Wykorzystanie Escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy

W protokole tym zademonstrowano prostą i możliwą do wytworzenia metodę oceny zdolności makrofagów do fagocytozy przy użyciu Escherichia coli wykazującej ekspresję EGFP. Cześć, nazywam się Jun-Yu i pracuję w Drugim Szpitalu Uniwersytetu Medycznego w Dalian. Dzisiaj pokażemy Ci łatwy i zobrazujemy sposób oceny fagocytozy makrofagów, który można łatwo wykonać w ciągu dwóch godzin.

Metoda ta była szeroko stosowana w badaniach nad wrodzoną funkcją immunologiczną. Uważa się, że wrodzona funkcja immunologiczna pozostała nienaruszona u osób starszych. Tak więc dzisiaj zamierzamy wyizolować makrofagi otrzewnowej od starszych i młodych myszy i zobaczyć zdolność fagocytarną tych dwóch grup.

Cóż, zacznijmy. Po pierwsze, zsyntetyzuj fragment genu EGFP i sklonuj go za pomocą polimerazy DNA Taq o wysokiej wierności. Następnie podwiązać produkt PCR do wektora pET SUMO.

Po trzecie, przekształć produkty podwiązania w szczep E. coli i indukować ekspresję EGFP za pomocą laktozy. Te E. coli z ekspresją EGFP służyły jako marker do testu fagocytozy. Następnie wyizolowano i wyhodowano makrofagi otrzewnej myszy.

Następnie E. coli wykazujące ekspresję EGFP były inkubowane z makrofagami przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po etapie wygaszania makrofagi były gotowe do oceny zarówno za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, jak i cytometru przepływowego. Zsyntetyzuj fragment genu EGFP i amplifikuj go starterami do przodu i do tyłu przy użyciu polimerazy DNA Taq o wysokiej wierności.

Aby upewnić się, że produkty PCR miały pojedyncze trójkońcowe zwisy adeniny do klonowania TA w następnym kroku, zaleca się 30-minutowe przedłużenie o 72 stopnie Celsjusza po ostatnim cyklu. Sprawdź produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Jeśli fragment został prawidłowo amplifikowany, na żelu można zaobserwować pasmo 717 pz.

Sklonuj produkt PCR do wektora pET SUMO przy użyciu metody klonowania TA z ligazą DNA T4. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj pięć mikrolitrów produktu PCR do 100 mikrolitrów kompetentnych komórek BL21.

Szok cieplny komórek w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 90 sekund, a następnie trzymaj mieszaninę na lodzie przez trzy minuty. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki LB, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Potrząsanie przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min.

Zaszczepić bakterie na powierzchni płytki LB 100 mikrogramami na mililitr kanamycyny, aby przesiać E. coli przekształconą w wektor. Inkubuj talerz w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia zaszczepić dodatnią kolonię w pięciu mililitrach pożywki LB ze 100 mikrogramami na mililitr kanamycyny.

Inkubować w inkubatorze wytrząsającym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 120 obr./min przez dwie godziny. Następnie dodaj laktozę induktora do końcowego stężenia 0,5 milimola na litr i kontynuuj wstrząsanie przez sześć godzin, wywołując ekspresję EGFP. Empirycznie, podczas wstrząsania przez sześć godzin, OD600 może osiągnąć 0,7 lub więcej.

Na koniec za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu sprawdzenia stopnia ekspresji EGFP. Dodać 10 mikrolitrów pożywki bakteryjnej do szkiełka. Następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym.

Zbadaj ekspresję EGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dodaj 3,5 grama tioglikolanu do 100 mililitrów wody destylowanej. Przed użyciem wysterylizować w autoklawie.

Odessać podłoże tioglikolanowe do jednomililitrowej sterylnej strzykawki w kapturze. Jedna mysz na strzykawkę, aby uniknąć infekcji. Wstrzyknij jeden mililitr 3,5% pożywki tioglikolanowej do jamy otrzewnej myszy za pomocą igły o rozmiarze 23 i utrzymuj mysz z wodą i jedzeniem ad libitum przez trzy dni.

Po trzech dniach poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po szybkim wywołaniu znieczulenia sewofluranem w zamkniętym pudełku. Następnie włóż mysz do naczynia z 75% etanolem do sterylizacji i szybko przenieś do kaptura. Umieść mysz na talerzu i przypnij przednią łapę do tablicy, aby ustalić pozycję myszy.

Za pomocą pięciomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 20 wstrzyknij pięć mililitrów zimnego PBS w dolną część brzucha do jamy otrzewnowej myszy, unikając nakłuwania jelita. Wykonaj delikatny masaż po dwóch stronach brzucha myszy. Następnie delikatnie i powoli odessaj płyn brzuszny.

Dozuj płyn otrzewnowy do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Powtórz te kroki dwa lub trzy razy. Odwirować zawieszone komórki przez 10 minut w temperaturze 400 g w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą. Dodaj pięć milionów komórek do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do testu cytometrii przepływowej i 500 000 komórek na studzienkę do 24-dołkowej płytki do mikroskopu fluorescencyjnego. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez noc.

Pożywkę hodowlaną można odświeżyć po trzech godzinach, aby usunąć nieprzylegające komórki, ponieważ większość z nich to limfocyty. Obserwuj komórki pod mikroskopem jasnego pola, aby ocenić żywotność komórek i gęstość komórek. Pokazany tutaj obraz był w normalnym stanie komórki pierwotnej.

Zwykle gęstość komórek makrofagów nie była wysoka, ponieważ większość komórek otrzewnej stanowiły limfocyty. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 24-dołkowej. Dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej i 10 mikrolitrów pożywki bakteryjnej.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Umyj delikatnie 500 mikrolitrami zimnego PBS na studzienkę trzy do pięciu razy, aby wypłukać niezinternalizowane bakterie. Inkubować komórki z 4% formaldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Umyj komórki trzykrotnie PBS. Dodaj sprzężony roztwór roboczy falloidyny 633 do barwienia F-aktyny. Przechowywać w ciemnym, wilgotnym miejscu w temperaturze pokojowej przez 60 minut.

Dodaj roztwór roboczy DAPI, aby zabarwić jądro komórki i inkubować przez pięć minut w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej. Spłucz raz PBS i raz tą samą objętością w wodzie destylowanej. E. coli wykazująca ekspresję EGFP wyświetlana na zielono służyła jako marker fagocytozy.

Aby zminimalizować błędy eksperymentalne i dokonać właściwej interpretacji wyników, należy ustawić grupy i probówki kontrolne dla eksperymentu, jak podano w Tabeli 2. W przypadku grupy kontrolnej, która zostanie umieszczona na lodzie, należy usunąć pożywkę z płytki sześciodołkowej i przemyć ją raz PBS. Następnie dodaj 70 milimoli na litr zimnego EDTA jeden mililitr do studzienki, aby odłączyć komórki i przenieść do probówki cytometrii przepływowej.

Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do probówki i umieść ją na lodzie na godzinę. W przypadku pozostałych grup usuń pożywkę hodowlaną, dodaj jeden mililitr świeżej pożywki do każdej studzienki. Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do studzienek zgodnie z ustawieniem grupy, jak opisano w tabeli drugiej.

Następnie umieść sześciodołkową płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Aby ugasić fluorescencję niezinternalizowanego E. coli, dodaj 200 mikrolitrów 0,8% roztworu wody o stężeniu 0,8% fioletu krystalicznego do studzienki i krótko się kołysz. Ten krok miał na celu uniknięcie fałszywie dodatniego wyniku wiązania się EGFP E. coli z powierzchnią makrofagów, ale nie zinternalizowanego.

Umyj komórki trzykrotnie PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości fioletu krystalicznego. Następnie dodaj 70 milimoli na litr zimnego EDTA jeden mililitr do studzienki, aby odłączyć komórki i przenieść do probówki cytometrii przepływowej. Odwirować probówki z prędkością 2 000 obr./min przez pięć minut i odrzucić supernatant.

Dodaj 100 mikrolitrów PBS, aby ponownie zawiesić ogniwa. Dodaj pięć mikrolitrów sprzężonego przeciwciała F4 ATP do probówek lub izotypu zgodnie z ustawieniem grupy. Krótko wirować i inkubować próbki na lodzie przez pięć do 10 minut w ciemności.

Dodaj jeden mililitr PBS do każdej probówki i odwiruj 2 000 obr./min przez pięć minut. Odrzucić supernatant. Zawiesić granulki komórek za pomocą 200 do 300 mikrolitrów PBS do analizy cytometrii przepływowej.

Uruchom każdą probówkę i uzyskaj dane dla co najmniej 10 000 zdarzeń komórek F4/80-dodatnich. Oto obrazy fluorescencyjne makrofagów otrzewnowej z grup młodych i starszych. Czerwona fluorescencja reprezentuje F-aktynę.

Kolor zielony reprezentuje E. coli wykazujący ekspresję EGFP, a niebieski oznacza jądro wybarwione przez DAPI. Obrazy te sugerują, że makrofagi młodej myszy miały silniejszą zdolność fagocytarną niż te pochodzące od starszej myszy. Komórki F4/80-dodatnie i EGFP-dodatnie wskazywały na zdolność fagocytarną makrofagów.

Wyniki te są zgodne z trendem wyników mikroskopu fluorescencyjnego. Cóż, widzisz, chociaż liczba wrodzonych komórek odpornościowych może zachować się u starzejącej się myszy, zdolność fagocytarna znacznie się zmniejszyła w porównaniu z młodą myszą. Do oceny fagocytozy makrofagów zastosowano wiele metod.

Tutaj pokazujemy ulepszoną metodę, która jest wygodna, szybka i ekonomicznie wykonalna. W przypadku E. coli z ekspresją EGFP test fagocytozy można łatwo przeprowadzić i zmierzyć zarówno za pomocą cytometru przepływowego, jak i mikroskopu fluorescencyjnego, zgodnie z preferencjami badacza. Również ta metoda bezpośrednio mierzy zdolność fagocytarną.

Wyniki są bardziej powtarzalne niż w przypadku innych metod pośrednich.