Name: Preparat peptydowy inhibitora kinazy białkowej C-delta wykorzystujący nanocząstki złota (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj metodę syntezy hybryd nanocząstek złota z peptydami inhibitora kinazy białkowej C-delta. System ten zwiększa wchłanianie komórkowe i stabilność leków, umożliwiając skuteczne leczenie uszkodzenia płuc przy niższych dawkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty badawcze z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (PJT-148847), Ministerstwa Badań i Innowacji Ontario (RE-08-029) oraz Canada First Research of Excellence Program, Medicine by Design na Uniwersytecie w Toronto. Dr Mingyao Liu jest kierownikiem Katedry Urazów, Naprawy i Regeneracji Płuc im. Jamesa i Mary Davie.

1. Przygotowanie roztworów peptydowych
<ol>
	<li>Pobrać peptydy (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) z zamrażarki -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Trzymaj butelkę zamkniętą, aby zapobiec kondensacji wilgoci na peptydach.</li>
	<li>Zważ 0,01 g każdego peptydu na mikrowadze. Umieść każdy peptyd w osobnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodaj 18,74 ml wody dejonizowanej (DI) do probówki P2.</li>
	<li>Dodaj 16,93 ml wody DI do probówki P4.</li>
	<li>Dodać 8,21 ml 50% acetonitrylu rozcieńczonego w wodzie DI do probówki PKCδi.</li>
	<li>Krótko odwiruj roztwory peptydów. Umieść stożkowe probówki o pojemności 50 ml w sonikatorze (40 MHz) na 5 minut.</li>
	<li>Przynieś roztwory peptydów do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie przygotowane roztwory peptydów powinny mieć 1 mM.</li>
	<li>Przenieść 1 ml każdego roztworu peptydu do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 19 ml wody demineralizowanej do probówek P2 i P4 i dodać 19 ml 50% acetonitrylu do probówki PKCδi, tak aby każdy roztwór rozcieńczyć do 50 μM i przechowywać we własnej probówce.</li>
</ol>
2. Formułowanie PNB/PKCi
<ol>
	<li>Peptydy powinny być dodawane do roztworu GNP, gdy nadal znajdują się w BSC</li>
	<li>Dodać 475 μl P2, 25 μl P4 i 500 μl roztworu δPKCi do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 9 ml roztworu GNP o długości 20 nm (7,0x1011 cząstek/ml) do tej samej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wyjdź z szafy bezpieczeństwa biologicznego. Owiń probówkę o pojemności 15 ml folią aluminiową. Pozostaw go na noc na shakerze w RT.</li>
	<li>Umieścić próbki z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Podaniec 1 ml GNP/PKCi do każdej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki w mikrowirówce przez 30 minut w temperaturze 15,294 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant z każdej probówki znajdującej się pod komorą bezpieczeństwa biologicznego. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby usunąć supernatant, upewniając się, że granulka GNP pozostaje nienaruszona i nie jest zasysana.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w żądanym rozpuszczalniku zgodnie z wymaganym stężeniem. Odpowiednimi rozpuszczalnikami mogą być woda DI, PBS i 0,9% NaCl. 
	UWAGA: Począwszy od 1 ml GNP/PKCi, granulka GNP zawiera 6,3 x 1011 cząstek, w oparciu o stężenie GNP podane przez producenta. Aby podać 1,3 x 1012 cząstek w 500 μL 0,9% NaCl, dodajemy 232 μL 0,9% NaCl do każdej z trzech granulek. Po zebraniu ich razem możemy zebrać 500 μL roztworu GNP/PKCi. 
	UWAGA: Dobrze wymieszaj żądany rozpuszczalnik przed rozcieńczeniem granulki GNP/PKCi, w przeciwnym razie GNP/PKCi ulegnie agregacji.</li>
</ol>
3. Ocena rozpuszczalności hybryd GNP/PKCi
<ol>
	<li>Wlać 0,5 ml roztworu GNP/PKCi do kuwety akrylowej. Umieść kuwetę akrylową na spektrofotometrze UV-Vis i przetestuj absorpcję pików15.</li>
</ol>

<ol><li>Yusen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation%3A+thirty-first+adult+lung+and+heart-lung+transplant+report--2014%3B+focus+theme%3A+retransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).</li>
<li>Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+graft+dysfunction%3A+definition%2C+risk+factors%2C+short-+and+long-term+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Respiratory+and+Critical%22%5BJournal%5D)">Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes.</a> Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).</li>
<li>Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-related+mechanosignaling+with+lung+ischemia%3A+lessons+from+basic+research+can+inform+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).</li>
<li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+delta-protein+kinase+C+protects+against+reperfusion+injury+of+the+ischemic+heart+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo.</a> Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).</li>
<li>Lincoff, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+delta-protein+kinase+C+by+delcasertib+as+an+adjunct+to+primary+percutaneous+coronary+intervention+for+acute+anterior+ST-segment+elevation+myocardial+infarction%3A+results+of+the+PROTECTION+AMI+Randomized+Controlled+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial.</a> European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deltaV1-1+Reduces+Pulmonary+Ischemia+Reperfusion-Induced+Lung+Injury+by+Inhibiting+Necrosis+and+Mitochondrial+Localization+of+PKCdelta+and+p53%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Lin, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derangements+of+post-ischemic+cerebral+blood+flow+by+protein+kinase+C+delta%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta.</a> Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).</li>
<li>Lin, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+delta+modulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+after+cardiac+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest.</a> Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).</li>
<li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-tat+protein+is+a+heparin-binding+angiogenic+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor.</a> Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).</li>
<li>Kim, H., Moodley, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+cell-penetrating+peptide+modulates+inflammatory+response+and+apoptosis+in+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells.</a> Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).</li>
<li>Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+effects+of+Tat+cell-penetrating+peptide%3A+a+multifunctional+Trojan+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse.</a> Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).</li>
<li>Auffan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+definition+of+inorganic+nanoparticles+from+an+environmental%2C+health+and+safety+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective.</a> Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).</li>
<li>Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+in+delivery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles in delivery applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).</li>
<li>Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+cellular+uptake+of+physiologically+stable+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+with+single+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+delivery+of+a+rationally+designed+intracellular+peptide+drug+with+gold+nanoparticle-peptide+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids.</a> Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).</li>
<li>Cheng, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnologies+for+biomolecular+detection+and+medical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).</li>
<li>Rosi, N. L., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructures+in+biodiagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanostructures in biodiagnostics.</a> Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).</li>
<li>Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+in+chemical+and+biological+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles in chemical and biological sensing.</a> Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).</li>
<li>Boisselier, E., Astruc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+in+nanomedicine%3A+preparations%2C+imaging%2C+diagnostics%2C+therapies+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity.</a> Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid-Dependent+Attenuation+of+Toll-like+Receptor+Signaling+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+pH+modulation+by+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+enables+potent+anti-inflammatory+activity+in+phagocytic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells.</a> Biomaterials. 111, 90-102 (2016).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Structure+Determines+the+Immune+Responses+Generated+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+%26+Particle+Systems+Characterization%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).</li>
<li>Pamies, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+behaviour+of+gold+nanoparticles+in+saline+aqueous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media.</a> Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).</li>
<li>Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediating+tumor+targeting+efficiency+of+nanoparticles+through+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design.</a> Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).</li>
<li>Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+are+taken+up+by+human+cells+but+do+not+cause+acute+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity.</a> Small. 1 (3), 325-327 (2005).</li>
<li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+Hydrophobic+Drugs+in+Nanoparticle+Monolayers+with+Efficient+Release+into+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360(2009).</li>
<li>Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+colloidal+gold+nanoparticles+after+intravenous+administration%3A+Effect+of+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B-Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size.</a> Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).</li>
<li>Balasubramanian, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+gold+nanoparticles+and+gene+expression+changes+in+the+liver+and+spleen+after+intravenous+administration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats.</a> Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).</li>
<li>Lipka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+PEG-modified+gold+nanoparticles+following+intratracheal+instillation+and+intravenous+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection.</a> Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia na temat tego projektu.

Aby zapewnić prawidłowe sformułowanie, ważne jest, aby roztwór δPKCi został poddany etapowi sonikacji opisanemu w ppkt 1.6. Sekwencja peptydu δPKCi zawiera ugrupowania hydrofobowe, więc sonikator pomaga w rozpuszczaniu PKCi w 50% roztworze acetonitrylu. Ponadto bardzo ważne jest dokładne wymieszanie rozpuszczalnika, jak opisano w kroku 2.7. Hybryda GNP/PKCi nie będzie dobrze sformułowana, jeśli te kroki nie zostaną wykonane prawidłowo, ze względu na agregację peptydu δPKCi23.   Preparaty...

Przeszczep płuc ratuje pacjentów ze schyłkową fazą choroby płuc1. Przeszkodą pozostają jednak poważne powikłania po przeszczepie płuc. We wczesnych stadiach po przeszczepieniu płuc pierwotna dysfunkcja przeszczepu jest najbardziej szkodliwym powikłaniem1, a jej główną przyczyną jest ostre uszkodzenie płuc wywołane niedokrwieniem i reperfuzją (IR)2.
Pod wpływem zimna, metabolizm w płucach dawcy jest ograniczony do bardzo niskiego poziomu. Jednak reaktywne formy tlenu i synteza tlenku azotu są aktywowane z powodu ustania przepływu krwi3. Po przeszczepie zostaje przywrócone krążenie krwi, a reaktywne formy tlenu i tlenek azotu powstające podczas zimnego niedokrwienia nasilają stan zapalny i śmierć komórek, powodując uszkodzenie tkanek.
Aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym przez IR, w sercu, mózgu i płucach zastosowano inhibitor kinazy białkowej Cδ (PKCδi)4,5,6,7,8. Badania te wykazały, że PKCδi zmniejsza stan zapalny i apoptozę podczas reperfuzji. Zapobiegło to również uszkodzeniom płuc w podczerwieni u szczurów i w modelu przeszczepu płuc6. PKCδi jest zwykle sprzężony z peptydem penetrującym komórkę, TAT, w celu dostarczania wewnątrzkomórkowego. Wykazano jednak, że sam peptyd TAT ma niespecyficzne działanie biologiczne, w tym promowanie angiogenezy, apoptozy i hamowanie wielu cytokin9,10,11. Nanocząstki, małe cząstki o średnicy od 1 do 100 nm12, zostały zbadane jako kandydaci ułatwiający dostarczanie leków13. W szczególności nanocząstki złota (GNP) są uważane za nieinwazyjne i nietoksyczne. W związku z tym opracowaliśmy GNP jako nośniki dostarczające leki na bazie peptydów14,15.
Powierzchnią GNP można manipulować pod kątem konkretnych zastosowań, takich jak rozpoznawanie molekularne16,17, chemical sensing18, imaging19 i dostarczanie leków. Opracowano hybrydowy system GNP/peptyd, zawierający 20 nm GNP i dwa krótkie peptydy (P2: CAAAAE i P4: CAAAAW) w stosunku 95:5, w celu modyfikacji właściwości powierzchniowych GNP. Peptyd P2, z ujemnie naładowanym kwasem glutaminowym (E) na końcu, stabilizuje GNP w roztworze wodnym, a peptyd P4, z hydrofobowym tryptofanem (W) na końcu, pomaga GNP wejść do komórek14. Reszta cysteiny (C) na końcu N tych peptydów zawiera grupę tiolową, która może być sprzężona ze złotymi powierzchniami14. Ta hybryda peptydu i GNP została następnie wykorzystana do dostarczenia PKCδi (CSFNSYELGSL). Zoptymalizowany stosunek molowy P2:P4 do PKCδi wynosi 47,5:2,5:50. GNP sprzężone z PKCδi (GNP/PKCi) są stabilne w wodzie destylowanej, 0,9% NaCl i PBS zawierającej albuminę bydlęcą lub płodową surowicę bydlęcą14. Wykazano, że dożylne wstrzyknięcie GNP/PKCi zapobiega uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnemu płuc15. W artykule przedstawiono metodę formułowania PNB/PKCi oraz opisano sposób oceny właściwości fizykochemicznych PNB/PKCi. Użyliśmy podobnych metod do sformułowania innych leków na bazie peptydów skoniugowanych z GNP20,21,22. Mamy nadzieję, że ten artykuł zwróci większą uwagę na ten nowatorski preparat do wewnątrzkomórkowego dostarczania leków.

<table><tbody><tr><td>ujemnie naładowany peptyd kwasu glutaminowego (P2)</td><td>CanPeptide</td><td></td><td>Sekwencja: CAAAAE-NH2 Długość: 6aa Modyfikacja: C-końcowe amidowanie Ilość: 50 mg Czystość: >95%</td></tr> <tr><td>hydrofobowy peptyd tryptofanu (P4)</td> <td>CanSekwencja peptydów</td><td></td><td>: CAAAAW-NH2 Długość: 6aa Modyfikacja: C-końcowe amidacja Ilość: 50mg Czystość: >95%</td></tr><tr><td>&delta; Peptyd PKCi</td><td>CanPeptide</td><td></td><td>Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Długość: 11aa Modyfikacja: C-końcowe amidowanie Ilość: 50 mg Czystość: > 95%</td></tr> <tr><td>Rurka stożkowa (50 ml)</td> <td>Corning Life Sciences</td><td>3582070</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa (15 ml)</td> <td>Corning Life Sciences</td><td>3582096</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Branson Ultrasonics Corp.</td><td>Branson 2510MTH</td><td></td></tr><tr><td>Microtube</td><td>Diamed.ca</td><td>AD 150-N</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nanocząstek złota</td><td>Ted Pella</td><td>15705-5</td><td>Wielkość cząstek to 20nm</td></tr><tr><td>Wytrząsarka z platformą kołyszącą</td><td>VWR international</td><td>40000-304&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta akrylowa</td><td>SARSREDT</td><td>67.758</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Agilent</td><td>Caty 60 UV-Vis</td><td></td></tr></tbody></table>

preparat peptydowy inhibitora kinazy białkowej c-delta wykorzystujący nanocząstki złota

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Inhibitor kinazy białkowej C-delta (PKCδi) jest obiecującym lekiem zapobiegającym uszkodzeniom narządów wywołanym niedokrwieniem. Zwykle jest sprzężony z peptydem penetrującym komórkę, TAT, w celu dostarczania wewnątrzkomórkowego. Jednak TAT wykazał niespecyficzną aktywność biologiczną. Nanocząstki złota (GNP) mogą być stosowane jako nośniki leków bez rozpoznanej toksyczności. Dlatego użyliśmy hybrydy GNP/peptyd do dostarczenia PKCδi. Dwa krótkie peptydy (P2: CAAAAE i P4: CAAAAW), w stosunku 95:5, użyto do modyfikacji właściwości powierzchni GNP. GNP sprzężone z PKCδi (GNP/PKCi) są stabilne w wodzie destylowanej, 0,9% NaCl i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej albuminę surowicy bydlęcej lub płodową surowicę bydlęcą. Wcześniej wykazano, że dożylne wstrzyknięcie GNP-PKCi zapobiega uszkodzeniu płuc spowodowanemu niedokrwieniem i reperfuzją. W artykule przedstawiono protokół formułowania PNB/PKCi i oceny właściwości fizykochemicznych PNB/PKCi. Użyliśmy podobnych metod do sformułowania innych leków opartych na peptydach z GNP. Mamy nadzieję, że ten artykuł zwróci większą uwagę na tę nowatorską technologię wewnątrzkomórkowego dostarczania leków i jej zastosowania in vivo.

Należy zwrócić szczególną uwagę na ocenę właściwości biofizycznych hybrydy GNP/PKCi, ponieważ GNP wykazują tendencję do agregacji w rozpuszczalniku. W przypadku agregacji GNP kolor roztworu zmienia się z różowego na fioletowy (Rysunek 1a). Spektrofotometr UV-Vis pozwala na bardziej czułe wykrycie tych zmian. Jeśli GNP/PKCi nie uległy agregacji, maksimum absorpcji powinno znajdować się przy 525 nm (Rysunek 1b). W przypadku agregac...

Wcześniej używaliśmy hybrydy peptydowej z nanocząsteczkami złota, aby dożylnie dostarczyć syntetyczny peptyd, inhibitor kinazy białkowej C-delta, który zmniejszył ostre uszkodzenie płuc wywołane niedokrwieniem i reperfuzją. Tutaj pokazujemy szczegółowy protokół formuły leku. Inne peptydy wewnątrzkomórkowe mogą być formułowane w podobny sposób.

Preparat peptydowy inhibitora kinazy białkowej C-delta wykorzystujący nanocząstki złota

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Nasz unikalny system dostarczania leków, który wykorzystuje 20-nanometrowe cząsteczki złota w dwóch określonych krótkich peptydach, może stabilizować nanocząsteczki złota w roztworze fizjologicznym i zwiększać jego wychwyt komórkowy, a tym samym skutecznie dostarczać do komórek leki na bazie peptydów lub inne. Nasza hybryda peptydu GNP jest łatwa do syntezy i stabilna. Stosując hybrydę peptydową z nanocząstkami złota jako nośniki leków, możemy skutecznie i w obfitości przenosić leki peptydowe do komórek.Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny w płucach leczyliśmy naszą hybrydą GNP/PKCi. GNP wprowadza peptydy inhibitora PKC do cytoplazmy. Ta metoda podawania była w stanie zmniejszyć poważniejsze uszkodzenie płuc przy użyciu mniejszej dawki PKCi niż inne metody podawania.Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij peptydy z zamrażarki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozmroź je w temperaturze pokojowej. Użyj mikrowagi, aby zważyć 0,01 grama każdego rozmrożonego peptydu i przenieś każdy peptyd do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 18,74 mililitra wody dejonizowanej do probówki P2 i 16,93 mililitra wody dejonizowanej do probówki P4.Dodaj 8,21 mililitra 50% acetonitrylu rozcieńczonego w wodzie dejonizowanej do probówki inhibitora PKC delta. Krótko odwiruj roztwory peptydów. Następnie umieść probówki w sonikatorze o częstotliwości 40 megaherców na pięć minut.Następnie przenieś roztwory do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Bardzo ważne jest, aby umieścić stożkową probówkę o pojemności 50 ml w sonikatorze na pięć minut. Jeżeli ten krok zostanie pominięty, PNB/PKCi utworzą agregacje.Przenieś jeden mililitr każdego roztworu peptydu do własnej nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 19 mililitrów wody dejonizowanej do probówek zawierających P2 i P4. I dodaj 19 mililitrów 50% acetonitrylu do probówki zawierającej inhibitor PKC delta. Dodać 475 mililitrów roztworu P2, 25 mikrolitrów roztworu P4, 500 mikrolitrów roztworu inhibitora PKC delta do 15-mililitrowej probówki.Następnie dodaj dziewięć mililitrów 20-nanometrowego roztworu GNP do tej samej probówki. Wyjmij połączony roztwór z komory bezpieczeństwa biologicznego i zawiń probówkę w folię aluminiową. Umieść probówkę na shakerze na noc.Następnego dnia należy zwrócić próbki do komory bezpieczeństwa biologicznego. Przenieść jedną mililitrową porcję roztworu GNP/PKCi do mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować mikroprobówki w mikrowirówce o temperaturze 15294 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.Przenieś mikroprobówki z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego i usuń supernatent z każdej probówki, upewniając się, że granulki GNP nie są naruszone. Ponownie zawiesić każdą osadkę w żądanym rozpuszczalniku zgodnie z wymaganym stężeniem. Aby ocenić rozpuszczalność hybrydy GNP/PKCi, należy wlać 0,5 mililitra roztworu GNP/PKCi do kuwety memoriałowej.Umieść kuwetę na spektrofotometrze UV-Vis i przetestuj absorpcję pików. W tym badaniu inhibitor kinazy białkowej C-delta jest sprzężony z nanocząstkami złota, tworząc hybrydę GNP / PKCi. Należy zachować ostrożność przy ocenie właściwości biofizycznych hybrydy, ponieważ nanocząstki złota mają tendencję do agregacji w rozpuszczalniku.Gdy nanocząstki się agregują, kolor roztworu zmieni się z różowego na fioletowy. Próbki są analizowane za pomocą spektrofotometru UV-Vis, który jest w stanie wykryć z dużą czułością. Jeśli hybryda nie jest zagregowana, szczyt absorpcji powinien przypadać na 525 nanometrów.Jeśli PNB zostanie zagregowany, szczyt absorpcji zostanie przesunięty w prawo. Jak widać, gdy uformują się agregaty, gęstość optyczna delta maleje. Podczas formułowania hybryd peptydów GNP ważne jest, aby pamiętać, że stosunek peptydów do roztworu GNP powinien wynosić od jednego do dziewięciu.Ta formuła GNP / PKCi może być stosowana w przypadku uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w układach narządowych innych niż płuca. Wszelkie peptydy mogą przyłączać się do GNP, jeśli peptydy te mają resztę cysteiny na N-końcu. Oznacza to, że hybryda peptydu GNP może być używana do transportu innych leków peptydowych do komórki.Racjonalnie zaprojektowane peptydy to nowa technologia, która może wprowadzić określoną interakcję białko-białko do wnętrza tych komórek. Technika ta, opracowana tutaj, może być stosowana do dostarczania nowych leków peptydowych lub zmodyfikowanych wersji istniejących leków.

protein-kinase-c-delta-inhibitor-peptide-formulation-using-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowano system inżynieryjnych nanonośników na bazie żelatyny typu B (GENS) do systemowego dostarczania genów i transfekcji w leczeniu raka trzustki. Dzięki modyfikacji powierzchni nanocząstek specyficznym peptydem do receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), nanonośniki te mogą celować w receptor EGFR i uwalniać plazmid w środowisku redukującym, takim jak wysokie wewnątrzkomórkowe stężenia glutationu.

Terapeutyczna dostawa genów i transfekcja w ludzkich komórkach raka trzustki z wykorzystaniem nanocząstek żelatynowych celowanych w receptor epidermalnego czynnika wzrostu

Opisujemy implementację strategii REPLACE do celowania w interakcje białko-białko. REPLACE to iteracyjna strategia obejmująca podejścia syntetyczne i obliczeniowe w celu przekształcenia zoptymalizowanych inhibitorów peptydowych w cząsteczki podobne do leków.

Opracowanie inhibitorów oddziaływań białko-białko poprzez REPLACE: zastosowanie do projektowania i rozwoju konkurencyjnych inhibitorów CDK niebędących ATP

Pokazujemy przygotowanie i zajmujemy się wykonalnością nośników komórkowych zawierających złote nanopręty do fotoakustycznego obrazowania raka.

Przygotowanie i analiza fotoakustyczna nośników komórkowych zawierających nanopręty złota

Sygnalizacja receptora Toll-podobnego (TLR) odgrywa ważną rolę w patofizjologii wielu chorób zapalnych u ludzi, a regulacja odpowiedzi TLR przez bioaktywne nanocząstki jest korzystna w wielu stanach zapalnych. Komórki reporterowe oparte na komórkach THP-1 stanowią wszechstronną i solidną platformę przesiewową do identyfikacji nowych inhibitorów sygnalizacji TLR.

Badania przesiewowe bioaktywnych nanocząstek w fagocytarnych komórkach odpornościowych pod kątem inhibitorów sygnalizacji receptora toll-podobnego

Opisujemy metodę syntezy biokompatybilnych nanocząsteczek złota 10 nm, funkcjonalizowanych przez powlekanie powierzchni glikolu polietylenowego. Cząstki te mogą być wykorzystywane in vitro i in vivo do dostarczania środków terapeutycznych do nanoskalowych przestrzeni komórkowych i zewnątrzkomórkowych, które są trudno dostępne przy konwencjonalnych rozmiarach nanocząstek.

Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Ten protokół opisuje skuteczną metodę syntezy nanoemulsji koniugatu kwasów oleinowych i platyny(II) stabilizowanego tripeptydem lizyna-tyrozyna-fenyloalanina (KYF). Nanoemulsja powstaje w łagodnych warunkach syntetycznych poprzez samoorganizację KYF i koniugatu.

Stabilizowana tripeptydem nanoemulsja kwasu oleinowego

W tym protokole, nanocząstki złota modyfikowane doksorubicyną AS1411-g-PEI-g-PEG są syntetyzowane w trzyetapowych reakcjach amidowych. Następnie doksorubicyna jest ładowana i dostarczana do docelowych komórek rakowych w celu terapii przeciwnowotworowej.

Synteza nanocząstek złota modyfikowanych aptamerem-PEI-g-PEG obciążonych doksorubicyną w celu celowanego dostarczania leków

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

To badanie opracowało nieinwazyjną metodę oceny rozkładu programowanego ligandu śmierci 1 w całym ciele, na podstawie obrazowania tomograficznego emisji pozytonów antagonisty D-dodekapeptydu [68Ga]. Technika ta ma przewagę nad konwencjonalną immunohistochemią i poprawia skuteczność identyfikacji odpowiednich pacjentów, którzy odniosą korzyści z terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne.

Opracowanie znacznika PET znakowanego 68galem peptydu D do obrazowania ekspresji programowanego ligandu śmierci 1

Niniejszy artykuł opisuje metodę nanoprecypitacji do syntezy nanocząsteczek polimerowych z wykorzystaniem kopolimerów diblokowych. Omówimy syntezę kopolimerów diblokowych, technikę nanoprecypitacji oraz potencjalne zastosowania.

Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Poznaj metodę syntezy hybryd nanocząstek złota z peptydami inhibitora kinazy białkowej C-delta. System ten zwiększa wchłanianie komórkowe i stabilność leków, umożliwiając skuteczne leczenie uszkodzenia płuc przy niższych dawkach.

Preparat peptydowy inhibitora kinazy białkowej C-delta wykorzystujący nanocząstki złota

Przeglądaj więcej filmów