Name: Analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy B in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj analizę migracji komórek B brzeżnej strefy indukowanej przepływem ścinającym in vitro. Ta metoda wykorzystuje jednostkę płynową i mikroskopię do badania dynamiki komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 dla K.-D.F.

<ol><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li>
<li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1%2C+ICAM-2%2C+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest%2C+polarization%2C+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li>
<li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li>
<li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li>
<li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+receptor+1+promotes+B+cell+localization+in+the+splenic+marginal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone.</a> Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).</li>
<li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li>
<li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+way+out%3A+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li>
<li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginal+zone+B+cells%3A+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
<li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261(2017).</li>
<li>ImageJ. MTrack2. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/MTrack2">https://imagej.net/MTrack2</a> (2018).</li>
<li>MTrack2. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018).</li>
<li>ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).</li>
<li>ImageJ. Manual Tracking. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018).</li>
<li>ibidi. ibidi Pump System. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. ">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. </a> (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisujemy tutaj metodę analizy migracji komórek, które wykrywają siłę przepływu ścinającego i reagują, zmieniając swoją migrację. Analiza MZB wykazała, że MZB migrują spontanicznie na ICAM-1 i w obecności przepływu będą migrować w górę przepływu. W naszej poprzedniej pracy wykazaliśmy, że MZB nie migrują w górę przepływu na VCAM-1, ale zamiast tego pozostają na swoim miejscu. Mysia strefa brzeżna śledziony zawiera głównie ICAM-1, podczas gdy czerwona miazga zawiera zarówno ICAM-1, jak i VCAM-1. Na podstawie tych danych m...

Komórki odpornościowe są najbardziej ruchliwymi komórkami w ludzkim ciele i często muszą zmagać się z siłą ścinającą spowodowaną przepływem krwi i limfy. Istnieje jednak stosunkowo niewiele badań dotyczących migracji leukocytów wywołanej siłą ścinającą1,2,3,4,5. Przedstawiamy tutaj wiarygodny i ilościowy protokół analizy odpowiedzi komórki odpornościowej na przepływ in vitro. Wykonanie testu nie wymaga wytwarzania komponentów, a cały sprzęt i materiały eksploatacyjne są dostępne na rynku. Protokół, w tym oczyszczanie komórek i analiza migracji, można wykonać w ciągu jednego dnia. Wreszcie, chociaż opisujemy migrację komórek strefy brzeżnej B (MZB), protokół można dostosować do analizy migracji w stosunku do przepływu innych typów komórek odpornościowych. Dlatego możliwe jest wykorzystanie tego testu do systematycznej analizy szerokiego zakresu leukocytów z kompleksowym panelem warunków.
MZB to populacja komórek B, które u myszy znajdują się tylko w śledzionie i krążku między wnętrzem mieszków włosowych a strefami brzeżnymi6,7,8,9. Strefa brzeżna to warstwa komórek odpornościowych o grubości około 5–10 komórek. Warstwa komórkowa otacza pęcherzyk i składa się głównie z MZB i makrofagów, ale także z niezmiennych komórek T natural killer (iNKT), komórek dendrytycznych (DC) i neutrofili, między innymi10. Komórki w strefie brzeżnej są narażone na jednokierunkowy przepływ krwi pochodzący z tętnic śledzionowych, które kończą się w zatoce brzeżnej otaczającej pęcherzyk. Krew przepływa z otworów w zatoce brzeżnej przez strefę brzeżną, a następnie jest zbierana w zatokach żylnych w czerwonej miazdze i przywracana do krążenia11. Swobodny przepływ krwi obmywa MZB i wystawia je na działanie antygenów przenoszonych we krwi. MZB przenoszą antygen do pęcherzyka, automatycznie przemieszczając się między strefą brzeżną a wnętrzem pęcherzyka, który nie jest narażony na działanie krwi. Tak więc, gdy MZB przemieszczają się w kierunku pęcherzyka, muszą migrować w górę siły ścinającej przepływu krwi12 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
W tym protokole opisujemy, jak ilościowo określić, jak komórki odpornościowe, takie jak MZB, reagują na brak lub wysoki przepływ in vitro, aby ujawnić, jak są zaprogramowane do migracji in vivo. W pierwszym etapie MZB są oczyszczane ze śledziony myszy za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami z dostępnych na rynku zestawów. Świeżo wyizolowane MZB wprowadza się do studzienki szkiełka komory przepływowej, pozostawia do osadzenia na ligandach integrynowych i wystawia na przepływ bufora migracyjnego za pomocą systemu pomp (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Komórki są obrazowane za pomocą systemu mikroskopii poklatkowej. Obrazy są następnie przetwarzane do analizy za pomocą bezpłatnej wtyczki ImageJ, MTrack213,14, aby automatycznie śledzić komórki. Ścieżki można następnie określić ilościowo za pomocą bezpłatnego narzędzia Ibidi Chemotaxis15 w celu określenia różnych parametrów, w tym prędkości, prostoliniowości i indeksu migracji. Wartości te można wykorzystać do określenia wpływu inhibitorów migracji, stymulatorów komórek, chemokin i innych substancji chemicznych wpływających na migrację wywołaną przepływem ścinającym w celu zrozumienia sił kontrolujących ruch komórek odpornościowych in vivo.

<table><tbody><tr><td>Filtr siatkowy VWR, 70 &micro; m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>Filtry z separacją wstępną, 30 i mikro; m</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek MZB i FOB</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-366</td><td></td></tr><tr><td>B220 CD45R, klon RA3-6B2, FITC</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>CD21 / CD 35, klon 7G6, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>558658</td><td></td></tr><tr><td>CD23, klon B3B4, PE</td><td>Biolegend</td><td>101608</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Biochrom</td><td>L2035</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS 1x</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>BSA albumina frakcja V, bez kwasów tłuszczowych</td><td>Roth</td><td>"0052.3"</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>796-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi &mikro-prowadnice VI 0.4, hydrofobowe, niepowlekane</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw perfuzyjny, biały, 50 cm, 0.8 mm</td><td>Ibidi</td><td>10963</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi System pompowy</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy b in vitro

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Komórki B strefy brzeżnej (MZB) to populacja komórek B, które znajdują się w strefach brzeżnych śledziony myszy otaczających mieszki włosowe. Aby dotrzeć do mieszków włosowych, MZB muszą migrować w górę siły ścinającej przepływu krwi. Przedstawiamy tutaj metodę analizy tej indukowanej przepływem migracji MZB in vitro. Po pierwsze, MZB są izolowane ze śledziony myszy. Po drugie, MZB są osadzane na ligandach integrynowych w szkiełkach komory przepływowej, wystawiane na działanie przepływu ścinającego i obrazowane pod mikroskopem podczas migracji. Po trzecie, obrazy migrujących MZB są przetwarzane za pomocą wtyczki MTrack2 do automatycznego śledzenia komórek dla ImageJ, a wynikowe ścieżki komórek są określane ilościowo za pomocą narzędzia chemotaksji Ibidi. Dane migracyjne ujawniają, jak szybko poruszają się komórki, jak często zmieniają kierunek, czy wektor przepływu ścinającego wpływa na ich kierunek migracji i które ligandy integrynowe są zaangażowane. Chociaż używamy MZB, metodę tę można łatwo dostosować do analizy migracji dowolnego leukocytu, który reaguje na siłę przepływu ścinającego.

Wykorzystaliśmy opisany powyżej protokół, aby porównać migrację MZBs na szkiełkach pokrytych ICAM-1 bez przepływu (0 dyn/cm2) oraz pod wpływem przepływu ścinającego (4 dyn/cm2). Komórki śledzono automatycznie za pomocą programu MTrack2, a powstałe pliki ścieżek nałożono na nagrania wideo z migracji komórek dla braku przepływu (0 dyn/cm2) oraz przepływu (4 dyn/cm2), aby przedstawić rozkład i kształt ścieżek (Rysunek 4A</stron...

Komórki strefy brzeżnej B (MZB) reagują na siłę przepływu ścinającego, reorientując swoją ścieżkę migracji w górę przepływu. Protokół ten pokazuje, jak rejestrować i analizować migrację za pomocą jednostki fluidyki, pompy, systemu obrazowania mikroskopowego i bezpłatnego oprogramowania.

Analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy B in vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych pytań w dziedzinie migracji komórek odpornościowych, takich jak to, w jaki sposób cytoszkielet wysyła siły ścinające oraz jak ligandy i chemokiny integryny wpływają na indukowaną przepływem migrację leukocytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to nowy rodzaj testu migracji, który jest łatwy do wykonania dla początkujących. Korzysta wyłącznie z komercyjnie dostępnego sprzętu i odczynników, a także wolnego oprogramowania.Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w komórki brzeżnej strefy B, można ją również zastosować do innych komórek odpornościowych, takich jak aktywowane limfocyty T. W dniu poprzedzającym eksperyment rozmrozić podwielokrotność ICAM-1 i rozcieńczyć ją w PBS do końcowego stężenia pięciu mikrogramów na mililitr. Następnie dodaj 30 mikrolitrów ICAM-1 do żądanych komór szkiełka przepływowego.Umieść szkiełko w wilgotnej komorze i ustaw je na cztery stopnie Celsjusza do inkubacji przez noc. Następnego dnia umyj komorę, dodając 100 mikrolitrów PBS do jednej studzienki, a następnie pobierając 100 mikrolitrów z drugiej studzienki komory. Następnie dodać 100 mikrolitrów buforu blokującego do komory i inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 90 minut.Następnie umyj komorę, dodając 100 mikrolitrów PBS do jednej studzienki, wycofując ją z drugiej studzienki, a następnie dodaj do komory 100 mikrolitrów buforu migracyjnego. Zjeżdżalnia jest teraz gotowa do użycia. Przechowuj go w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej do czasu eksperymentu.Najpierw podłącz pompę płynu i podłącz jednostkę fluidyki. Następnie włącz oprogramowanie pompy. Następnie umyj rurkę raz za pomocą pięciu do 10 mililitrów buforu migracyjnego.Zajmie to około minuty. Następnie dodaj 11,7 mililitra bufora migracyjnego równomiernie do obu zbiorników i usuń pęcherzyki powietrza. Teraz zaciśnij rurkę około 10 centymetrów od łącznika i umieść jednostkę fluidyczną w podgrzewanej komorze inkubacyjnej na mikroskopie.W oprogramowaniu ustaw wybór prowadnicy na mikrosuwak VI 0,4, a opcję wężyka na biały. Ustaw również żądane naprężenie ścinające na około cztery dyny na centymetr kwadratowy, a czas obrazowania na 30 minut. Następnie ustaw żądane natężenie przepływu i naprężenie ścinające, wprowadzając wartości do oprogramowania pompy.Następnie podgrzej wstępnie komorę inkubacyjną mikroskopu, jednostkę fluidyki i podwielokrotności bufora migracyjnego do 37 stopni Celsjusza. Po ogrzaniu przetestuj pompę fluidyczną, upewniając się, że bufor migracyjny przepływa tam iz powrotem w zbiornikach i że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza. Najpierw wyizoluj leukocyty i oczyść komórki brzeżnej strefy B, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.Następnie wyczyść spód szkiełka chusteczką zwilżoną etanolem. Dodać 30 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do jednej studzienki komory i pobrać 30 mikrolitrów zmagazynowanego buforu migracyjnego z drugiej studzienki. Przykryj szkiełko i inkubuj je przez 30 minut, aby komórki mogły się przyczepić.Następnie powoli dodawaj wstępnie podgrzany bufor migracyjny do każdej studzienki szkiełka, aż dodatni menisk wynurzy się ze studzienki. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety. Ważne jest, aby zachować spójność z czynnikami wpływającymi na adhezję komórek, dlatego należy utrzymywać i komórki pod kątem 37 stopni i unikać używania nadmiernej siły podczas pipetowania buforu do komory.Clamp szkiełko do stolika mikroskopu i usuń nieoznaczoną stronę rurki płynowej z elementu złącza. Następnie napełnij koniec rurki buforem migracyjnym, aż z końca wynurzy się dodatni menisk bez pęcherzyków powietrza. Odwróć koniec rurki i włóż ją do górnej studzienki komory przepływowej.Trzymając rurkę zaciśniętą, powtórz procedurę dla zaznaczonego końca rurki. Teraz przełącz system obrazowania w tryb Live i wybierz pole view, które znajduje się w środku slajdu. Tutaj ustaw ostrość na komórkach, a następnie nieznacznie zmniejsz ostrość, aby uwydatnić kontur komórek i uzyskać białe wnętrze.Czarne tło i biały środek będą łatwiejsze w użyciu w programie do automatycznego śledzenia. Skonfiguruj program sekwencji obrazowania, aby rejestrować jeden obraz co pięć sekund przez 30 minut przy użyciu 10-krotnie suchego obiektywu. Następnie rozpocznij nagrywanie.Zdejmij zacisk z rurki i włącz pompę. Spowoduje to, że nieprzylegające komórki zostaną zmyte, a przylegające komórki zaczną migrować. Na końcu programu do obrazowania oznacz i zapisz film.W przypadku stosowania inhibitora lub modyfikatora migracji komórek, można go dodać do komórek w zawiesinie komórkowej przed umieszczeniem ich na szkiełku lub do bufora migracyjnego w jednostce fluidyki. Aby rozpocząć automatyczną analizę ścieżki migracji, otwórz program ImageJ. Skopiuj plik MTrack2_kt Java do folderu ImageJ Plugins.W menu Wtyczki wybierz opcję Kompiluj i uruchom. Następnie uruchom ponownie ImageJ, a wtyczka powinna pojawić się w menu Wtyczki. Otwórz stos obrazów z filmu migracji komórek w ImageJ i przetwórz obrazy, jak pokazano tutaj, w celu przekonwertowania wideo z kolorowych klatek na obrazy o wysokim kontraście, pokazujące komórki jako czarne obiekty na białym tle.Następnie dwukrotnie wyostrz obrazy, usuń plamki na obrazach, a następnie przekonwertuj obrazy na ośmiobitowe. W menu Obraz przejdź do podmenu Dostosuj jasność/kontrast i ustaw suwak Kontrast na maksymalny kontrast. Spowoduje to, że komórki będą wyglądać jak białe obiekty na czarnym tle.Następnie wróć do podmenu Dostosuj próg, aby upewnić się, że komórki są wyświetlane jako czarne obiekty na białym tle. Teraz uruchom wtyczkę do automatycznego śledzenia komórek MTrack2 kt. Na ekranie opcji ustaw minimalny rozmiar cząstek na jeden piksel, a maksymalny rozmiar cząstek na 30 pikseli.Ustaw wartość prędkości na 10 pikseli, chociaż komórki strefy brzeżnej B zazwyczaj nie przekraczają dwóch pikseli w kolejnych klatkach oddalonych od siebie o pięć sekund. Ścieżki komórek są teraz gotowe do analizy za pomocą narzędzia chemotasji ibidi. Te dwa pola pokazują ścieżki migracji komórek strefy brzeżnej B, które zostały wysiane na szkiełkach pokrytych ICAM-1.Komórki były śledzone automatycznie za pomocą MTrack2 przy użyciu metod opisanych w tym artykule. Po lewej stronie komórki zostały zobrazowane w warunkach statycznych, a po prawej komórki zostały wystawione na działanie przepływu ścinającego wynoszącego cztery dyny na centymetr kwadratowy. Poszczególne ścieżki komórek można zaimportować do narzędzia ibidi Chemotaxis Tool w celu wygenerowania wykresów ścieżek każdego filmu.W tym przypadku poszczególne ścieżki komórek są pokolorowane na czerwono, aby wskazać, że zakończyły się poniżej punktu początkowego, lub na czarno, jeśli zakończyły się powyżej. Przedstawiono tutaj analizę ścieżek komórek z czterech oddzielnych filmów zarówno dla warunków przepływu, jak i braku przepływu. Obejmuje to średni wskaźnik migracji kierunkowej, prędkość komórki, prostoliniowość ścieżki i końcową odległość w linii prostej dla obu warunków.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować kierunkową migrację komórek strefy brzeżnej B w kierunku przepływu ścinającego i jak automatycznie śledzić komórki. Podczas tej procedury można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia TIRF, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jak cytoszkielet i integryny reagują na naprężenia ścinające?

analysis-shear-flow-induced-migration-murine-marginal-zone-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Migracja limfocytów T zachodzi podczas homingu do organów limfatycznych, opuszczania naczyń krwionośnych i wnikania do tkanek obwodowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który może być wykorzystany do analizy migracji limfocytów T in vitro.

Izolacja, hodowla i analiza migracji ludzkich limfocytów T in vitro

Trójwymiarowa komora przepływowa to nowatorska technologia in vitro do ilościowej i stopniowej oceny kaskady wynaczynień komórek krążących w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W związku z tym urządzenie spełnia krytyczną potrzebę podstawowych, przedklinicznych i klinicznych badań migracji komórek.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Opisano test na myszach do śledzenia migracji komórek ze skóry do drenującego węzła chłonnego, który umożliwia scharakteryzowanie komórek dendrytycznych skóry zmobilizowanych do węzła chłonnego po zakażeniu opuszki stopy Bacille Calmette-Guérin.

Test oparty na CFSE do badania migracji komórek dendrytycznych skóry myszy do drenujących węzłów chłonnych podczas zakażenia Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin

Tutaj opisujemy model ludzkiej bariery krew-mózg, umożliwiający badanie transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Poznaj analizę migracji komórek B brzeżnej strefy indukowanej przepływem ścinającym in vitro. Ta metoda wykorzystuje jednostkę płynową i mikroskopię do badania dynamiki komórek immunologicznych.

Analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy B in vitro

Przeglądaj więcej filmów