Wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (FRET) nlsGPS1 Förster
January 12th, 2019
Czujnik percepcji gibereliny 1 (GPS1) jest pierwszym biosensorem opartym na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru poziomów komórkowych fitohormonów gibereliny z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Protokół ten przedstawia metodę wizualizacji i ilościowego określania poziomów gibereliny komórkowej przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora nlsGPS1 w hipokotylach Arabidopsis i wierzchołkach korzeni.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju roślin dotyczące dystrybucji fitohormonów regulujących wzrost. Dzięki zastosowaniu genetycznie kodowanych biosensorów FRET, na przykład nlsGPS1, który wykrywa gibereliny, możliwe jest zmierzenie dynamicznego rozkładu ważnych związków w tkankach Arabidopsis w roztworze komórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej materii będą miały trudności, ponieważ analiza biosensorów FRET obejmuje obrazowanie ratiometryczne, które ma zwiększony szum i dodatkowe kroki analityczne w porównaniu z obrazowaniem metrycznym intencji.
Zacznij od wysiewu około 20 wysterylizowanych nasion Arabidopsis na kwadratowych płytkach agarowych 1/2 Murashige i Skoog lub MS. Uszczelnij płytki taśmą chirurgiczną z porami i owiń je folią aluminiową na jeden do trzech dni inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu rozwarstwienia. W celu obrazowania korzeni przenieś płytki do komory wzrostowej w orientacji pionowej na trzy dni we wskazanych warunkach.
W przypadku ciemnego hipokotylu przenieś płytki do komory wzrostowej na jednogodzinny do czterech godzin impuls świetlny, aby zsynchronizować kiełkowanie. Następnie owiń talerze folią aluminiową i umieść je w komorze wzrostowej w orientacji pionowej na trzy dni. W przypadku pomiarów w stanie ustalonym dodaj 50 mikrolitrów makiety roztworu do czystego szkiełka mikroskopowego i delikatnie umieść na szkiełku trzy zlokalizowane jądrowo czujniki percepcji gibereliny jeden lub nlsGPS1 wyrażające siewki.
Następnie nałóż kroplę smaru próżniowego na każdy róg czystego szkiełka nakrywkowego i delikatnie umieść szkiełko na sadzonkach. Ostrożnie dodaj dodatkowy roztwór imitujący, aby w razie potrzeby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przed podaniem gibereliny czwartej lub GA4 należy użyć strzykawki o pojemności 20 mililitrów wypełnionej smarem próżniowym i wyposażonej w zmodyfikowaną końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów z otworem o średnicy jednego milimetra, aby narysować równomiernie ułożony prostokąt o długości trzech i pół centymetra i szerokości dwóch i pół centymetra na czystym szkiełku podstawowym.
Dodaj 50 mikrolitrów makiety roztworu do środka prostokąta i użyj czystych kleszczy, aby podnieść sadzonki z ekspresją nlsGPS1 za spód ich liścieni w celu ostrożnego przeniesienia do makiety roztworu. Umieść szkiełko nakrywkowe nakrapiane smarem próżniowym, jak właśnie pokazano, w środku prostokąta smaru próżniowego i ostrożnie napełnij zbiornik dodatkowym roztworem makiety, nie naruszając sadzonek. Następnie uzyskaj obrazy sadzonek na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w odpowiednie lasery do wzbudzania CFP i YFP w celu wykonania rezonansowego obrazowania transferu energii Forstera.
W przypadku GA4 do leczenia wyjmij szkiełko ze stolika mikroskopu i ustaw minutnik na 20 minut. Natychmiast usunąć roztwór makiety z prawej strony szkiełka nakrywkowego, dodając 17 mikrolitrów jednej ćwiartki płynu MS uzupełnionego jednym mikromolowym GA4 po lewej stronie szkiełka nakrywkowego, aż do zastąpienia całego roztworu makowego. Następnie umieść szkiełko podstawowe z powrotem na stoliku mikroskopowym i odczekaj kolejne 10 minut przed uzyskaniem obrazu po zabiegu GA4.
Aby ustawić przebieg czasowy dla interesującej tkanki, dodaj 200 mikrolitrów roztworu próbnego do środka kanału perfuzyjnego szkiełka samoprzylepnego ibidi i delikatnie umieść sadzonki nlsGPS1 w makiecie roztworu, jak pokazano. Za pomocą kleszczy delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na sadzonkach, używając tylnej strony kleszczyków, aby delikatnie docisnąć zewnętrzne krawędzie szkiełka nakrywkowego, aż utworzy silne wiązanie z lepkim materiałem na obrzeżach szkiełka samoprzylepnego. Następnie użyj dwóch złączy kolankowych Luer o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra i kawałka silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra, aby połączyć szkiełko samoprzylepne z 20-milimetrową strzykawką wypełnioną makietą roztworu i podłączyć szkiełko do pojemnika wylotowego w celu zebrania roztworu odpływowego.
Delikatnie wciśnij tłok, aby dozować wystarczającą ilość roztworu do komory, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza, a następnie załadować strzykawkę do programowalnej pompy strzykawkowej. Następnie uruchom pompę, aby zainicjować bieg czasu. W przypadku leczenia GA4 w czasie przerwy w pompie, aby zatrzymać perfuzję i zastąpić imitację buforu zawierającego strzykawkę strzykawką wypełnioną jedną czwartą płynu MS uzupełnioną GA4.
W przypadku analizy obrazu 3D zaimportuj pliki do oprogramowania do analizy obrazów IMARIS i otwórz kreatora powierzchni. Ustaw odejmowanie tła na trzy mikrony, a próg na domyślny. Podczas segmentacji jąder należy uważać, aby nie uwzględnić wielu jąder o słabej fluorescencji, ponieważ stosunek sygnału do szumu obiektu o bliskich poziomach sygnału tła będzie zbyt niski do ratiometrycznej analizy obrazu.
Następnie zamaskuj kanały emisji CFP i FRET w oparciu o powierzchnie utworzone za pomocą emisji YFP. Użyj rozszerzenia współczynnika średniej intensywności XT, aby obliczyć stosunek emisji akceptora wzbudzenia donora podzielony przez emisję donora wzbudzenia donora między średnimi wartościami intensywności poszczególnych powierzchni w dwóch kanałach. Aby pokolorować poszczególne powierzchnie za pomocą współczynnika emisji nlsGPS1, wybierz kodowanie kolorami ze statystykami i ustaw średni współczynnik intensywności jako typ statystyk.
Pod ikoną statystyk wyeksportuj współczynniki poszczególnych wartości z tabeli, a następnie skopiuj i wklej wartości do arkusza kalkulacyjnego w celu graficznej reprezentacji danych. W korzeniu Arabidopsis gradient współczynnika emisji nlsGPS1 wskazuje na niskie poziomy GA4 w strefach merystematycznych i podziałowych oraz wysokie poziomy GA w strefie późnej elongacji. W przeciwieństwie do tego, gradient współczynnika emisji nie jest obserwowany w niereagujących korzeniach nlsGPS1, co sugeruje, że endogenny gradient GA4 nie jest artefaktem.
Gradient współczynnika emisji nlsGPS1 powstaje również w ciemno hodowanych hipokotylach z niskimi poziomami w liścieniach i typowym haczyku oraz wysokimi poziomami w szybko wydłużającym się obszarze podstawowym hipokotylu. W przeciwieństwie do tego, gradient współczynnika emisji nie jest obserwowany w niereagujących hipokotylach nlsGPS1. Co więcej, egzogennie dostarczany GA4 akumuluje się preferencyjnie w strefie wydłużenia w porównaniu ze strefą podziału korzenia Arabidopsis, co wskazuje, że nlsGPS1 może być stosowany do badania endogennych i egzogennych wzorców GA.
Ponadto analiza przebiegu w czasie siewek nlsGPS1 traktowanych GA4 ujawnia szybszą akumulację egzogennego GA4 w wydłużeniu korzeni w porównaniu ze strefą podziału. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o unikaniu nasycenia pikseli podczas obrazowania ilościowego, aby utrzymać stałe parametry obrazowania oraz zminimalizować problemy z dryftem i zmianą ogniskowej podczas perfuzji próbki. Zgodnie z tą procedurą można wykonać opracowane metody, takie jak obrazowanie korzeni rosnących w urządzeniach kontrolujących obfitość chipów korzeniowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak zmieniają się gradienty GA w wierzchołkach korzeni Arabidopsis rosnących w różnym tempie lub w odpowiedzi na stres Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie wzrostu roślin w celu zbadania dynamicznej dystrybucji giberelin w dodatkowych tkankach i narządach Arabidopsis thaliana.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nowatorski biosensor oparty na Förster resonance energy transfer (FRET) - Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) do pomiaru fitohormonów giberelin w roślinach. Metoda ta pozwala na wysokiej rozdzielczości wizualizacji i ilościowego pomiaru poziomów giberelin w hypokotylach i końcach korzeni Arabidopsis.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Sygnalizowanie fitohormonów
- Techniki obrazowania komórkowego
Tło
- Gibereliny są kluczowymi fitohormonami regulującymi wzrost roślin.
- Zrozumienie ich rozmieszczenia jest kluczowe dla badań nad rozwojem roślin.
- Biosensory FRET zapewniają dynamiczną metodę pomiaru poziomów hormonów.
- Poprzednie metody nie miały przestrzenno-czasowej rozdzielczości oferowanej przez GPS1.
Cel badania
- Opracowanie metody do pomiaru poziomów giberelin w tkankach roślin w czasie rzeczywistym.
- Wizualizacja rozmieszczenia giberelin w Arabidopsis.
- Zgłębienie rozumienia regulacji wzrostu roślin.
Stosowane metody
- Wykorzystanie genetycznie zakodowanego biosensora nlsGPS1 w sadzonkach Arabidopsis.
- Razometryczne obrazowanie do analizy sygnałów FRET.
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania poziomów giberelin.
- Eksperymenty przebiegu czasowego do oceny dynamicznych zmian w rozmieszczeniu giberelin.
Główne wyniki
- nlsGPS1 ujawnia gradient poziomów giberelin w korzeniach i hypokotylach Arabidopsis.
- Wysokie poziomy giberelin stwierdzono w strefach elongacji hypokotyli.
- Egzogeniczne leczenie GA4 potwierdziło wrażliwość biosensora na zmiany giberelin.
- Wyniki sugerują, że biosensor nlsGPS1 jest skuteczny w badaniu dynamiki giberelin.
Wnioski
- Biosensor GPS1 jest cennym narzędziem do badania rozmieszczenia giberelin.
- Ta metoda może rozwijać badania w dziedzinie biologii rozwoju roślin.
- Wyniki przyczyniają się do głębszego zrozumienia sygnalizacji fitohormonów w roślinach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Monitoring dynamic phytohormone gradients at cellular resolution supports mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular signaling to phenotypic outcomes. The nlsGPS1 FRET biosensor enables quantitative, spatiotemporal mapping of gibberellin dynamics, providing predictive confidence in target pathway modulation. This approach aids in translational biomarker alignment and preclinical model validation for growth-regulatory pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gibberellin signaling dynamics in living tissues to clarify target engagement and pathway activity.
- Operational Value: Provides ratiometric readouts that reduce variability and support reproducible target validation assays.
- Predictive Value: Facilitates dose-response characterization of gibberellin-modulating compounds with subcellular resolution.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fluorescence ratio outputs suitable for high-content screening of gibberellin biosynthesis or signaling inhibitors.
- Quantitative Output: Enables ratiometric imaging that corrects for expression level and environmental artifacts, improving assay robustness.
- Scalability: Compatible with microfluidic perfusion systems for time-course compound exposure studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports evaluation of gibberellin pathway modulation in plant-based preclinical models of growth dysregulation.
- Translational Continuity: Links cellular hormone flux to tissue-level phenotypes, aiding in biomarker-driven go/no-go decisions.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from on-target gibberellin modulation versus off-target effects.
Pipeline & Workflow Integration
The nlsGPS1 biosensor integrates into discovery workflows from target validation through lead optimization by providing real-time, quantitative feedback on pathway modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gibberellin-dependent mechanisms in growth and development pathways.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for compound libraries targeting hormone biosynthesis or perception.
- Analytics: Delivers ratiometric FRET measurements that allow comparison of intracellular gibberellin levels across conditions and time points.
- Translational Research: Connects subcellular hormone dynamics to organ-level responses in Arabidopsis, supporting extrapolation to complex systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform for longitudinal studies of phytohormone flux in genetic or chemical perturbation models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in phytohormone signaling by providing direct, real-time readouts of cellular gibberellin levels.
- Operational Value: Enhances reproducibility through ratiometric imaging that normalizes for biosensor expression and environmental variables.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by linking compound treatment to quantifiable changes in target pathway activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gibberellin pathway modulators based on validated target engagement in relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and FRET imaging techniques for accurate ratiometric analysis.
- Dependent on stable transgenic expression of nlsGPS1 in Arabidopsis lines for consistent biosensor performance.
- Necessitates careful control of imaging parameters to avoid pixel saturation and maintain signal-to-noise ratio during time-course experiments.
- Involves analytical steps to segment nuclei and compute intensity ratios, requiring validated image analysis pipelines (e.g., Fiji or IMARIS).
- Limited to gibberellin perception; does not distinguish between bioactive and inactive forms or downstream signaling events.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Plant Growth and Sample Preparation
2:09
Gibberellin4 (GA4) Treatment
3:45
Tissue of Interest Time Course Setup
5:09
3-D Image Analysis
6:36
Results: Representative Endogenous and Exogenous GA Gradients in Arabidopsis Roots and Dark-grown Hypocotyls
7:58
Conclusion
