Preparat peptydowy inhibitora kinazy białkowej C-delta wykorzystujący nanocząstki złota
9 marca 2019
Wcześniej używaliśmy hybrydy peptydowej z nanocząsteczkami złota, aby dożylnie dostarczyć syntetyczny peptyd, inhibitor kinazy białkowej C-delta, który zmniejszył ostre uszkodzenie płuc wywołane niedokrwieniem i reperfuzją. Tutaj pokazujemy szczegółowy protokół formuły leku. Inne peptydy wewnątrzkomórkowe mogą być formułowane w podobny sposób.
Nasz unikalny system dostarczania leków, który wykorzystuje 20-nanometrowe cząsteczki złota w dwóch określonych krótkich peptydach, może stabilizować nanocząsteczki złota w roztworze fizjologicznym i zwiększać jego wychwyt komórkowy, a tym samym skutecznie dostarczać do komórek leki na bazie peptydów lub inne. Nasza hybryda peptydu GNP jest łatwa do syntezy i stabilna. Stosując hybrydę peptydową z nanocząstkami złota jako nośniki leków, możemy skutecznie i w obfitości przenosić leki peptydowe do komórek.
Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny w płucach leczyliśmy naszą hybrydą GNP/PKCi. GNP wprowadza peptydy inhibitora PKC do cytoplazmy. Ta metoda podawania była w stanie zmniejszyć poważniejsze uszkodzenie płuc przy użyciu mniejszej dawki PKCi niż inne metody podawania.
Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij peptydy z zamrażarki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozmroź je w temperaturze pokojowej. Użyj mikrowagi, aby zważyć 0,01 grama każdego rozmrożonego peptydu i przenieś każdy peptyd do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 18,74 mililitra wody dejonizowanej do probówki P2 i 16,93 mililitra wody dejonizowanej do probówki P4.
Dodaj 8,21 mililitra 50% acetonitrylu rozcieńczonego w wodzie dejonizowanej do probówki inhibitora PKC delta. Krótko odwiruj roztwory peptydów. Następnie umieść probówki w sonikatorze o częstotliwości 40 megaherców na pięć minut.
Następnie przenieś roztwory do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Bardzo ważne jest, aby umieścić stożkową probówkę o pojemności 50 ml w sonikatorze na pięć minut. Jeżeli ten krok zostanie pominięty, PNB/PKCi utworzą agregacje.
Przenieś jeden mililitr każdego roztworu peptydu do własnej nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 19 mililitrów wody dejonizowanej do probówek zawierających P2 i P4. I dodaj 19 mililitrów 50% acetonitrylu do probówki zawierającej inhibitor PKC delta. Dodać 475 mililitrów roztworu P2, 25 mikrolitrów roztworu P4, 500 mikrolitrów roztworu inhibitora PKC delta do 15-mililitrowej probówki.
Następnie dodaj dziewięć mililitrów 20-nanometrowego roztworu GNP do tej samej probówki. Wyjmij połączony roztwór z komory bezpieczeństwa biologicznego i zawiń probówkę w folię aluminiową. Umieść probówkę na shakerze na noc.
Następnego dnia należy zwrócić próbki do komory bezpieczeństwa biologicznego. Przenieść jedną mililitrową porcję roztworu GNP/PKCi do mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować mikroprobówki w mikrowirówce o temperaturze 15294 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.
Przenieś mikroprobówki z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego i usuń supernatent z każdej probówki, upewniając się, że granulki GNP nie są naruszone. Ponownie zawiesić każdą osadkę w żądanym rozpuszczalniku zgodnie z wymaganym stężeniem. Aby ocenić rozpuszczalność hybrydy GNP/PKCi, należy wlać 0,5 mililitra roztworu GNP/PKCi do kuwety memoriałowej.
Umieść kuwetę na spektrofotometrze UV-Vis i przetestuj absorpcję pików. W tym badaniu inhibitor kinazy białkowej C-delta jest sprzężony z nanocząstkami złota, tworząc hybrydę GNP / PKCi. Należy zachować ostrożność przy ocenie właściwości biofizycznych hybrydy, ponieważ nanocząstki złota mają tendencję do agregacji w rozpuszczalniku.
Gdy nanocząstki się agregują, kolor roztworu zmieni się z różowego na fioletowy. Próbki są analizowane za pomocą spektrofotometru UV-Vis, który jest w stanie wykryć z dużą czułością. Jeśli hybryda nie jest zagregowana, szczyt absorpcji powinien przypadać na 525 nanometrów.
Jeśli PNB zostanie zagregowany, szczyt absorpcji zostanie przesunięty w prawo. Jak widać, gdy uformują się agregaty, gęstość optyczna delta maleje. Podczas formułowania hybryd peptydów GNP ważne jest, aby pamiętać, że stosunek peptydów do roztworu GNP powinien wynosić od jednego do dziewięciu.
Ta formuła GNP / PKCi może być stosowana w przypadku uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w układach narządowych innych niż płuca. Wszelkie peptydy mogą przyłączać się do GNP, jeśli peptydy te mają resztę cysteiny na N-końcu. Oznacza to, że hybryda peptydu GNP może być używana do transportu innych leków peptydowych do komórki.
Racjonalnie zaprojektowane peptydy to nowa technologia, która może wprowadzić określoną interakcję białko-białko do wnętrza tych komórek. Technika ta, opracowana tutaj, może być stosowana do dostarczania nowych leków peptydowych lub zmodyfikowanych wersji istniejących leków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorski system dostarczania leków wykorzystujący hybrydy nanocząsteczek złota i peptydów do skutecznego dostarczania inhibitorów kinazy białkowej C-delta w celu redukcji ostrego uszkodzenia płuc indukowanego reperfuzją po niedokrwieniu. Metoda ta zwiększa pobieranie komórkowe oraz stabilność peptydów, co umożliwia skuteczne leczenie przy zastosowaniu niższych dawek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Systemy dostarczania leków
- Nanotechnologia
- Leczenie ostrego uszkodzenia płuc
Wstęp
- Nanocząsteczki złota mogą stabilizować peptydy w roztworach fizjologicznych.
- Leki oparte na peptydach często napotykają trudności w dostarczaniu do komórek.
- Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne jest istotną przyczyną uszkodzeń płuc.
- Skuteczne metody dostarczania leków mogą poprawić wyniki leczenia.
Cel badania
- Opracowanie stabilnego i skutecznego systemu dostarczania leków z wykorzystaniem hybryd nanocząsteczek złota i peptydów.
- Wykazanie skuteczności tego systemu w leczeniu uszkodzeń płuc.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu syntezy formulacji leku.
Zastosowane metody
- Synteza hybryd peptydowych z nanocząsteczkami złota.
- Dożylne podanie hybrydy do komórek docelowych w płucach.
- Ocena poboru komórkowego i stabilności w warunkach fizjologicznych.
- Ocena skuteczności leczenia w modelach urazu niedokrwienno-reperfuzyjnego.
Główne wyniki
- Hybryda GNP/PKCi skutecznie dostarczyła leki peptydowe do komórek.
- Niższe dawki PKCi doprowadziły do zmniejszenia uszkodzenia płuc w porównaniu z innymi metodami.
- System wykazał wysoką stabilność i łatwość syntezy.
- Zwiększone pobieranie komórkowe zostało potwierdzone w analizie eksperymentalnej.
Wnioski
- Hybryda peptydu z nanocząsteczkami złota jest obiecującym systemem dostarczania leków.
- Metoda ta może znacząco poprawić leczenie ostrego uszkodzenia płuc.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowania na inne leki oparte na peptydach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Hybrydy peptydowe na bazie nanocząstek złota (GNP) stanowią modułową platformę do wewnątrzkomórkowego dostarczania inhibitorów peptydowych, rozwiązując kluczowe problemy związane ze stabilnością i poborem komórkowym. Technologia ta umożliwia precyzyjne dostarczanie racjonalnie zaprojektowanych peptydów, wspierając wczesną walidację celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków. Jej adaptacyjność w odniesieniu do różnych ładunków peptydowych sprawia, że jest ona narzędziem wielokrotnego użytku w badaniach translacyjnych w obrębie całego portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę celów wewnątrzkomórkowych przy użyciu inhibitorów peptydowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie wydajnego dostarczania cząsteczek kandydackich do cytoplazmy.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu dzięki ilościowym ocenom poboru i stabilności.
Przesiewanie i opracowanie analizy
- Zapewnia standaryzowaną platformę do przygotowywania koniugatów peptyd-GNP o powtarzalnych właściwościach fizykochemicznych.
- Umożliwia ilościową ocenę agregacji nanocząsteczek i dostarczania peptydów za pomocą spektrofotometrii UV-Vis.
- Wspiera skalowalność testów i ponowne wykorzystanie platformy dla różnych sekwencji peptydowych z resztami cysteiny na N-końcu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Demonstruje dostarczanie in vivo i skuteczność w modelach uszkodzeń narządów, co wspiera ciągłość translacyjną.
- Umożliwia adaptację dla innych układów narządowych oraz terapeutyków opartych na peptydach, zgodnie z kompatybilnością fizykochemiczną.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne dzięki możliwości zastosowania niższych dawek i minimalizacji efektów pozacelowych w porównaniu z tradycyjnymi nośnikami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta hybrydowa formulacja GNP-peptyd łączy etapy wczesnego odkrywania, identyfikacji wiodących cząsteczek oraz walidacji przedklinicznej, umożliwiając skuteczne dostarczanie wewnątrzkomórkowe i ilościową charakterystykę terapeutyków peptydowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez efektywne dostarczanie funkcjonalnych peptydów do wnętrza komórek.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty stabilności nanocząsteczek oraz konjugacji peptydów.
- Analityka: Wykorzystuje spektrofotometrię UV-Vis do czułej detekcji agregacji i wydajności dostarczania.
- Badania translacyjne: Wykazuje przydatność in vivo oraz możliwość adaptacji do wielu układów narządowych.
- Zastosowania w przemyśle: Oferuje uniwersalną platformę dostarczania dla szerokiego zakresu kandydatów na leki oparte na peptydach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji wewnątrzkomórkowych celów oraz w badaniach mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy dostarczania peptydów i zwiększa powtarzalność badań w zespołach B+R.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji go/no-go z uwzględnieniem ryzyka dzięki zapewnieniu skutecznego dostarczania i analityki ilościowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację terapii peptydowych o poprawionym dostarczaniu i zredukowanym ryzyku efektów pozacelowych.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie syntezy nanocząsteczek oraz chemii koniugacji peptydów.
- Wymagany jest dostęp do aparatury analitycznej, takiej jak spektrofotometry UV-Vis, w celu oceny agregacji.
- Konieczna jest standaryzacja stosunków peptyd do GNP oraz warunków rozpuszczalnika pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana do peptydów z resztami cysteiny na N-końcu, co zapewnia szerokie zastosowanie.
- Ryzyko agregacji musi być kontrolowane poprzez ścisłe przestrzeganie protokołu oraz monitorowanie parametrów fizykochemicznych.
