, aby powiązać różnorodne odpowiedzi komórkowe hormonalnych szlaków sygnałowych z bodźcami regulacyjnymi kierującymi dystrybucją hormonów, potrzebujemy czasoprzestrzennej kwantyfikacji poziomów hormonów w skali komórkowej. Bioczujniki oparte na FRET, które mogą wykrywać fitohormony, mogą zwiększyć zdolność naukowców do ilościowego określania poziomów hormonów w skali komórkowej. Bioczujniki oparte na FRET składają się z pary FRET (białka fluorescencyjne donora i akceptora) połączonej z domeną czuciową, która wiąże określony ligand lub reaguje na bodziec biologiczny. W przypadku biosensorów małocząsteczkowych wiązanie ligandów wyzwala zmianę konformacyjną domeny czuciowej, która powoduje zmianę odległości i/lub orientacji między dwoma białkami fluorescencyjnymi pary FRET. Analiza ratiometryczna biosensora FRET jest przeprowadzana poprzez wzbudzenie dawcy i pomiar stosunku emisji fluorescencji akceptora do donora5,6. Wiązanie liganda jest wykrywalne jako zmiana tego współczynnika emisji7.
Niedawno opracowaliśmy oparty na FRET biosensor dla hormonu roślinnego GA. GA to klasa hormonów, które mogą promować kiełkowanie nasion, wydłużanie komórek i rozwojowe przejście od fazy wegetatywnej do fazy kwitnienia. Bioczujnik nlsGPS1 jest zlokalizowany jądrowo i zapewnia czasoprzestrzenny wgląd w dynamikę GA w różnych tkankach roślinnych. W komórkach rzodkiewnika GA wiąże się z rozpuszczalnymi receptorami, karłem niewrażliwym na giberelinę (GID), a kompleks indukuje degradację białek DELA, które działają jako negatywne regulatory sygnalizacji GA2. Domena czuciowa GA nlsGPS1 składa się z receptora GA Arabidopsis (AtGID1C) połączonego z 74-aminokwasowym skróceniem białka DELLA (AtGAI) i pary FRET składającej się ze wzmocnionych wariantów dimeryzacji Cerulean jako dawcy białka fluorescencyjnego i Afrodyty (Wenus zróżnicowana kodonem) jako akceptora białka fluorescencyjnego8. Biosensor nlsGPS1 jest czujnikiem o wysokim powinowactwie do bioaktywnego GA4 (Kd = 24 nM dla GA4) i może być stosowany w różnych typach tkanek do mapowania i ilościowego określania gradientów GA. Aby uniknąć błędnej interpretacji poziomów GA rzodkiewnika in vivo, opracowaliśmy również niereagujący wariant nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) do stosowania jako kontrola negatywna. Białko nlsGPS1-NR przenosi mutacje w kieszeni wiążącej GA, które zakłócają wiązanie GA oraz mutacje w białku DELA, które zakłócają interakcję z białkami receptora GID7,9. Wzorce współczynników emisji lub zmiany obserwowane zarówno w liniach nlsGPS1, jak i nlsGPS1-NR można uznać za artefakty niezwiązane bezpośrednio ze zdarzeniami wiążącymi GA. Ważne jest również, aby zauważyć, że wiązanie nlsGPS1 z GA4 nie jest szybko odwracalne, a zatem współczynniki emisji komórkowych nlsGPS1 powinny być interpretowane jako reprezentujące najwyższe niedawne stężenie GA w danym jądrze, a nie poziomy w stanie ustalonym w czasie rzeczywistym. W związku z tym analiza spadających poziomów GA nie jest możliwa za pomocą nlsGPS1.
Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania biosensora nlsGPS1 w komórkach modelowej rośliny Arabidopsis, przy użyciu metod opartych na obrazowaniu konfokalnym w wysokiej rozdzielczości. Protokół dostarcza informacji na temat obrazowania korzeni roślin i hipokotyli zarówno w stanie stacjonarnym, jak i w czasie. Czujnik nlsGPS1 może być potencjalnie wykorzystany w różnych typach tkanek, a także u różnych gatunków roślin, do mapowania i ilościowego określania rozkładu GA.

<table><tbody><tr><td>nlsGPS1 Col0 Nasiona Arabidopsis</td><td>NASC</td><td>N2107734</td><td></td></tr><tr><td>nlsGPS-NR Col0 Nasiona Arabidopsis</td><td>NASC</td><td>N2107735</td><td></td></tr><tr><td>Gibberellin A4 (GA4)</td><td>Sigma</td><td>G7276</td><td>rozpuścić w EtH 70% i utrzymać na poziomie -20 &deg; C</td></tr><tr><td>roztwór podchlorynu sodu (wybielacz)</td><td>Fisher S/5040</td><td>HSRA 064</td><td></td></tr><tr><td>Klolowodor HCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>Taśma mikroporowa</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>ibidi sticky-slide</td><td>Ibidi</td><td>81128</td><td>Luer 0,1 do obrazowania korzeni</td></tr><tr><td>Ibidi sticky-slide</td><td>Ibidi</td><td>80168</td><td>Luer 0,2 do obrazowania</td></tr> <tr><td>hipokotyluSzkiełko nakrywkowe szklane do szkiełek samoprzylepnych</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Złącza kolankowe Luer</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>rurki silikonowe</td><td>Ibidi</td><td>108401</td><td></td></tr><tr><td>Złącze Luer Lock Programowalna</td> pompa strzykawkowa <td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>AL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy</td><td>Sigma</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salts</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Roślina agarowa, 1 kg</td><td>Melford</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe szlifowane krawędzie, 76 mm x 26 mm, grubość od 1,0 mm do 1,2 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12383118</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe nr 1 1/2 szklane 22 mm x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12363138</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Luer-slip 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10785126</tr><tr><td>Taśma chirurgiczna 3M Micropor</td><td>Fisher Scientific</td><td>12787597</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu, 500 g</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10428671</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Zegarmistrz 5 StSteel</td><td>Scientific Scientific Laboratory Supplies</td><td>INS4340</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki, 125 mm, stal nierdzewna</td>Reduktor dopasowania <td>Fisher Scientific</td><td>12338099</td><td></td></tr><tr><td>0,5 do 1,6</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8</td><td></td><td></td><td>Konfokalny mikroskop laserowy 1</td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop laserowy</td><td>Zeiss LSM 780</td><td></td><td></td> 2</tr><tr><td>Oprogramowanie do wizualizacji i analizy 3D</td><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td> <td>Fidżi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td> <td>OriginPro</td><td>Origin Lab</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (fret) nlsgps1 förster

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Fitohormon giberelina (GA) to mała, mobilna cząsteczka sygnałowa, która odgrywa kluczową rolę w kiełkowaniu nasion, wydłużaniu komórek i przemianach rozwojowych roślin. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) to pierwszy biosensor oparty na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET), który umożliwia monitorowanie komórkowych poziomów GA in vivo. Mierząc współczynnik emisji fluorescencji jądrowej zlokalizowanej GPS1 (nlsGPS1), możliwe jest czasoprzestrzenne mapowanie endogennych i egzogennie dostarczanych gradientów GA w różnych typach tkanek w skali komórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób obrazować współczynniki emisji nlsGPS1 w trzech przykładowych eksperymentach: w stanie ustalonym, przed i po leczeniu egzogenną gibereliną A4 (GA4) oraz w trakcie leczenia. Udostępniamy również metody analizy wskaźników emisji nlsGPS1 przy użyciu zarówno Fidżi, jak i komercyjnego oprogramowania do trójwymiarowej (3D) wizualizacji i analizy mikrograficznej (3D) oraz wyjaśniamy ograniczenia i prawdopodobne pułapki związane z użyciem nlsGPS1 do ilościowego określania poziomów gibereliny.

Dzięki zastosowaniu nlsGPS1 możliwe jest pomiar poziomu wewnątrzkomórkowego GA4 w tkankach podatnych na obrazowanie fluorescencyjne, w tym wierzchołkach korzeni oraz podstawnach łodyg (hypokotylach) hodowanych w ciemności (Rysunek 2). W korzeniu Arabidopsis gradient stosunku emisji nlsGPS1 wskazuje na niskie poziomy GA w strefach merystematycznej i podziałowej oraz wysokie poziomy GA w późnej strefie elongacji (Rysunek 2A i 2B). W przeciwieństwie do tego, w korzeniach nlsGPS1-NR nie zaobserwowano gradientu stosunku emisji, co sugeruje, że endogenny gradient GA nie jest artefaktem (Rysunek 2C i 2D). Gradient stosunku emisji nlsGPS1 ukształtował się również w podstawnach łodyg hodowanych w ciemności, z niskimi poziomami w kotyledonach i haczyku wierzchołkowym oraz wysokimi poziomami w szybko wydłużającym się regionie bazalnym podstawniej łodygi (Rysunek 2E i 2F). Z kolei w podstawnach łodyg nlsGPS1-NR nie zaobserwowano gradientu stosunku emisji (Rysunek 2G i 2H). Zarówno w korzeniach Arabidopsis, jak i w komórkach podstawnych łodyg hodowanych w ciemności, endogenna akumulacja GA korelowała z tempem elongacji komórkowej.
Ponadto egzogennie podany GA4 kumuluje się preferencyjnie w strefie elongacji w porównaniu ze strefą podziałów korzenia Arabidopsis (Rysunek 3), co wskazuje, że nlsGPS1 może być wykorzystywany do badania endogennego i egzogennego rozmieszczenia GA.
Podczas eksperymentów w serii czasowej siewki nlsGPS1 umieszczono w komorach z lepkim szkiełkiem i przepłukano pożywką ciekłą ¼ MS, a następnie poddano działaniu 0,1 µM GA4 przez 30 min. Film przedstawia szybszą akumulację egzogennego GA4 w strefie elongacji korzenia w porównaniu ze strefą podziału (Wideo 1).
<img alt="Schemat układu mikrofluidycznego z kanałami przepływowymi; wtryskiwanie cieczy do analizy; oznaczone porty wejściowe (IN) i wyjściowe (OUT)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58739/58739fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie próbek do obrazowania konfokalnego. Panele te przedstawiają schematyczne opracowanie przygotowania próbek do (A) eksperyment w stanie stacjonarnym, (B) przed i po egzogennym podaniu GA4 obróbki oraz dla (C) eksperyment z przebiegiem czasowym leczenia z wykorzystaniem szkiełek z warstwą przylepną (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/58739fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, poziomy ekspresji w komórkach korzenia, skala gradientu temperatury, wykres porównawczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58739/58739fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Gradient GA w Arabidopsis korzenie i hypocotyle hodowane w ciemności. Dwuwymiarowe obrazy (A) nlsGPS1 i (C) korzenie nlsGPS1-NR analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ, a trójwymiarowe obrazy (B) nlsGPS1 i (D) nlsGPS1-NR przeanalizowano za pomocą komercyjnego oprogramowania do trójwymiarowej analizy obrazu. Obie analizy wykazały endogenny GA4 gradient w Arabidopsis korzenie. Dwuwymiarowe obrazy (E) nlsGPS1 i (G) analizowano hipokotyle nlsGPS1-NR wyhodowane w ciemności przy użyciu oprogramowania ImageJ, a trójwymiarowe obrazy (F) nlsGPS1 i (H) nlsGPS1-NR przeanalizowano przy użyciu komercyjnego oprogramowania do trójwymiarowej analizy obrazu. Obie analizy wykazały endogenne GA4 gradient w podszyciach wyrosłych w ciemności. Pasek LUT przedstawia fałszywe zabarwienie stosunków emisji nlsGPS1. Obrazy YFP służą jako kontrole ekspresji. Obrazy podszyci zostały pozyskane przy użyciu dwóch pozycji stolika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/58739fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza fluorescencyjna stosunku emisji nlsGPS1 przed i po traktowaniu GA4; dołączono diagramy i wykresy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58739/58739fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Egzogenny gradient GA w korzeniach. Pierwsze dwa panele przedstawiają (A) dwuwymiarowy i (B) obrazy trójwymiarowe korzenia nlsGPS1 przed i 20 min po traktowaniu egzogennym GA4 (1 µM). Obrazy YFP przedstawiono jako kontrole ekspresji. Dwa ostatnie panele pokazują (C) średnią i odchylenie standardowe oraz (D) wykresy beeswarm oraz pudełkowy stosunków emisji nlsGPS1 dla jąder komórkowych strefy elongacji (obszaru wyznaczonego białą ramką). W strefie elongacji stosunek emisji nlsGPS1 był istotnie wyższy po podaniu GA4 leczenie (test U Manna-Whitneya, *** Pwartość p &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/58739fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat dyspersji fluorescencyjnych mikrokulek; analiza optyczna; symulacja sortowania komórek; mikrofluidyka." src="/files/ftp_upload/58739/58739movie1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Wideo 1"> 
Wideo 1: Eksperyment perfuzyjny korzenia nlsGPS1 z wykorzystaniem preparatu typu sticky-slide. Niniejszy film przedstawia trójwymiarowe obrazy nlsGPS1 przepłukanego cieczą ¼ MS i poddanego działaniu 0.1 µM GA4 przez 30 min. W przebiegu czasowym obrazy pozyskiwano co 10 min przez 3 h w następujących odstępach: 30 min roztworu pozorowanego (klatka t = 1, Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. = 2, t = 3), 30 min GA4 leczenie (ramka t = 4, t = 5, t = 6), 2 h roztworu pozorowanego (ramka t = 7 do t = 18) roztwór. Przed akwizycją próbkę perfundowano roztworem kontrolnym przez 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/Movie1.mov" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Czujnik percepcji gibereliny 1 (GPS1) jest pierwszym biosensorem opartym na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru poziomów komórkowych fitohormonów gibereliny z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Protokół ten przedstawia metodę wizualizacji i ilościowego określania poziomów gibereliny komórkowej przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora nlsGPS1 w hipokotylach Arabidopsis i wierzchołkach korzeni.

Wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (FRET) nlsGPS1 Förster

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju roślin dotyczące dystrybucji fitohormonów regulujących wzrost. Dzięki zastosowaniu genetycznie kodowanych biosensorów FRET, na przykład nlsGPS1, który wykrywa gibereliny, możliwe jest zmierzenie dynamicznego rozkładu ważnych związków w tkankach Arabidopsis w roztworze komórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej materii będą miały trudności, ponieważ analiza biosensorów FRET obejmuje obrazowanie ratiometryczne, które ma zwiększony szum i dodatkowe kroki analityczne w porównaniu z obrazowaniem metrycznym intencji.Zacznij od wysiewu około 20 wysterylizowanych nasion Arabidopsis na kwadratowych płytkach agarowych 1/2 Murashige i Skoog lub MS. Uszczelnij płytki taśmą chirurgiczną z porami i owiń je folią aluminiową na jeden do trzech dni inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu rozwarstwienia. W celu obrazowania korzeni przenieś płytki do komory wzrostowej w orientacji pionowej na trzy dni we wskazanych warunkach.W przypadku ciemnego hipokotylu przenieś płytki do komory wzrostowej na jednogodzinny do czterech godzin impuls świetlny, aby zsynchronizować kiełkowanie. Następnie owiń talerze folią aluminiową i umieść je w komorze wzrostowej w orientacji pionowej na trzy dni. W przypadku pomiarów w stanie ustalonym dodaj 50 mikrolitrów makiety roztworu do czystego szkiełka mikroskopowego i delikatnie umieść na szkiełku trzy zlokalizowane jądrowo czujniki percepcji gibereliny jeden lub nlsGPS1 wyrażające siewki.Następnie nałóż kroplę smaru próżniowego na każdy róg czystego szkiełka nakrywkowego i delikatnie umieść szkiełko na sadzonkach. Ostrożnie dodaj dodatkowy roztwór imitujący, aby w razie potrzeby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przed podaniem gibereliny czwartej lub GA4 należy użyć strzykawki o pojemności 20 mililitrów wypełnionej smarem próżniowym i wyposażonej w zmodyfikowaną końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów z otworem o średnicy jednego milimetra, aby narysować równomiernie ułożony prostokąt o długości trzech i pół centymetra i szerokości dwóch i pół centymetra na czystym szkiełku podstawowym.Dodaj 50 mikrolitrów makiety roztworu do środka prostokąta i użyj czystych kleszczy, aby podnieść sadzonki z ekspresją nlsGPS1 za spód ich liścieni w celu ostrożnego przeniesienia do makiety roztworu. Umieść szkiełko nakrywkowe nakrapiane smarem próżniowym, jak właśnie pokazano, w środku prostokąta smaru próżniowego i ostrożnie napełnij zbiornik dodatkowym roztworem makiety, nie naruszając sadzonek. Następnie uzyskaj obrazy sadzonek na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w odpowiednie lasery do wzbudzania CFP i YFP w celu wykonania rezonansowego obrazowania transferu energii Forstera.W przypadku GA4 do leczenia wyjmij szkiełko ze stolika mikroskopu i ustaw minutnik na 20 minut. Natychmiast usunąć roztwór makiety z prawej strony szkiełka nakrywkowego, dodając 17 mikrolitrów jednej ćwiartki płynu MS uzupełnionego jednym mikromolowym GA4 po lewej stronie szkiełka nakrywkowego, aż do zastąpienia całego roztworu makowego. Następnie umieść szkiełko podstawowe z powrotem na stoliku mikroskopowym i odczekaj kolejne 10 minut przed uzyskaniem obrazu po zabiegu GA4.Aby ustawić przebieg czasowy dla interesującej tkanki, dodaj 200 mikrolitrów roztworu próbnego do środka kanału perfuzyjnego szkiełka samoprzylepnego ibidi i delikatnie umieść sadzonki nlsGPS1 w makiecie roztworu, jak pokazano. Za pomocą kleszczy delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na sadzonkach, używając tylnej strony kleszczyków, aby delikatnie docisnąć zewnętrzne krawędzie szkiełka nakrywkowego, aż utworzy silne wiązanie z lepkim materiałem na obrzeżach szkiełka samoprzylepnego. Następnie użyj dwóch złączy kolankowych Luer o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra i kawałka silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra, aby połączyć szkiełko samoprzylepne z 20-milimetrową strzykawką wypełnioną makietą roztworu i podłączyć szkiełko do pojemnika wylotowego w celu zebrania roztworu odpływowego.Delikatnie wciśnij tłok, aby dozować wystarczającą ilość roztworu do komory, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza, a następnie załadować strzykawkę do programowalnej pompy strzykawkowej. Następnie uruchom pompę, aby zainicjować bieg czasu. W przypadku leczenia GA4 w czasie przerwy w pompie, aby zatrzymać perfuzję i zastąpić imitację buforu zawierającego strzykawkę strzykawką wypełnioną jedną czwartą płynu MS uzupełnioną GA4.W przypadku analizy obrazu 3D zaimportuj pliki do oprogramowania do analizy obrazów IMARIS i otwórz kreatora powierzchni. Ustaw odejmowanie tła na trzy mikrony, a próg na domyślny. Podczas segmentacji jąder należy uważać, aby nie uwzględnić wielu jąder o słabej fluorescencji, ponieważ stosunek sygnału do szumu obiektu o bliskich poziomach sygnału tła będzie zbyt niski do ratiometrycznej analizy obrazu.Następnie zamaskuj kanały emisji CFP i FRET w oparciu o powierzchnie utworzone za pomocą emisji YFP. Użyj rozszerzenia współczynnika średniej intensywności XT, aby obliczyć stosunek emisji akceptora wzbudzenia donora podzielony przez emisję donora wzbudzenia donora między średnimi wartościami intensywności poszczególnych powierzchni w dwóch kanałach. Aby pokolorować poszczególne powierzchnie za pomocą współczynnika emisji nlsGPS1, wybierz kodowanie kolorami ze statystykami i ustaw średni współczynnik intensywności jako typ statystyk.Pod ikoną statystyk wyeksportuj współczynniki poszczególnych wartości z tabeli, a następnie skopiuj i wklej wartości do arkusza kalkulacyjnego w celu graficznej reprezentacji danych. W korzeniu Arabidopsis gradient współczynnika emisji nlsGPS1 wskazuje na niskie poziomy GA4 w strefach merystematycznych i podziałowych oraz wysokie poziomy GA w strefie późnej elongacji. W przeciwieństwie do tego, gradient współczynnika emisji nie jest obserwowany w niereagujących korzeniach nlsGPS1, co sugeruje, że endogenny gradient GA4 nie jest artefaktem.Gradient współczynnika emisji nlsGPS1 powstaje również w ciemno hodowanych hipokotylach z niskimi poziomami w liścieniach i typowym haczyku oraz wysokimi poziomami w szybko wydłużającym się obszarze podstawowym hipokotylu. W przeciwieństwie do tego, gradient współczynnika emisji nie jest obserwowany w niereagujących hipokotylach nlsGPS1. Co więcej, egzogennie dostarczany GA4 akumuluje się preferencyjnie w strefie wydłużenia w porównaniu ze strefą podziału korzenia Arabidopsis, co wskazuje, że nlsGPS1 może być stosowany do badania endogennych i egzogennych wzorców GA.Ponadto analiza przebiegu w czasie siewek nlsGPS1 traktowanych GA4 ujawnia szybszą akumulację egzogennego GA4 w wydłużeniu korzeni w porównaniu ze strefą podziału. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o unikaniu nasycenia pikseli podczas obrazowania ilościowego, aby utrzymać stałe parametry obrazowania oraz zminimalizować problemy z dryftem i zmianą ogniskowej podczas perfuzji próbki. Zgodnie z tą procedurą można wykonać opracowane metody, takie jak obrazowanie korzeni rosnących w urządzeniach kontrolujących obfitość chipów korzeniowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak zmieniają się gradienty GA w wierzchołkach korzeni Arabidopsis rosnących w różnym tempie lub w odpowiedzi na stres Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie wzrostu roślin w celu zbadania dynamicznej dystrybucji giberelin w dodatkowych tkankach i narządach Arabidopsis thaliana.

visualizing-cellular-gibberellin-levels-using-nlsgps1-frster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Dostarczamy szczegółowy protokół do badania dynamiki kwasów żółciowych w żywych komórkach za pomocą genetycznie kodowanego czujnika BAS FRET. Ten czujnik kwasu żółciowego stanowi unikalne narzędzie do badania (regulacji) transportu kwasów żółciowych i aktywacji FXR w szerokim zakresie typów komórek.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na FRET

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Ostatnio opracowano wiele biosensorów siły opartych na FRET, które umożliwiają specyficzne dla białek rozwiązywanie siły wewnątrzkomórkowej. W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób jeden z tych czujników, zaprojektowany dla łącznika białka kompleksu nukleoszkielet-cytoszkielet (LINC) Nesprin-2G, może być wykorzystany do pomiaru sił aktomiozyny w jądrowym kompleksie LINC.

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

Ten protokół przedstawia prostą metodę analizy sygnałów wapniowych w roślinach, generowanych przez karmienie owadów pluskwiaków, takich jak mszyce. Arabidopsis thaliana przekształcony za pomocą biosensora wapnia GCaMP3 GFP pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym in vivo z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Rejestrowanie w czasie rzeczywistym sygnałów wapniowych Arabidopsis podczas żerowania owadów za pomocą biosensora fluorescencyjnego

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Odkryj metodę wizualizacji poziomów gibereliny w tkankach roślinnych Arabidopsis za pomocą biosensora FRET nlsGPS1. Technika ta umożliwia badanie dynamiki fitohormonów z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (FRET) nlsGPS1 Förster

Przeglądaj więcej filmów