Name: Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę oceny wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing HIV. Protokół umożliwia jednoczesną analizę przetwarzania mRNA wirusa i reaktywacji latentnych prowirusów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez APP1129320 grantów projektowych i APP1052979 grantów programowych z NHMRC z Australii. Dziękujemy dr Adamowi Wheatleyowi, dr Marinie Alexander, dr Jenny L. Anderson i Michelle Y. Lee za dostarczenie niezbędnych konstrukcji i porad niezbędnych do pomyślnego zakończenia tej pracy. Dziękujemy również personelowi DMI Flow Facility za ich rady i hojną pomoc w utrzymaniu cytometru przepływowego użytego w tym badaniu.

UWAGA: Procedury klonowania, transformacji i sekwencjonowania są omówione gdzie indziej18,19. Protokoły w niniejszym dokumencie rozpoczynają się od transfekcji wektorów ekspresji ssaków (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).
1. Transfekcja komórek HEK293T za pomocą dwukolorowego konstruktu reportera
<ol>
	<li>Hodować HEK293T komórek w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicyliny (100 U/ml) i streptomycyny (100 μg/ml) w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu należy przejść HEK293T komórek 2-3 razy przed użyciem ich w eksperymentach transfekcyjnych. Dałoby to komórkom czas na regenerację po procedurze rozmrażania. 
	ostrożność: Zanieczyszczenie kultur komórkowych mykoplazmą pozostaje poważnym problemem. Dobra praktyka laboratoryjna i rutynowe testowanie kultur komórkowych są niezbędne, aby zmniejszyć ryzyko skażenia mykoplazmą i uniknąć dyfuzji20.</li>
	<li>Podziel komórki 1:2 na dzień przed wysiewem i przenieś je na świeże podłoże DMEM. Hodować komórki przez 24 godziny w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dzień przed transfekcją usunąć pożywkę z kolby przez aspirację i przemyć komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco wolnym od wapnia (Ca2+) i magnezu (Mg2+) w celu usunięcia śladów surowicy.</li>
	<li>Dozować 5 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,05% - 10 mM w PBS) do naczynia hodowlanego i umieścić go w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 na 2 do 5 minut.</li>
	<li>Po odłączeniu komórek dodaj 5 ml DMEM uzupełnionego 10% (v/v) FBS, aby jeszcze bardziej zahamować aktywność trypsyny, która może uszkodzić komórki.</li>
	<li>Zawiesić delikatnie, pipetując zawiesinę komórkową w górę iw dół, aby rozbić grudki.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10 w barwie błękitu trypanowego (0,4%).</li>
	<li>Policz żywe komórki, które nie pobierają błękitu trypanowego, używając mikroskopu (obiektyw 10x) i hemocytometru.</li>
	<li>Obliczyć liczbę żywotnych komórek na mililitr, biorąc średnią liczby komórek i mnożąc ją przez 10 000 oraz przez współczynnik rozcieńczenia (1:10) z barwienia błękitem trypanowym.</li>
	<li>Płytka 2 x 104 komórki w 100 μL pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS bez antybiotyków w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem przez 24 godziny.</li>
	<li>Dla każdej studzienki rozcieńczyć 400 ng pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng pCMV-RevNL4.3 i 100 ng pCMV-Tat101AD8-Flag DNA w 50 μl wolnej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszaj. W przypadku eksperymentów bez Tat należy użyć dopasowanego pustego wektora Tat pcDNA3.1 (-). 
	nuta: Zdecydowanie zaleca się stosowanie DNA wolnego od endotoksyn. W tym celu przygotuj DNA wolne od endotoksyn za pomocą zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych midi lub maxiprep. Określ czystość DNA, mierząc stosunek OD 260/280, który powinien wynosić od 1,7 do 1,9.</li>
	<li>Przed użyciem delikatnie wymieszać odczynnik lipidowy, a następnie rozcieńczyć 0,65 μl w 50 μl wolnej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem lipidowym.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór może wydawać się mętny. 
	nuta: Przejdź do kroku 1.15. w ciągu 30 min.</li>
	<li>Dozować 100 μl na studzienkę kompleksów odczynnika lipidowego-DNA kroplami na wierzch komórek.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj, kołysząc talerzem w przód iw tył.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 5 godzin w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Każda mieszanina reakcyjna jest wystarczająca do transfekcji w jednym dołku (96-dołkowym). Dostosuj ilość i objętość składników w zależności od liczby leków i kombinacji, które będą testowane, oraz uwzględnij różnice w pipetowaniu. Wszystkie warunki są zwykle testowane w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Transfekować dodatkowe studzienki za pomocą 100 ng plazmidu EGFP sterowanego przez CMV i plazmidu DNA DsRed-Express w celu kompensacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Leczenie transfekowanych komórek HEK293T środkami odwracającymi opóźnienia
UWAGA: Przed każdym testem określ stan fizjologiczny każdego LRA, mierząc żywotność komórek po ekspozycji na wysoką i niską dawkę leku z testem proliferacji komórek.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć każdy LRA do odpowiedniego stężenia roboczego pożywką wzrostową (np. 1 μM dla JQ1(+)). 
	ostrożność: Rozpuść liofilizowane leki w odpowiednim rozpuszczalniku do stężenia 10 mM. Przechowywać wszystkie zapasowe LRA w temperaturze -80 °C w jednorazowej podwielokrotności (5 μl każdy), aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę transfekcyjną za pomocą pożywki wielokanałowej i zastąpić pożywką o objętości 100 μl zawierającą odpowiednią pożywkę LRA (Tabela 1). Dodać pożywkę bardzo delikatnie wzdłuż ścianki studzienki, aby uniknąć oderwania się transfekowanych komórek HEK293T, o których wiadomo, że łatwo odrywają się od powierzchni płytki hodowlanej.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 48 godzin w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Barwienie transfekowanych komórek barwnikiem żywotności do analizy cytometrii przepływowej
UWAGA: Usuwanie martwych komórek i zanieczyszczeń jest niezbędne do wyeliminowania fałszywych alarmów i uzyskania wyników najwyższej jakości.
<ol>
	<li>Odłączyć komórki od podłoża za pomocą 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na studzienkę i delikatnie pipetując w górę iw dół (~5 razy) za pomocą wielokanałowego, unikając spieniania pożywki. W razie potrzeby odłączyć komórki od płytki, używając 35 μl roztworu trypsyny-EDTA na studzienkę (0,05% - 10 mM w PBS) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, przed zobojętnieniem pożywką zawierającą surowicę.</li>
	<li>Przenieś komórki na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V.</li>
	<li>Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C, a następnie ostrożnie zassać pożywkę/PBS bez dotykania komórek.</li>
	<li>Umyj komórki co najmniej 1 raz 200 μl PBS wolnego od białka/surowicy.</li>
	<li>Odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant, przechylając płytkę i usuwając bufor do przemywania bez dotykania komórek.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy z utrwalającego się barwnika żywotności, rozcieńczając barwnik żywotności w stosunku 1:1000 w PBS wolnym od białka/surowicy. Przygotować 50 μl rozcieńczonej plamy na studzienkę. 
	nuta: Barwniki żywotności są dostępne w wielu kolorach odpowiednich do stosowania z laserami niebieskimi, czerwonymi i fioletowymi. Przygotować roztwór podstawowy barwnika o żywotności utrwalającej się przez ponowne zawieszenie jednej fiolki liofilizowanego barwnika (składnik A) z 50 μl bezwodnego DMSO (składnik B). Przechowywać w temperaturze -20 °C w jednorazowej porcji (1 μl każdy), chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczonego barwnika żywotności do każdej studzienki i wymieszać komórki, pipetując w górę i w dół za pomocą wielokanałowego.</li>
	<li>Bejcować przez 10-15 min w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.</li>
	<li>Przemyć 1-2 razy 150 μl buforu do przemywania (PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej i 2 mM EDTA).</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Utrwalić komórki za pomocą 100 μl świeżo przygotowanego 1% formaldehydu w buforze do płukania przez 10-15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. 
	ostrożność: Formaldehyd jest bardzo toksyczny. Przygotuj 1% roztwór formaldehydu w dygestorium, aby uniknąć wdychania, nosząc rękawice i okulary ochronne w celu ochrony.</li>
	<li>Przemyć komórki 1-2 razy 100 μl buforu do mycia.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 70 μl buforu do płukania. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Stałe komórki można było przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności w celu analizy następnego dnia na cytometrze przepływowym.</li>
</ol>
4. Pomiary EGFP i DsRed za pomocą cytometrii przepływowej i analizy danych
UWAGA: Przeanalizuj transkrypcję HIV (% EGFP) i splicing (% DsRed) na cytometrze przepływowym. Przefiltruj próbkę przed przebiegiem za pomocą sitka komórkowego o średnicy 70 μm lub siatki nylonowej o średnicy 100 μm, aby uniknąć zatkania dyszy.
<ol>
	<li>Uruchom cytometr i komputer co najmniej 10 minut przed użyciem, aby upewnić się, że lasery się rozgrzały.</li>
	<li>Przed badaniem próbek i rozpoczęciem zbierania danych należy napełnić zbiornik osłonowy 0,9% roztworem soli fizjologicznej i upewnić się, że do zbiornika na odpady dodano tabletkę podchlorynu sodu.</li>
	<li>Sprawdź, czy w komorze przepływowej nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Sprawdź, czy detektory i filtry są odpowiednie dla eksperymentu. 
	nuta: W przypadku EGFP zastosowanie niebieskiego lasera (488 nm) i pasma przepustowego 530/30, podczas gdy DsRed Express jest optymalnie wykrywany za pomocą żółtego lasera (561 nm) i pasma przepustowego 610/20. Niebieski laser (488 nm) i pasmo przepustowe 610/20 mogą być również używane do wykrywania ekspresji DsRed.</li>
	<li>Sprawdź wydajność i czułość cytometru we wszystkich detektorach, uruchamiając koraliki kalibracyjne.</li>
	<li>Dostosuj napięcie rozproszenia do przodu (FSC-A) i boczne (SSC-A) z niezabarwioną próbką tak, aby główna populacja była widoczna na ekranie i wyraźnie rozpoznawalna. 
	nuta: FSC (Forward-scattered light) to pomiar dyfrakcji światła pod kątem płaskim, który zależy od objętości komórki (powierzchni komórki lub wielkości), natomiast SSC (światło rozproszone bocznie) to pomiar dyfrakcji światła pod kątem prostym, który jest proporcjonalny do ziarnistości komórki i złożoności wewnętrznej.</li>
	<li>Wykonaj ręczną lub automatyczną kompensację przy użyciu pojedynczo barwionych próbek, zapewniając minimalne rozlanie się populacji EGFP+ do detektora DsRed i odwrotnie. 
	ostrożność: Do celów kompensacji należy użyć próbki komórek wykazujących ekspresję każdego z jednokolorowych białek fluorescencyjnych, a także komórek pojedynczo barwionych barwnikiem żywotności utrwalającym się. Nie należy używać kulek kompensacyjnych FITC i PE do kompensacji białek fluorescencyjnych EGFP i DsRed ze względu na różne charakterystyki spektralne. Kontrole wynagrodzeń powinny być wystarczająco jasne, aby rozwiązać problem populacji pozytywnej i negatywnej.</li>
	<li>Twórz wykresy i ustawiaj bramki za pomocą kontrolek fluorescencja minus jeden (FMO).</li>
	<li>Pozyskaj i zarejestruj co najmniej 10 000 żywotnych zdarzeń komórkowych na próbkę. Próbki należy uruchamiać ze średnią lub niską prędkością, aby uniknąć przechodzenia dubletów przez punkt przecięcia lasera. Użyj bramkowania geometrii impulsów, takiej jak SSC-A w porównaniu z SSC-H, aby wyeliminować dublety. Sprawdź stabilność przebiegu, wykreślając czas w funkcji SSC-A, aby zobaczyć, jak równomierny jest przepływ podczas przebiegu.</li>
	<li>Pod koniec cyklu należy oczyścić płyny cytometrii przepływowej skoncentrowanymi środkami czyszczącymi, a następnie wodą przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Wyłącz system, wyrzuć odpady i ponownie napełnij zbiornik osłonowy po pobraniu.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej. Wyklucz resztki komórek i zbrylaj się (dublety) na podstawie rozproszenia do przodu i na boki, a następnie wyeliminuj martwe komórki za pomocą barwienia barwnikiem żywotności (populacja ujemna = żywe komórki). Zidentyfikuj komórki wyrażające EGFP i DsRed (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4), a także procent splicowanego produktu DsRed/(DsRed + EGFP) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5).</li>
	<li>Określ wpływ LRA na transkrypcję i splicing wirusa HIV, porównując komórki nieleczone i komórki wystawione na działanie pojedynczych LRA lub ich kombinacji (<silna klasa="xfig">Ryc. 5).</li>
</ol>

<ol><li>Siliciano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+studies+confirm+the+stability+of+the+latent+reservoir+for+HIV-1+in+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).</li>
<li>Khoury, G., et al. Ch. 8. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhoury%2C+G+%22HIV+vaccine+and+cure+-+The+Path+Towards+Finding+an+Effective+Cure+and+Vaccine%22">HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine</a>. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).</li>
<li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transcription+and+latency%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67(2013).</li>
<li>Archin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Expression+Within+Resting+CD4%2B+T+Cells+After+Multiple+Doses+of+Vorinostat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat.</a> Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).</li>
<li>Elliott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIV+Transcription+with+Short-Course+Vorinostat+in+HIV-Infected+Patients+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> PLoS Pathogens. 10, (2014).</li>
<li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+Vacc-4x%2C+recombinant+human+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+vaccination%2C+and+romidepsin+on+the+HIV-1+reservoir+%28REDUC%29%3A+a+single-arm%2C+phase+1B%2F2A+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial.</a> The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panobinostat%2C+a+histone+deacetylase+inhibitor%2C+for+latent-virus+reactivation+in+HIV-infected+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy%3A+a+phase+1%2F2%2C+single+group%2C+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial.</a> The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).</li>
<li>Søgaard, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Depsipeptide+Romidepsin+Reverses+HIV-1+Latency+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo.</a> PLoS Pathogens. 11, (2015).</li>
<li>Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodomain+and+extra-terminal+%28BET%29+bromodomain+inhibition+activate+transcription+via+transient+release+of+Positive+Transcription+Elongation+Factor+b+%28P-TEFb%29+from+7SK+small+nuclear+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).</li>
<li>Boehm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+bromodomain-targeting+compounds+reactivate+HIV+from+latency+via+a+Tat-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism.</a> Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).</li>
<li>Contreras, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+reactivates+HIV+from+latently+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HDAC+inhibitors+in+clinical+development%3A+effect+on+HIV+production+in+latently+infected+cells+and+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).</li>
<li>Wei, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin+induces+HIV+expression+in+CD4+T+cells+from+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy+at+concentrations+achieved+by+clinical+dosing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071(2014).</li>
<li>Blazkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+HIV+production+in+latently+infected%2C+resting+CD4%28%2B%29+T+cells+from+infected+individuals+receiving+effective+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).</li>
<li>Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ex+vivo+approaches+distinguish+effective+and+ineffective+single+agents+for+reversing+HIV-1+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).</li>
<li>Yukl, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+in+isolated+patient+CD4%2BT+cells+may+be+due+to+blocks+in+HIV+transcriptional+elongation%2C+completion%2C+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retention+of+multiply+spliced+HIV-1+RNA+in+resting+CD4%2BT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells.</a> PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).</li>
<li>Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transcription+through+an+intron+requires+the+binding+of+an+Sm-type+U1+snRNP+with+intact+stem+loop+II+to+the+splice+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor.</a> Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).</li>
<li>Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Linear+and+Discontinuous+Ribosome+Scanning+Are+Used+for+Translation+Initiation+from+Bicistronic+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+env+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs.</a> Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).</li>
<li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+detection+of+Mycoplasma+contamination+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).</li>
<li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+reversing+agents+act+through+Tat+post+translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications.</a> Retrovirology. 15 (1), 36(2018).</li>
<li>Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency%3A+experimental+systems+and+molecular+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">HIV latency: experimental systems and molecular models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).</li>
<li>Dahabieh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+non-productive+HIV-1+infection+in+a+T-cell+line+is+driven+by+cellular+activation+state+and+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB.</a> Retrovirology. 11, 17(2014).</li>
<li>Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+HIV+reporters+trace+a+population+of+latently+infected+cells+and+enable+their+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification.</a> Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).</li>
<li>Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Latency+Is+Established+Directly+and+Early+in+Both+Resting+and+Activated+Primary+CD4+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells.</a> PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955(2015).</li>
<li>Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter-regulatory+region+of+the+major+immediate-early+gene+of+human+cytomegalovirus+responds+to+T-lymphocyte+stimulation+and+contains+functional+cyclic+AMP-response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements.</a> Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).</li>
<li>Reeves, M., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+of+human+cytomegalovirus+latency+and+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).</li>
<li>Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+activation+of+the+cytomegalovirus+enhancer+is+mediated+by+a+viral+transactivator+and+by+T+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.</a> EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).</li>
<li>Kula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+HIV-1+RNA+associated+proteome+identifies+Matrin+3+as+a+nuclear+cofactor+of+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function.</a> Retrovirology. 8, 60(2011).</li>
<li>Kula, A., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Post-Transcriptional+Regulation+of+HIV-1+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression.</a> Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).</li>
<li>Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-ing+up+post-transcriptional+HIV-1+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression.</a> RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).</li>
<li>Zolotukhin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+acts+through+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+mRNA+instability+elements+to+regulate+virus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).</li>
<li>Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Frequency+of+Latent+HIV-1+in+Resting+CD4%28%2B%29+T+Cells+Using+a+Limiting+Dilution+Coculture+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).</li>
<li>Cary, D. C., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+latent+reservoir+to+achieve+functional+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure.</a> F1000Res. 5, (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+analysis+identifies+effective+HIV-1+latency+-+reversing+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).</li>
<li>Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+interference+antagonizes+proviral+gene+expression+to+promote+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency.</a> Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Biorąc pod uwagę trudności w pomiarze reaktywacji wirusa ex vivo, z biegiem czasu opracowano szeroki zakres modeli in vitro w celu zbadania latencji HIV, w tym utajone linie komórek T (J-Lats, ACH2, U1), pierwotne modele utajonej infekcji spoczynku (modele O'Doherty'ego, Lewina, Greene'a i Spina) lub wstępnie aktywowane limfocyty T CD4+ (Sahu, Modele Marini, Planelles, Siliciano, Karn) z pojedynczymi wirusami reporterowymi lub replikacyjnymikompetentnymi 22. Aby modelować warunki fizjologiczne la...

Pomimo skutecznej długotrwałej terapii antyretrowirusowej, HIV utrzymuje się w stanie utajonym jako zintegrowany prowirus w pamięci limfocytów T CD4+1. Struktura chromatyny promotora 5' długich powtórzeń końcowych HIV-1 (LTR) i modyfikacje epigenetyczne, takie jak metylacja i deacetylacja histonów przez metylotransferazy DNA (DNMT) i deacetylazy histonowe (HDAC), są ważnymi mechanizmami prowadzącymi do represji transkrypcji, a tym samym opóźnienia po integracji2,3. Zbadano wiele różnych czynników odwracających latencję (LRA) pod kątem ich skuteczności w indukowaniu produkcji wirusa in vitro i in vivo z utajonych zakażonych limfocytów T spoczynkowych CD4+4,5,6,7,8. Spośród badanych LRA, HDACi (inhibitory HDAC) i inhibitory bromodomeny BET (BETis) indukują odpowiednio dekondensację chromatyny i uwalnianie dodatniego czynnika wydłużania transkrypcji b (P-TEFb), co prowadzi do późniejszego złagodzenia represji transkrypcji w 5'LTR i aktywacji ekspresji HIV9,10,11,12,13. Jednak skala reaktywacji osiągnięta przez te LRA była ograniczona, ponieważ zaobserwowano tylko niewielki wzrost niesplicowanego mRNA HIV (US RNA) związanego z komórkami, wskazującego na transkrypcję wirusa, ex vivo14,15. Co ważne, te LRA nie zdołały również wywołać zmniejszenia częstości występowania utajonych zakażonych komórek.
Ekspresja HIV może być dodatkowo ograniczona przez nieefektywne splicing16, a także defekty w eksporcie jądrowym wielokrotnie splicowanego RNA HIV (MS RNA)17. W związku z tym konieczne jest zidentyfikowanie nowych klas władz lokalnych i regionalnych, które są silniejsze i mogą wpływać na różne aspekty produkcji wirusów po integracji. Ponadto konieczne jest opracowanie nowatorskich testów, które pomogą zdefiniować optymalne związki w celu skutecznego odwrócenia latencji.
Tutaj prezentowany jest protokół, który wykorzystuje podejście wysokoprzepustowe do funkcjonalnej oceny wpływu interwencji na transkrypcję i splicing sterowany przez HIV LTR. Krótko mówiąc, nowy dwukolorowy system reporterski oparty na LTR pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) służy do oceny reaktywacji wirusa HIV za pomocą cytometrii przepływowej. W tym fluorescencyjnym reporterze ekspresja niesplicowanego mRNA HIV (4 kb) prowadzi do zwiększonej ekspresji białka zielonej fluorescencji (EGFP), podczas gdy ekspresja spliced mRNA (2 kb) doprowadziłaby do ekspresji białka fluorescencyjnego Discosoma sp. red (DsRed). Krótko mówiąc, użyliśmy fluorescencyjnego białka fuzyjnego Env-EGFP, gp140unc. EGFP, gdzie sekwencja kodująca EGFP została umieszczona w ramce z nierozszczepioną i obciętą formą obwiedni (Env). Wprowadzono zmiany mające na celu ablację miejsca rozszczepienia zapobiegającą dysocjacji Env na gp120 i gp41-EGFP oraz skrócenie białka gp160 przed domeną transbłonową, tworząc rozpuszczalny analog Env, który ułatwia prawidłowe fałdowanie i ekspresję EGFP. Po ekspresji w komórce, Rev lokalizuje się w jądrze, gdzie pośredniczy w eksporcie jądrowo-cytoplazmatycznym mRNA env o wielkości 4 kb poprzez interakcję z elementem reagującym na rev (RRE). Skrócenie Env nie zagraża RRE, który znajduje się między gp120 i gp41, a miejscem łączenia A7 3'. W tym systemie splicing w donorze 4 splicingu HIV-1 (SD4) i akceptorze splicingu 7 (SA7) powoduje wytwarzanie mRNA o wielkości 2 kb kodującego niefunkcjonalne białko Rev skrócone do aminokwasu 38 połączonego z białkiem fluorescencyjnym DsRed, RevΔ38-DsRed. Krótko mówiąc, DsRed został wstawiony do 2 nd eksonu Rev przy aminokwasie 38 przez nakładanie się extension18. Aby ułatwić eksport jądrowy niesplicowanego mRNA, wektor ekspresji ssaków kodujący Rev (pCMV-RevNL4.3) został poddany jednoczesnej transfekcji z fluorescencyjnym konstruktem reporterowym (<silna klasa = "xfig">Figura 2). Ten unikalny konstrukt reporterowy opisany tutaj jest przydatny w wysokoprzepustowej ocenie transkrypcji i splicingu wirusa HIV, bez konieczności stosowania wektorów wirusowych.

<table><tbody><tr><td>Komórki Cell cultureHEK293T</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(ludzkie embrionalne komórki nerkowe)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>replikuje wektory przenoszące region replikacji SV40.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>+ 4,5 g/L D-Glukoza + 110 mg/L Pirogronian sodu</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10099-141</td><td>Pochodzenie Australia</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS), bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Odczynnik do transfekcji lipidów</td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x) zredukowana pożywka surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Pożywka bez surowicy</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Marcherey-Nagel</td><td>740414.50</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 plazmid</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>6085-1</td><td>Ekspresja EGFP w komórkach ssaków, promotor CMVIE.</td></tr><tr><td>pDsRed-Express-N1</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>632429</td><td>Ekspresja DsRed-Express w komórkach ssaków, promotor CMVIE.</td></tr><tr><td>pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed</td><td>Addgene</td><td>115775</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-RevNL4.3</td><td>Addgene</td><td>115776</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td><td>Addgene</td><td>115777</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Milipor</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>JQ1(+)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11187</td><td>Zapas przy 10 mM w DMSO; stężenie robocze 1 &mu; M</td></tr><tr><td>JQ1(-)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11232</td><td>Zapas przy 10 mM w DMSO; stężenie robocze 1 i mu; M</td></tr><tr><td>Octan mirystynianu forbolu (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td>Zapas przy 100 &mu; g/ml w DMSO; stężenie robocze 10 nM</td></tr><tr><td>Fitohemaglutynina (PHA)</td><td>Remel</td><td>HA15/R30852701</td><td>Zapas przy 1 &mu; g/&mu; L w PBS; stężenie robocze 10 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Vorinostat (VOR)</td><td>Cayman Chemical</td><td></td><td>10009929 Zapas w 10 mM w DMSO; stężenie robocze 0,5 &mu; M</td></tr><tr><td>Panobinostat (PAN)</td><td>TRC</td><td>P180500</td><td>Zapas w 10 mM w DMSO; stężenie robocze 30 nM</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek</td><td>Promega</td><td>63581</td><td></td></tr><tr><td>Venor GeM Classic</td><td>Minerva Biolabs</td><td>11-1100</td><td>Zestaw do wykrywania mykoplazmy, na bazie PCR</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy<</td><td>strong>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Odczynniki do cytometrii przepływowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cytometr przepływowy (4 lasery - niebieski, czerwony, fioletowy i żółty)</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cytometr przepływowy (3 lasery - niebieski, czerwony i fioletowy)</td></tr> <tr><td>ŻYWY/MARTWY Naprawialny Bliski podczerwieni Martwy Cell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34976</td><td>Barwnik żywotności: do wzbudzenia 633 lub 635 nm, 400 testów. Komponent A i B są dostępne w zestawie.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5M pH8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 37/10 (37%)</td><td>Chem-Supply</td><td>FA010</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva CS& Koraliki badawcze T</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td>Koraliki kalibracyjne</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow Cząstki kalibracyjne (8 pików)</td><td>BD Biosciences</td><td>559123</td><td>3,0 - 3,4 mm</td></tr><tr><td>Roztwór osłonowy</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>90 g NaCl w 10 L wody</td></tr><tr><td>HAZ-Tabs</td><td>Guest Medical</td><td>H8801</td><td>Tabletki uwalniające chlor do dezynfekcji</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td>Nie dotyczy</td><td>Skoncentrowane środki czyszczące cytometru przepływowego. Roztwór roboczy Decon 90 5%.</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu (roztwór 12-13%)</td><td>Labco</td><td>SODHYPO-5L</td><td>Skoncentrowane środki czyszczące cytometru przepływowego. Roztwór roboczy wybielacza 1%.</td></tr><tr><td>7x</td><td>MPBio</td><td>IM76670</td><td>Skoncentrowane środki czyszczące cytometr przepływowy. Roztwór roboczy 7x 1%.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych (75 cm2, skośna szyjka, wentylowana nakrętka)</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych (96 dołków z płaskim dnem z pokrywką)</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych (96-dołkowe V-dno bez pokrywy)</td><td>Costar</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (10 ml)</td><td>SARSTEDT</td><td>62.9924.284</td><td>100x16 mm</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (50 mL)</td><td>CellStar</td><td>227261</td><td>30x115 mm</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)</td><td>Corning Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Serological Pipeta (25 mL), sterylna</td><td>Corning</td><td>CLS4489-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna (10 mL), sterylna</td><td>Corning</td><td>CLS4488-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna (5 mL), sterylna</td><td>Corning</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki na odczynniki (50 mL), sterylne</td><td>Corning</td><td>CLS4470-200EA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Probówka z polistyrenu o okrągłym dnie, z nasadką z sitkiem komórkowym</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Styl 12 x 75 mm,</td></tr><tr><td>siatka nylonowa</td> 70 mm <td>SEFAR</td><td>03-100/32</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Mikroprobówki Titertube, luzem</td><td>Probówki BIO-RAD</td><td>2239391</td><td>microfacs</td></tr><tr><td>5 ml Probówka z polistyrenu o okrągłym dnie, bez nakrętki</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>12x75 mm</td></tr><tr><td>Snap Caps do probówek 12x75 mm</td><td>Corning</td><td>352032</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca, Neubauer ulepszony podwójny liniatura sieciowa, jasna linia (hemocytometr, LO-Laboroptik)</td><td>ProSciTech</td><td>SVZ4NIOU</td><td>3x3 dużych kwadratów 1 mm2; Głębokość: 0,100 mm; objętość 0,1 ml; minimalna powierzchnia 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (Menzel-Gl&auml; ser)</td><td>Grale Scientific HCS2026</td><td></td><td>20 x 26 mm</td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Nikon TMS</td><td>310528</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810R chłodzona</td><td>Eppendorf</td><td>5811000487</td><td>z rotorem A-4-81 wraz z adapterami do probówek stożkowych 15/50 ml</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>N/A</td><td>Czytnik płytek do testu proliferacji komórek. Filtr 490 nm.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Program do pozyskiwania i analizy danych cytometru przepływowego, wersja 8.0.1</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo 10.4.2</td><td>Program do analizy danych cytometru przepływowego, FlowJo Engine v3.05481</td></tr><tr><td>Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>FLUOstar czytnik wielu użytkowników, wersja 5.11</td></tr><tr><td>Omega - Analiza danych</td><td>BMG Labtech</td><td>MARS</td><<td>em>FLUOstar analiza danych, wersja 3.20R2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td>Microsoft Excel:mac 2011</td><td>wersja 14.0.0</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>wersja 7.0c</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu hiv

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV pozostaje nieuleczalny ze względu na istnienie rezerwuaru komórek, który zawiera stabilną i utajoną formę wirusa, który pozostaje niewidoczny dla układu odpornościowego i nie jest celem obecnej terapii antyretrowirusowej (cART). Wykazano, że transkrypcja i splicing wzmacniają latencję HIV-1 w spoczynkowych limfocytach T CD4 +. Odwrócenie latencji poprzez zastosowanie środków odwracających latencję (LRA) w podejściu "szok i zabicie" było szeroko badane w celu oczyszczenia tego rezerwuaru, ale jak dotąd nie wykazało żadnego sukcesu w badaniach klinicznych ze względu na brak opracowania odpowiednich małych cząsteczek, które mogłyby skutecznie zaburzyć ten rezerwuar. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia metodę wiarygodnej i skutecznej oceny czynników odwracających opóźnienia (LRA) w transkrypcji i splicingu wirusa HIV. Podejście to opiera się na zastosowaniu dwukolorowego reportera sterowanego przez LTR, który może jednocześnie mierzyć wpływ LRA na transkrypcję i splicing za pomocą cytometrii przepływowej. Opisany tutaj protokół jest odpowiedni zarówno dla komórek przylegających, jak i komórek w zawiesinie. Jest przydatny do testowania dużej liczby leków w systemie o dużej przepustowości. Metoda jest technicznie prosta do wdrożenia i opłacalna. Ponadto zastosowanie cytometrii przepływowej pozwala na ocenę żywotności komórek, a tym samym jednoczesnej toksyczności leków.

Reprezentatywne wyniki dla ekspresji niezespajanych (EGFP) i zespajanych (DsRed) produktów HIV-1 po zastosowaniu inhibitora domen bromodomeny JQ1 przedstawiono na Ryc. 5. Zarówno JQ1(+), jak i Tat znacząco zwiększyły odsetek komórek wykazujących ekspresję EGFP (odpowiednio 2,18 i 4,13 FC względem DMSO; n = 3), co wskazuje na obecność niezespajanych transkryptów. Co więcej, JQ1(+) znacząco zwiększył odsetek komórek wykazujących ekspresję DsRed (46,6 FC względe...

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena in vitro wpływu środków odwracających latencję na przetwarzanie mRNA HIV. Protokół zapewnia prostą, wydajną i niezawodną metodę oceny jednoczesnej oceny wpływu LRA na transkrypcję i splicing wirusa HIV. Technika ta dostarczyła informacji na temat zdolności władz lokalnych i regionalnych do indukowania reaktywacji wirusa i usuwania utajonego rezerwuaru.Po wyhodowaniu komórek umieść 20 000 z nich w 100 mikrolitrach pożywki DMEM, uzupełnionej 10% FBS i bez antybiotyków w dołkach 96-dołkowej płaskiej płytki dennej na 24 godziny. Następnego dnia rozcieńczyć dwukolorową konstrukcję reportera. Tat i Rev DNA w 50 mikrolitrach wolnego podłoża surowicy i delikatnie wymieszaj.Delikatnie wymieszaj odczynnik lipidowy, a następnie rozcieńczyć 0,65 mikrolitra na reakcję w 50 mikrolitrach wolnej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Połącz rozcieńczony odczynnik lipidowy z rozcieńczonym DNA i delikatnie wymieszaj.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie dozuj 100 mikrolitrów tego kompleksu odczynnika lipidowego DNA kroplami, na komórki w każdej studzience. Delikatnie kołysz talerzem w przód iw tył, aby wymieszać.I inkubuj płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez pięć godzin. Następnie należy przetransfekować dodatkowe studzienki za pomocą 100 nanogramów EGFP napędzanego CMV i DsRed eksprymują plazmid DNA w celu kompensacji. Na początek rozcieńczyć każdy czynnik odwracający latencję do odpowiednich warunków roboczych za pomocą pożywki wzrostowej.Za pomocą wielokanałowej głowicy rurowej ostrożnie zassać medium transfekcyjne i zastąpić je 100 mikrolitrami medium zawierającego odpowiedni środek odwracający opóźnienie. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37% Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Aby rozpocząć barwienie komórek, użyj wielokanałowej głowicy rury, aby dodać 100 mikrolitrów PBS do każdej studzienki.Delikatnie przesuń głowicę w górę iw dół około pięć razy. Uważając, aby uniknąć spienienia, aby oderwać komórki od podłoża. Następnie przenieś komórki do dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.Wirować przy 500-krotności grawitacji i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odessać pożywkę i PBS bez dotykania komórek. Umyj komórki co najmniej raz 200 mikrolitrami PBS bez białka i surowicy.Wirować przy 500-krotności grawitacji i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Przechylić płytkę, aby odrzucić supernatant i usunąć bufor do płukania, nie dotykając komórek. Następnie rozcieńczyć barwnik o ustalonej żywotności w PBS wolnym od białka i surowicy w stosunku 1 do 1000, aby przygotować roztwór roboczy.Dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego barwnika do każdej studzienki i ruruj głowicą w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Chroniony przed światłem za pomocą folii przez 10 do 15 minut.Następnie przemyj komórki raz lub dwa razy 150 mikrolitrami buforu do mycia. Następnie odwirować przy 500-krotności grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Aby utrwalić komórki, dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 1% formaldehydu i przepłucz bufor.I inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem przez 10 do 15 minut. Następnie przemyj komórki raz lub dwa razy 100 mikrolitrami buforu do mycia. Wirować przy 500-krotności grawitacji i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 70 mikrolitrach buforu do przemywania wody. Po sprawdzeniu wydajności i czułości ustawień cytometru poprzez uruchomienie koralików kalibracyjnych, wyreguluj napięcia rozproszenia do przodu i z boku z niezabarwioną próbką, tak aby główna populacja była widoczna na ekranie i wyraźnie rozpoznawalna. Wykonaj ręczną lub automatyczną kompensację przy użyciu pojedynczych barwionych próbek, zapewniając minimalne rozlanie się populacji dodatniej EGFP do detektora DsRed i odwrotnie.Korzystając z fluorescencji minus jeden elementów sterujących, utwórz wykresy i ustaw bramki. Następnie dostosuj napięcia rozproszenia przedniego i bocznego z niezabarwioną próbką, tak aby główna populacja była widoczna na ekranie i wyraźnie rozpoznawalna. Pozyskaj i zarejestruj co najmniej 10 000 żywotnych zdarzeń komórkowych na próbkę.Następnie użyj oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej, aby przeanalizować dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne wyniki dotyczące ekspresji HIV-1, produktów niesplicingowanych i splicingowych, po leczeniu inhibitorem bromodomeny JQ1, pokazują, że zarówno JQ1 dodatni, jak i Tat, znacznie zwiększają odsetek komórek wykazujących ekspresję EGFP. Co wskazuje na niesplecione transkrypcje.Obserwuje się również, że JQ1 dodatni znacznie zwiększa odsetek komórek wyrażających DsRed. I zwiększ udział łączonego produktu do podobnych poziomów jak Tat. Potwierdza to zdolność JQ1 dodatniego do włączania transkrypcji i splicingu HIV.Jednak leczenie stereoizomerem kontrolnym JQ1 ujemnym znosi pozytywny wpływ JQ1 na transkrypcję i splicing wirusa HIV. Po opanowaniu tę metodę można przeprowadzić przy użyciu leków pojedynczo lub w połączeniu. Testowanie ich zdolności do efektywnej synergii.Co doprowadziłoby do mniejszej dawki leku i toksyczności. Po każdym z tych osiągnięć technika ta torowała drogę do testowania skutecznych kombinacji leków w pierwotnych modelach latencji w próbkach pacjentów ex vivo.

high-throughput-vitro-assessment-latency-reversing-agents-on-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Odsłonięcie (uncoating) jest kluczowym etapem wczesnej fazy cyklu życiowego HIV-1 i definiuje się je jako rozpad otoczki kapsydu oraz uwolnienie wirusowego kompleksu rybonukleoproteinowego (vRNP). W niniejszej pracy prezentujemy techniki izolacji nienaruszonych rdzeni z wirionów HIV-1 oraz metody ilościowego oznaczania ich odsłaniania in vitro.

In vitro rozpakowywanie rdzeni HIV-1

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Patogeneza HIV-1 jest definiowana zarówno przez cechy wirusa, jak i czynniki genetyczne gospodarza. W tym miejscu opisujemy solidną metodę, która pozwala na powtarzalne pomiary w celu oceny wpływu zmienności sekwencji genu gag na zdolność replikacji wirusa in vitro.

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Ten raport opisuje test in vitro do pomiaru aktywności integracyjnej ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) związanego z kompleksem preintegracji () w ekstraktach cytoplazmatycznych ostro zakażonych komórek. Integracja DNA HIV-1 związanego z z heterologicznym docelowym DNA jest określana ilościowo przy użyciu zagnieżdżonej strategii reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Ten protokół zapewnia metodę tworzenia humanizowanych myszy (hu-NSG) poprzez dowątrobowe wstrzykiwanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych do kondycjonowanych promieniowaniem noworodków NSG. Mysz hu-NSG jest podatna na zakażenie wirusem HIV i skojarzoną terapię antyretrowirusową (cART) i służy jako odpowiedni model patofizjologiczny do badań replikacji i latencji HIV.

Humanizowany mysi modelNOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj wysokoprzepustową metodę oceny wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing HIV. Protokół umożliwia jednoczesną analizę przetwarzania mRNA wirusa i reaktywacji latentnych prowirusów.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Przeglądaj więcej filmów