Name: Wykorzystanie Escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Poznaj metodę oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowych myszy przy użyciu Escherichia coli z ekspresją EGFP. Protokół umożliwia szybką i powtarzalną analizę funkcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 31800046) oraz Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Liaoning (nr 20170540262) wsparły tę pracę. Praca ta została wykonana w laboratoriach Centrum Badań Naukowych w Drugim Szpitalu Uniwersytetu Medycznego w Dalian. Autorzy chcieliby podziękować Xiao-Lin Sang za jej pomoc w cytometrii przepływowej oraz Bo Qu i Dong-Chuan Yangowi za pomoc w produkcji filmu.

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, a protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Dalian. Szesnastomiesięczne (o masie ciała 30-35 g) i ośmiotygodniowe (20-25 g) samce myszy C57BL/6 z filtrem SPF (wolne od specyficznych patogenów) uzyskano z centrum dla zwierząt SPF Uniwersytetu Medycznego w Dalian. Wszystkie myszy trzymano w pomieszczeniach dla zwierząt z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Temperatura była utrzymywana na poziomie 20-24 °C, wilgotność wynosiła 40%-70%, a oświetlenie było 12 godzin światła/12 godzin ciemności. Zwierzętom pozwolono zaaklimatyzować się w środowisku przez co najmniej 7 dni przed eksperymentem.
1. Budowa plazmidu pET-SUMO-EGFP i indukcja ekspresji EGFP
<ol>
	<li>Zsyntetyzować fragment genu EGFP (sekwencja 717 pz zsyntetyzowana przez niestandardową usługę syntezy genów, patrz Tabela materiałów i plik uzupełniający 1 dla sekwencji) i amplifikować fragment za pomocą startera do przodu (5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGC-3') i startera odwrotnego (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), przy użyciu polimerazy DNA Taq o wysokiej wierności.</li>
	<li>Aby upewnić się, że produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) mają pojedyncze 3' zwisy adeniny do klonowania TA w następnym kroku, należy zastosować 30-minutowe przedłużenie w temperaturze 72 °C po ostatnim cyklu (patrz plik uzupełniający 1 dla warunków PCR). Sprawdź produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.</li>
	<li>Sklonuj produkt PCR do wektora pET-SUMO (patrz tabela materiałów) przy użyciu metody klonowania TA5 z ligazą DNA T4. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 30 minut. Wektor jest linearyzowany między nukleotydami 653 i 654 z nawisem T 1 pz 5′ na każdej nici.</li>
	<li>Przekształcić produkt ligacji w chemicznie kompetentny szczep BL21(DE) E. coli w następujący sposób: dodać 5 μl (100 ng) produktu PCR do 100 μl kompetentnych komórek BL21(DE) poprzez szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 90 s; przechowywać mieszaninę na lodzie przez 3 minuty, a następnie dodać 400 μl bulionu lizogenicznego (LB) podgrzanego w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 120 obr./min.</li>
	<li>Inokulować 100 μl bakterii na powierzchni płytki LB-kanamycyny (100 μg/ml) induktorem laktozy (0,5 mmol/l), uzyskując szczep ekspresji EGFP. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc. 
	UWAGA: Jeśli EGFP zostanie pomyślnie wyrażony, niektóre kolonie można zaobserwować jako świecące zielone światło w ciemności.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie wybierz kolonie, aby zweryfikować wstawiony fragment EGFP za pomocą sekwencjonowania DNA. Startery do sekwencjonowania DNA to: forward, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; rewers, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaszczepić dodatnią kolonię w 5 ml pożywki LB za pomocą 100 μg/ml kanamycyny. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przy prędkości 120 obr./min przez 2 godziny, a następnie dodać induktor laktozy do końcowego stężenia 0,5 mmol/l i kontynuować wstrząsanie przez 6 godzin, wywołując ekspresję EGFP. Empirycznie, podczas wytrząsania przez 6 godzin, gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) może osiągnąć 0,7 lub więcej.</li>
	<li>Dodać 10 μl pożywki bakteryjnej na szkiełko podstawowe, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i zbadać ekspresję EGFP pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Bakterie wykazujące ekspresję EGFP mogą być przechowywane w pożywce w temperaturze 2-8 °C przez kilka tygodni.</li>
</ol>
2. Izolacja makrofagów otrzewnowych myszy i hodowla pierwotna
<ol>
	<li>Dodać 3,5 g tioglikolanu do 100 ml wody destylowanej i przed użyciem przelać mieszaninę w autoklawie do sterylności. Przepompować pożywkę tioglikolanową do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml w kapturze do wstrzykiwań otrzewnowych dla myszy. Użyj jednej myszy na strzykawkę, aby uniknąć infekcji. Stosowanie tioglikolanu może zwiększyć liczbę makrofagów. Rezydentne makrofagi otrzewnowe można wyizolować bez tioglikolanu, ale z niższą wydajnością makrofagów.</li>
	<li>Znieczulij mysz metodą zatwierdzoną przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Wstrzyknąć 1 ml 3,5% pożywki tioglikolanowej do jamy otrzewnej myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą igły 23 G. 
	UWAGA: Wywołując znieczulenie, wstrzyknięcie otrzewnowe można łatwo wykonać i zmniejsza ryzyko urazów narządów wewnętrznych spowodowanych wstrzyknięciem.</li>
	<li>Utrzymuj mysz z wodą i jedzeniem ad libitum przez 3 dni. Codziennie monitoruj masę ciała i spożycie pokarmu przez zwierzę. Jeśli utrata masy ciała jest większa niż 10% w ciągu 3 dni, wyklucz zwierzę z eksperymentu.</li>
	<li>Po 3 dniach poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po szybkim wywołaniu znieczulenia sewofluranem w zamkniętym pudełku. Alternatywnie, użyj metody, która została zatwierdzona przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania, aby poddać mysz eutanazji.</li>
	<li>Włóż mysz do naczynia (o średnicy 10 cm) z 75% etanolem do sterylizacji i szybko przenieś do kaptura. Umieść mysz na talerzu i przypnij przednią łapę do tablicy, aby ustalić pozycję myszy.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml przymocowanej do igły o sile 20 g, umieszczając igłę pod kątem 30°-40°, wstrzyknąć 5 ml zimnej (4-10 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w dolnej części brzucha do jamy otrzewnej myszy, unikając nakłuwania jelita. Jeśli jelito (lub jakikolwiek inny narząd) zostanie przebite, mysz i jej komórki nie mogą być już wykorzystywane do eksperymentów, ponieważ może to aktywować komórki, które nie nadają się do pierwotnej hodowli komórek.</li>
	<li>Wykonaj delikatny masaż po obu stronach brzucha myszy. Następnie delikatnie i powoli zasysaj płyn. Dozuj płyn otrzewnowy do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Powtórz te kroki 2x lub 3x.</li>
	<li>Odwirować zawieszone komórki przez 10 minut przy 400 x g w wirówce z chłodzeniem (4-8 °C). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Policz komórki. Empirycznie gęstość komórek jest w przybliżeniu równa 5 x 106 komórek/ml, gdy komórki są ponownie zawieszone w 10 ml pożywki.</li>
	<li>Dodać 5 x 106 komórek do każdej studzienki 6-dołkowej płytki do testu cytometrii przepływowej i 5 x 105 komórek na studzienkę do 24-dołkowej płytki do mikroskopu fluorescencyjnego. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez noc. Pożywkę hodowlaną można odświeżyć po 3 godzinach w celu usunięcia nieprzylegających komórek, ponieważ większość z nich to limfocyty. Przylegające komórki to głównie makrofagi, które mogą dobrze przylegać do plastiku poddanego działaniu kultur tkankowych.</li>
</ol>
3. Test fagocytozy makrofagów przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem jasnego pola, aby ocenić żywotność i gęstość komórek.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 24-dołkowej. Dodać 100 μl świeżej pożywki hodowlanej i 10 μl zawiesiny bakteryjnej (około 2 x 107 komórek) do każdego dołka, jak opisano w tabeli 1. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% emisjiCO2</li>.
	<li>Delikatnie przemyj 3x-5x 500 μl zimnego PBS na studzienkę, aby wypłukać nieinternalizowane bakterie.</li>
	<li>Inkubować komórki z 4% formaldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć stałe komórki 3x PBS (500 μL/studzienkę).</li>
	<li>Dodać 200 μl sprzężonego roztworu roboczego z barwnikiem fluorescencyjnym phalloidyny 633 (patrz tabela materiałów), aby zabarwić F-aktynę. Przechowywać w ciemnym, wilgotnym miejscu (60%-80%) w temperaturze pokojowej przez 60 min. Przepłucz komórki 3x PBS (500 μL/studzienkę), aby usunąć nadmiar falloidyny. Poprzez barwienie F-aktyny można zarysować cytoplazmę i pomóc w odróżnieniu zinternalizowanych bakterii.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu roboczego DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindolowego) (1 μg/ml) w celu wybarwienia jądra komórkowego i inkubować przez 5 minut w ciemnym, wilgotnym miejscu w temperaturze pokojowej. Przepłukać 1x PBS (500 μL/studzienkę) i 1x tą samą objętością wody destylowanej. Następnie komórki będą gotowe do obserwacji pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
4. Test fagocytozy makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Aby zminimalizować błędy eksperymentalne i dokonać właściwej interpretacji wyników, należy ustawić grupy i probówki kontrolne dla eksperymentu zgodnie z listą w Tabeli 2.
	<ol>
		<li>W przypadku grupy kontrolnej, która zostanie umieszczona na lodzie (grupa 4 w tabeli 2), należy usunąć pożywkę z płytki 6-dołkowej i przemyć ją 1x PBS. Następnie dodaj 1 ml 70 mM zimnego EDTA do studzienki, aby odłączyć komórki i przenieść je do probówki do cytometrii przepływowej. Do probówki dodać 50 μl zawiesiny bakteryjnej i umieścić ją na lodzie na 1 godzinę.</li>
		<li>W przypadku pozostałych grup należy usunąć pożywkę hodowlaną. Dodaj 1 ml świeżego podłoża do każdej studzienki. Dodać 50 μl zawiesiny bakteryjnej do studzienek zgodnie z ustawieniem grupy, jak opisano w tabeli 2. Następnie umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ugasić fluorescencję niezinternalizowanej E. coli, dodaj 200 μl 0,8% roztworu wodnego fioletu krystalicznego (CV) do studzienki i krótko się kołysz, unikając w ten sposób fałszywie dodatniego wyniku przez E. coli wyrażającą EGFP wiążącą się z powierzchnią makrofagów, ale nie zinternalizowaną. Umyj ogniwa 3x PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości CV.</li>
	<li>Następnie dodaj 1 ml 70 mM zimnego EDTA do studzienki, aby odłączyć komórki i przenieść je do probówki do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 100 μl PBS w celu ponownego zawieszenia komórek. Dodać 5 μl przeciwciała sprzężonego z F4/80-PE (antygen powierzchniowy wyrażany na makrofagach myszy) do probówek lub użyć izotypu IgG2a-PE, zgodnie z ustawieniem grupy. Krótko wirować i inkubować próbki na lodzie przez 5-10 minut w ciemności.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS do każdej probówki i odwirować przy 400 x g przez 5 minut. Wyrzucić sklarowany osad. Zawiesić osady komórkowe za pomocą 200-300 μl PBS do analizy cytometrii przepływowej. Uruchom każdą probówkę i uzyskaj dane dla co najmniej 10 000 zdarzeń komórek F4/80+.</li>
</ol>

<ol><li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).</li>
<li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+multiple+abnormalities%2C+heterogeneous+responses%2C+and+evolving+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li>
<li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients%3A+from+epidemiology+to+evidence-based+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li>
<li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li>
<li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+TA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li>
<li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles%28R%29+by+granulocytes+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kroki w tym protokole są dość proste i nieskomplikowane. Jednym z krytycznych etapów jest indukcja ekspresji EGFP na E. coli. Zwykle, gdy planuje się ekspresję genu eukariontów, takiego jak EGFP, u prokariontów, takich jak E. coli, istnieje ryzyko, że białko utworzy nieaktywne agregaty (ciała inkluzyjne), co zmieni natywną strukturę i aktywność białka. Wykorzystując wektor pET-SUMO i konstruując plazmid pET-SUMO-EGFP, białko fuzyjne EGFP-SUMO uległo pomyślnej ekspresji, a sygnał świetlny był wystarczają...

Testy fagocytozy makrofagów są często używane do badania wrodzonej funkcji odpornościowej. Wrodzona odpowiedź immunologiczna może wskazywać na podatność na infekcje. Linie komórkowe makrofagów są szeroko stosowane w badaniach immunologicznych. Jednak przedłużone pasaż może spowodować utratę genów i upośledzenie funkcji odpornościowych w tych liniach komórkowych. Tak więc pierwotne makrofagi otrzewnowe są idealnym obiektem do badania funkcji komórki1.
Chociaż wrodzona odpowiedź immunologiczna była uważana za nienaruszoną w starszym ciele, zdolność fagocytarna może się zmniejszyć w porównaniu do tej w młodszym ciele2,3. Tutaj pokażemy metodę oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej od młodej (ośmiotygodniowej) i starszej (16-miesięcznej) myszy przy użyciu E. coli z ekspresją EGFP, co jest wygodne, szybkie i ekonomicznie wykonalne. 
Użycie szczepu E. coli wykazującego ekspresję EGFP jest jedną z zalet tego testu, ponieważ bakterie te są stabilne i wykazują silny sygnał fluorescencyjny, nawet po utrwaleniu makrofagów przez 4% (w/v) paraformaldehydu. Dodatkowo, dzięki zastosowaniu E. coli wykazującej ekspresję EGFP, naukowcy nie potrzebują dalszego barwienia po fagocytozie, co oszczędza czas. Ponadto makrofagi reagują immunologicznie na antygen powierzchniowy E. coli, co sprawia, że E. coli jest bardziej odpowiednia do testu fagocytozy niż przy użyciu grzybów eksprymujących EGFP lub kulek znakowanych fluoresceiną. 
Z ekspresją EGFP E. coli, test fagocytozy może być łatwo wykonany w ciągu 2 godzin i zmierzony zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i mikroskopii fluorescencyjnej, w zależności od celu badacza. Ponieważ ta metoda bezpośrednio mierzy zdolność fagocytarną, wyniki są bardziej powtarzalne niż inne metody pośrednie. 
Ta metoda została również zweryfikowana w linii komórkowej RAW264.7 i ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej4. Poniższy tekst zawiera szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania tego testu i podkreśla krytyczne kroki, które naukowcy mogą zmodyfikować, aby spełnić potrzeby swoich eksperymentów.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences-Biotyna</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anty-mysie CD16/32 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>Cat101303</td><td></td></tr><tr><td>Champion pET SUMO System ekspresji białek</td><td>Invitrogen</td><td>K300-01</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowa usługa syntezy</td><td>genów Takara Biotech.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)</td><td>Przeciwciało</td> przeciw mysim ThermoFisher <td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE dla FACS</td><td>Biolegend</td><td>Cat123110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI3000 B&nbsp; Mikroskop odwrócony</td><td>Leica</td> <td>Microsystems-PE</td><td></td></tr> <tr><td>Rat IgG2a, kontrola izotypu &kappa;-izotyp</td><td>Biolegend</td><td>Cat400507</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin 633 fluorescencyjny roztwór roboczy sprzężony z barwnikiem</td><td>AAT Bioquest</td><td>Cat23125</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże tioglikolanowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9032</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Ten manuskrypt opisuje prostą i powtarzalną metodę przeprowadzania testu fagocytozy. Pierwsza część tej metody polega na zbudowaniu wektora pET-SUMO-EGFP (SUMO = mały modyfikator podobny do ubikwityny) i ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w Escherichia coli (BL21DE). E. coli wykazująca ekspresję EGFP jest inkubowana z makrofagami przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C; Ujemną grupę kontrolną inkubuje się na lodzie przez ten sam czas. Następnie makrofagi są gotowe do oceny. Do zalet tej techniki należą proste i nieskomplikowane kroki, a fagocytozę można zmierzyć zarówno za pomocą cytometru przepływowego, jak i mikroskopu fluorescencyjnego. E. coli wykazujące ekspresję EGFP są stabilne i wykazują silny sygnał fluorescencyjny nawet po utrwaleniu makrofagów paraformaldehydem. Metoda ta nadaje się nie tylko do oceny linii komórkowych makrofagów lub pierwotnych makrofagów in vitro, ale także do oceny fagocytozy granulocytów i monocytów w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Wyniki pokazują, że zdolność fagocytarna makrofagów otrzewnowych u młodych (ośmiotygodniowych) myszy jest wyższa niż makrofagów u starszych (16-miesięcznych) myszy. Podsumowując, metoda ta mierzy fagocytozę makrofagów i nadaje się do badania funkcji wrodzonego układu odpornościowego.

Wektor pET-SUMO wykorzystuje mały modyfikator podobny do ubikwityny, aby umożliwić ekspresję natywnych białek w E. coli. Fuzja z SUMO może znacząco zwiększyć rozpuszczalność EGFP, co pozwala na jego łatwą detekcję. Jeśli ekspresja EGFP zostanie pomyślnie indukowana laktozą, w ciemności można zaobserwować zielone kolonie (Rysunek 1A). Zielone punkty, reprezentujące E. coli wykazujące ekspresję EGFP, można zaobserwować pod mikroskopem fluoresc...

Tutaj prezentujemy protokół oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy przy użyciu wzmocnionej zielonej fluorescencji wyrażającej białko Escherichia coli.

Wykorzystanie Escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

W protokole tym zademonstrowano prostą i możliwą do wytworzenia metodę oceny zdolności makrofagów do fagocytozy przy użyciu Escherichia coli wykazującej ekspresję EGFP. Cześć, nazywam się Jun-Yu i pracuję w Drugim Szpitalu Uniwersytetu Medycznego w Dalian. Dzisiaj pokażemy Ci łatwy i zobrazujemy sposób oceny fagocytozy makrofagów, który można łatwo wykonać w ciągu dwóch godzin.Metoda ta była szeroko stosowana w badaniach nad wrodzoną funkcją immunologiczną. Uważa się, że wrodzona funkcja immunologiczna pozostała nienaruszona u osób starszych. Tak więc dzisiaj zamierzamy wyizolować makrofagi otrzewnowej od starszych i młodych myszy i zobaczyć zdolność fagocytarną tych dwóch grup.Cóż, zacznijmy. Po pierwsze, zsyntetyzuj fragment genu EGFP i sklonuj go za pomocą polimerazy DNA Taq o wysokiej wierności. Następnie podwiązać produkt PCR do wektora pET SUMO.Po trzecie, przekształć produkty podwiązania w szczep E. coli i indukować ekspresję EGFP za pomocą laktozy. Te E. coli z ekspresją EGFP służyły jako marker do testu fagocytozy. Następnie wyizolowano i wyhodowano makrofagi otrzewnej myszy.Następnie E. coli wykazujące ekspresję EGFP były inkubowane z makrofagami przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po etapie wygaszania makrofagi były gotowe do oceny zarówno za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, jak i cytometru przepływowego. Zsyntetyzuj fragment genu EGFP i amplifikuj go starterami do przodu i do tyłu przy użyciu polimerazy DNA Taq o wysokiej wierności.Aby upewnić się, że produkty PCR miały pojedyncze trójkońcowe zwisy adeniny do klonowania TA w następnym kroku, zaleca się 30-minutowe przedłużenie o 72 stopnie Celsjusza po ostatnim cyklu. Sprawdź produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Jeśli fragment został prawidłowo amplifikowany, na żelu można zaobserwować pasmo 717 pz.Sklonuj produkt PCR do wektora pET SUMO przy użyciu metody klonowania TA z ligazą DNA T4. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj pięć mikrolitrów produktu PCR do 100 mikrolitrów kompetentnych komórek BL21.Szok cieplny komórek w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 90 sekund, a następnie trzymaj mieszaninę na lodzie przez trzy minuty. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki LB, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Potrząsanie przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min.Zaszczepić bakterie na powierzchni płytki LB 100 mikrogramami na mililitr kanamycyny, aby przesiać E. coli przekształconą w wektor. Inkubuj talerz w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia zaszczepić dodatnią kolonię w pięciu mililitrach pożywki LB ze 100 mikrogramami na mililitr kanamycyny.Inkubować w inkubatorze wytrząsającym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 120 obr./min przez dwie godziny. Następnie dodaj laktozę induktora do końcowego stężenia 0,5 milimola na litr i kontynuuj wstrząsanie przez sześć godzin, wywołując ekspresję EGFP. Empirycznie, podczas wstrząsania przez sześć godzin, OD600 może osiągnąć 0,7 lub więcej.Na koniec za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu sprawdzenia stopnia ekspresji EGFP. Dodać 10 mikrolitrów pożywki bakteryjnej do szkiełka. Następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym.Zbadaj ekspresję EGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dodaj 3,5 grama tioglikolanu do 100 mililitrów wody destylowanej. Przed użyciem wysterylizować w autoklawie.Odessać podłoże tioglikolanowe do jednomililitrowej sterylnej strzykawki w kapturze. Jedna mysz na strzykawkę, aby uniknąć infekcji. Wstrzyknij jeden mililitr 3,5% pożywki tioglikolanowej do jamy otrzewnej myszy za pomocą igły o rozmiarze 23 i utrzymuj mysz z wodą i jedzeniem ad libitum przez trzy dni.Po trzech dniach poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po szybkim wywołaniu znieczulenia sewofluranem w zamkniętym pudełku. Następnie włóż mysz do naczynia z 75% etanolem do sterylizacji i szybko przenieś do kaptura. Umieść mysz na talerzu i przypnij przednią łapę do tablicy, aby ustalić pozycję myszy.Za pomocą pięciomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 20 wstrzyknij pięć mililitrów zimnego PBS w dolną część brzucha do jamy otrzewnowej myszy, unikając nakłuwania jelita. Wykonaj delikatny masaż po dwóch stronach brzucha myszy. Następnie delikatnie i powoli odessaj płyn brzuszny.Dozuj płyn otrzewnowy do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Powtórz te kroki dwa lub trzy razy. Odwirować zawieszone komórki przez 10 minut w temperaturze 400 g w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą. Dodaj pięć milionów komórek do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do testu cytometrii przepływowej i 500 000 komórek na studzienkę do 24-dołkowej płytki do mikroskopu fluorescencyjnego. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez noc.Pożywkę hodowlaną można odświeżyć po trzech godzinach, aby usunąć nieprzylegające komórki, ponieważ większość z nich to limfocyty. Obserwuj komórki pod mikroskopem jasnego pola, aby ocenić żywotność komórek i gęstość komórek. Pokazany tutaj obraz był w normalnym stanie komórki pierwotnej.Zwykle gęstość komórek makrofagów nie była wysoka, ponieważ większość komórek otrzewnej stanowiły limfocyty. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 24-dołkowej. Dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej i 10 mikrolitrów pożywki bakteryjnej.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Umyj delikatnie 500 mikrolitrami zimnego PBS na studzienkę trzy do pięciu razy, aby wypłukać niezinternalizowane bakterie. Inkubować komórki z 4% formaldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Umyj komórki trzykrotnie PBS. Dodaj sprzężony roztwór roboczy falloidyny 633 do barwienia F-aktyny. Przechowywać w ciemnym, wilgotnym miejscu w temperaturze pokojowej przez 60 minut.Dodaj roztwór roboczy DAPI, aby zabarwić jądro komórki i inkubować przez pięć minut w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej. Spłucz raz PBS i raz tą samą objętością w wodzie destylowanej. E. coli wykazująca ekspresję EGFP wyświetlana na zielono służyła jako marker fagocytozy.Aby zminimalizować błędy eksperymentalne i dokonać właściwej interpretacji wyników, należy ustawić grupy i probówki kontrolne dla eksperymentu, jak podano w Tabeli 2. W przypadku grupy kontrolnej, która zostanie umieszczona na lodzie, należy usunąć pożywkę z płytki sześciodołkowej i przemyć ją raz PBS. Następnie dodaj 70 milimoli na litr zimnego EDTA jeden mililitr do studzienki, aby odłączyć komórki i przenieść do probówki cytometrii przepływowej.Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do probówki i umieść ją na lodzie na godzinę. W przypadku pozostałych grup usuń pożywkę hodowlaną, dodaj jeden mililitr świeżej pożywki do każdej studzienki. Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do studzienek zgodnie z ustawieniem grupy, jak opisano w tabeli drugiej.Następnie umieść sześciodołkową płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Aby ugasić fluorescencję niezinternalizowanego E. coli, dodaj 200 mikrolitrów 0,8% roztworu wody o stężeniu 0,8% fioletu krystalicznego do studzienki i krótko się kołysz. Ten krok miał na celu uniknięcie fałszywie dodatniego wyniku wiązania się EGFP E. coli z powierzchnią makrofagów, ale nie zinternalizowanego.Umyj komórki trzykrotnie PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości fioletu krystalicznego. Następnie dodaj 70 milimoli na litr zimnego EDTA jeden mililitr do studzienki, aby odłączyć komórki i przenieść do probówki cytometrii przepływowej. Odwirować probówki z prędkością 2 000 obr./min przez pięć minut i odrzucić supernatant.Dodaj 100 mikrolitrów PBS, aby ponownie zawiesić ogniwa. Dodaj pięć mikrolitrów sprzężonego przeciwciała F4 ATP do probówek lub izotypu zgodnie z ustawieniem grupy. Krótko wirować i inkubować próbki na lodzie przez pięć do 10 minut w ciemności.Dodaj jeden mililitr PBS do każdej probówki i odwiruj 2 000 obr./min przez pięć minut. Odrzucić supernatant. Zawiesić granulki komórek za pomocą 200 do 300 mikrolitrów PBS do analizy cytometrii przepływowej.Uruchom każdą probówkę i uzyskaj dane dla co najmniej 10 000 zdarzeń komórek F4/80-dodatnich. Oto obrazy fluorescencyjne makrofagów otrzewnowej z grup młodych i starszych. Czerwona fluorescencja reprezentuje F-aktynę.Kolor zielony reprezentuje E. coli wykazujący ekspresję EGFP, a niebieski oznacza jądro wybarwione przez DAPI. Obrazy te sugerują, że makrofagi młodej myszy miały silniejszą zdolność fagocytarną niż te pochodzące od starszej myszy. Komórki F4/80-dodatnie i EGFP-dodatnie wskazywały na zdolność fagocytarną makrofagów.Wyniki te są zgodne z trendem wyników mikroskopu fluorescencyjnego. Cóż, widzisz, chociaż liczba wrodzonych komórek odpornościowych może zachować się u starzejącej się myszy, zdolność fagocytarna znacznie się zmniejszyła w porównaniu z młodą myszą. Do oceny fagocytozy makrofagów zastosowano wiele metod.Tutaj pokazujemy ulepszoną metodę, która jest wygodna, szybka i ekonomicznie wykonalna. W przypadku E. coli z ekspresją EGFP test fagocytozy można łatwo przeprowadzić i zmierzyć zarówno za pomocą cytometru przepływowego, jak i mikroskopu fluorescencyjnego, zgodnie z preferencjami badacza. Również ta metoda bezpośrednio mierzy zdolność fagocytarną.Wyniki są bardziej powtarzalne niż w przypadku innych metod pośrednich.

using-enhanced-green-fluorescence-protein-expressing-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Tutaj przedstawiamy powszechne metody analizy funkcji fagocytarnej mysich makrofagów pęcherzykowych i klirensu bakteryjnego z płuc. Metody te badają fagocytozę in vitro kulek izotiocyjanianu fluoresceiny oraz fagocytozę in vivo białka zielonej fluorescencji Pseudomonas aeruginosa.  Opisujemy również metodę usuwania P. aeruginosa u myszy.

Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy

Makrofagi, zwłaszcza makrofagi pierwotne, są trudne do transfekcji, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. Opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy.

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Ten protokół opisuje nieenzymatyczną i prostą metodę izolowania 7-9-dniowych komórek szpiku kostnego myszy noworodków i generowania zróżnicowanych makrofagów przy użyciu supernatantu komórek L929 jako źródła czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (M-CSF). Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddano dalszej analizie pod kątem antygenów powierzchniowych F4/80, CD206, CD11b i kompetencji funkcjonalnych.

Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Poznaj metodę oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowych myszy przy użyciu Escherichia coli z ekspresją EGFP. Protokół umożliwia szybką i powtarzalną analizę funkcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.

Wykorzystanie Escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy

Przeglądaj więcej filmów