Wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (FRET) nlsGPS1 Förster

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju roślin dotyczące dystrybucji fitohormonów regulujących wzrost. Dzięki zastosowaniu genetycznie kodowanych biosensorów FRET, na przykład nlsGPS1, który wykrywa gibereliny, możliwe jest zmierzenie dynamicznego rozkładu ważnych związków w tkankach Arabidopsis w roztworze komórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej materii będą miały trudności, ponieważ analiza biosensorów FRET obejmuje obrazowanie ratiometryczne, które ma zwiększony szum i dodatkowe kroki analityczne w porównaniu z obrazowaniem metrycznym intencji.

Zacznij od wysiewu około 20 wysterylizowanych nasion Arabidopsis na kwadratowych płytkach agarowych 1/2 Murashige i Skoog lub MS. Uszczelnij płytki taśmą chirurgiczną z porami i owiń je folią aluminiową na jeden do trzech dni inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu rozwarstwienia. W celu obrazowania korzeni przenieś płytki do komory wzrostowej w orientacji pionowej na trzy dni we wskazanych warunkach.

W przypadku ciemnego hipokotylu przenieś płytki do komory wzrostowej na jednogodzinny do czterech godzin impuls świetlny, aby zsynchronizować kiełkowanie. Następnie owiń talerze folią aluminiową i umieść je w komorze wzrostowej w orientacji pionowej na trzy dni. W przypadku pomiarów w stanie ustalonym dodaj 50 mikrolitrów makiety roztworu do czystego szkiełka mikroskopowego i delikatnie umieść na szkiełku trzy zlokalizowane jądrowo czujniki percepcji gibereliny jeden lub nlsGPS1 wyrażające siewki.

Następnie nałóż kroplę smaru próżniowego na każdy róg czystego szkiełka nakrywkowego i delikatnie umieść szkiełko na sadzonkach. Ostrożnie dodaj dodatkowy roztwór imitujący, aby w razie potrzeby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przed podaniem gibereliny czwartej lub GA4 należy użyć strzykawki o pojemności 20 mililitrów wypełnionej smarem próżniowym i wyposażonej w zmodyfikowaną końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów z otworem o średnicy jednego milimetra, aby narysować równomiernie ułożony prostokąt o długości trzech i pół centymetra i szerokości dwóch i pół centymetra na czystym szkiełku podstawowym.

Dodaj 50 mikrolitrów makiety roztworu do środka prostokąta i użyj czystych kleszczy, aby podnieść sadzonki z ekspresją nlsGPS1 za spód ich liścieni w celu ostrożnego przeniesienia do makiety roztworu. Umieść szkiełko nakrywkowe nakrapiane smarem próżniowym, jak właśnie pokazano, w środku prostokąta smaru próżniowego i ostrożnie napełnij zbiornik dodatkowym roztworem makiety, nie naruszając sadzonek. Następnie uzyskaj obrazy sadzonek na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w odpowiednie lasery do wzbudzania CFP i YFP w celu wykonania rezonansowego obrazowania transferu energii Forstera.

W przypadku GA4 do leczenia wyjmij szkiełko ze stolika mikroskopu i ustaw minutnik na 20 minut. Natychmiast usunąć roztwór makiety z prawej strony szkiełka nakrywkowego, dodając 17 mikrolitrów jednej ćwiartki płynu MS uzupełnionego jednym mikromolowym GA4 po lewej stronie szkiełka nakrywkowego, aż do zastąpienia całego roztworu makowego. Następnie umieść szkiełko podstawowe z powrotem na stoliku mikroskopowym i odczekaj kolejne 10 minut przed uzyskaniem obrazu po zabiegu GA4.

Aby ustawić przebieg czasowy dla interesującej tkanki, dodaj 200 mikrolitrów roztworu próbnego do środka kanału perfuzyjnego szkiełka samoprzylepnego ibidi i delikatnie umieść sadzonki nlsGPS1 w makiecie roztworu, jak pokazano. Za pomocą kleszczy delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na sadzonkach, używając tylnej strony kleszczyków, aby delikatnie docisnąć zewnętrzne krawędzie szkiełka nakrywkowego, aż utworzy silne wiązanie z lepkim materiałem na obrzeżach szkiełka samoprzylepnego. Następnie użyj dwóch złączy kolankowych Luer o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra i kawałka silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra, aby połączyć szkiełko samoprzylepne z 20-milimetrową strzykawką wypełnioną makietą roztworu i podłączyć szkiełko do pojemnika wylotowego w celu zebrania roztworu odpływowego.

Delikatnie wciśnij tłok, aby dozować wystarczającą ilość roztworu do komory, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza, a następnie załadować strzykawkę do programowalnej pompy strzykawkowej. Następnie uruchom pompę, aby zainicjować bieg czasu. W przypadku leczenia GA4 w czasie przerwy w pompie, aby zatrzymać perfuzję i zastąpić imitację buforu zawierającego strzykawkę strzykawką wypełnioną jedną czwartą płynu MS uzupełnioną GA4.

W przypadku analizy obrazu 3D zaimportuj pliki do oprogramowania do analizy obrazów IMARIS i otwórz kreatora powierzchni. Ustaw odejmowanie tła na trzy mikrony, a próg na domyślny. Podczas segmentacji jąder należy uważać, aby nie uwzględnić wielu jąder o słabej fluorescencji, ponieważ stosunek sygnału do szumu obiektu o bliskich poziomach sygnału tła będzie zbyt niski do ratiometrycznej analizy obrazu.

Następnie zamaskuj kanały emisji CFP i FRET w oparciu o powierzchnie utworzone za pomocą emisji YFP. Użyj rozszerzenia współczynnika średniej intensywności XT, aby obliczyć stosunek emisji akceptora wzbudzenia donora podzielony przez emisję donora wzbudzenia donora między średnimi wartościami intensywności poszczególnych powierzchni w dwóch kanałach. Aby pokolorować poszczególne powierzchnie za pomocą współczynnika emisji nlsGPS1, wybierz kodowanie kolorami ze statystykami i ustaw średni współczynnik intensywności jako typ statystyk.

Pod ikoną statystyk wyeksportuj współczynniki poszczególnych wartości z tabeli, a następnie skopiuj i wklej wartości do arkusza kalkulacyjnego w celu graficznej reprezentacji danych. W korzeniu Arabidopsis gradient współczynnika emisji nlsGPS1 wskazuje na niskie poziomy GA4 w strefach merystematycznych i podziałowych oraz wysokie poziomy GA w strefie późnej elongacji. W przeciwieństwie do tego, gradient współczynnika emisji nie jest obserwowany w niereagujących korzeniach nlsGPS1, co sugeruje, że endogenny gradient GA4 nie jest artefaktem.

Gradient współczynnika emisji nlsGPS1 powstaje również w ciemno hodowanych hipokotylach z niskimi poziomami w liścieniach i typowym haczyku oraz wysokimi poziomami w szybko wydłużającym się obszarze podstawowym hipokotylu. W przeciwieństwie do tego, gradient współczynnika emisji nie jest obserwowany w niereagujących hipokotylach nlsGPS1. Co więcej, egzogennie dostarczany GA4 akumuluje się preferencyjnie w strefie wydłużenia w porównaniu ze strefą podziału korzenia Arabidopsis, co wskazuje, że nlsGPS1 może być stosowany do badania endogennych i egzogennych wzorców GA.

Ponadto analiza przebiegu w czasie siewek nlsGPS1 traktowanych GA4 ujawnia szybszą akumulację egzogennego GA4 w wydłużeniu korzeni w porównaniu ze strefą podziału. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o unikaniu nasycenia pikseli podczas obrazowania ilościowego, aby utrzymać stałe parametry obrazowania oraz zminimalizować problemy z dryftem i zmianą ogniskowej podczas perfuzji próbki. Zgodnie z tą procedurą można wykonać opracowane metody, takie jak obrazowanie korzeni rosnących w urządzeniach kontrolujących obfitość chipów korzeniowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak zmieniają się gradienty GA w wierzchołkach korzeni Arabidopsis rosnących w różnym tempie lub w odpowiedzi na stres Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie wzrostu roślin w celu zbadania dynamicznej dystrybucji giberelin w dodatkowych tkankach i narządach Arabidopsis thaliana.