Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Ogólnym celem tej procedury jest ocena in vitro wpływu środków odwracających latencję na przetwarzanie mRNA HIV. Protokół zapewnia prostą, wydajną i niezawodną metodę oceny jednoczesnej oceny wpływu LRA na transkrypcję i splicing wirusa HIV. Technika ta dostarczyła informacji na temat zdolności władz lokalnych i regionalnych do indukowania reaktywacji wirusa i usuwania utajonego rezerwuaru.

Po wyhodowaniu komórek umieść 20 000 z nich w 100 mikrolitrach pożywki DMEM, uzupełnionej 10% FBS i bez antybiotyków w dołkach 96-dołkowej płaskiej płytki dennej na 24 godziny. Następnego dnia rozcieńczyć dwukolorową konstrukcję reportera. Tat i Rev DNA w 50 mikrolitrach wolnego podłoża surowicy i delikatnie wymieszaj.

Delikatnie wymieszaj odczynnik lipidowy, a następnie rozcieńczyć 0,65 mikrolitra na reakcję w 50 mikrolitrach wolnej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Połącz rozcieńczony odczynnik lipidowy z rozcieńczonym DNA i delikatnie wymieszaj.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie dozuj 100 mikrolitrów tego kompleksu odczynnika lipidowego DNA kroplami, na komórki w każdej studzience. Delikatnie kołysz talerzem w przód iw tył, aby wymieszać.

I inkubuj płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez pięć godzin. Następnie należy przetransfekować dodatkowe studzienki za pomocą 100 nanogramów EGFP napędzanego CMV i DsRed eksprymują plazmid DNA w celu kompensacji. Na początek rozcieńczyć każdy czynnik odwracający latencję do odpowiednich warunków roboczych za pomocą pożywki wzrostowej.

Za pomocą wielokanałowej głowicy rurowej ostrożnie zassać medium transfekcyjne i zastąpić je 100 mikrolitrami medium zawierającego odpowiedni środek odwracający opóźnienie. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37% Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Aby rozpocząć barwienie komórek, użyj wielokanałowej głowicy rury, aby dodać 100 mikrolitrów PBS do każdej studzienki.

Delikatnie przesuń głowicę w górę iw dół około pięć razy. Uważając, aby uniknąć spienienia, aby oderwać komórki od podłoża. Następnie przenieś komórki do dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.

Wirować przy 500-krotności grawitacji i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odessać pożywkę i PBS bez dotykania komórek. Umyj komórki co najmniej raz 200 mikrolitrami PBS bez białka i surowicy.

Wirować przy 500-krotności grawitacji i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Przechylić płytkę, aby odrzucić supernatant i usunąć bufor do płukania, nie dotykając komórek. Następnie rozcieńczyć barwnik o ustalonej żywotności w PBS wolnym od białka i surowicy w stosunku 1 do 1000, aby przygotować roztwór roboczy.

Dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego barwnika do każdej studzienki i ruruj głowicą w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Chroniony przed światłem za pomocą folii przez 10 do 15 minut.

Następnie przemyj komórki raz lub dwa razy 150 mikrolitrami buforu do mycia. Następnie odwirować przy 500-krotności grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Aby utrwalić komórki, dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 1% formaldehydu i przepłucz bufor.

I inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem przez 10 do 15 minut. Następnie przemyj komórki raz lub dwa razy 100 mikrolitrami buforu do mycia. Wirować przy 500-krotności grawitacji i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 70 mikrolitrach buforu do przemywania wody. Po sprawdzeniu wydajności i czułości ustawień cytometru poprzez uruchomienie koralików kalibracyjnych, wyreguluj napięcia rozproszenia do przodu i z boku z niezabarwioną próbką, tak aby główna populacja była widoczna na ekranie i wyraźnie rozpoznawalna. Wykonaj ręczną lub automatyczną kompensację przy użyciu pojedynczych barwionych próbek, zapewniając minimalne rozlanie się populacji dodatniej EGFP do detektora DsRed i odwrotnie.

Korzystając z fluorescencji minus jeden elementów sterujących, utwórz wykresy i ustaw bramki. Następnie dostosuj napięcia rozproszenia przedniego i bocznego z niezabarwioną próbką, tak aby główna populacja była widoczna na ekranie i wyraźnie rozpoznawalna. Pozyskaj i zarejestruj co najmniej 10 000 żywotnych zdarzeń komórkowych na próbkę.

Następnie użyj oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej, aby przeanalizować dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne wyniki dotyczące ekspresji HIV-1, produktów niesplicingowanych i splicingowych, po leczeniu inhibitorem bromodomeny JQ1, pokazują, że zarówno JQ1 dodatni, jak i Tat, znacznie zwiększają odsetek komórek wykazujących ekspresję EGFP. Co wskazuje na niesplecione transkrypcje.

Obserwuje się również, że JQ1 dodatni znacznie zwiększa odsetek komórek wyrażających DsRed. I zwiększ udział łączonego produktu do podobnych poziomów jak Tat. Potwierdza to zdolność JQ1 dodatniego do włączania transkrypcji i splicingu HIV.

Jednak leczenie stereoizomerem kontrolnym JQ1 ujemnym znosi pozytywny wpływ JQ1 na transkrypcję i splicing wirusa HIV. Po opanowaniu tę metodę można przeprowadzić przy użyciu leków pojedynczo lub w połączeniu. Testowanie ich zdolności do efektywnej synergii.

Co doprowadziłoby do mniejszej dawki leku i toksyczności. Po każdym z tych osiągnięć technika ta torowała drogę do testowania skutecznych kombinacji leków w pierwotnych modelach latencji w próbkach pacjentów ex vivo.