Analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy B in vitro

Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych pytań w dziedzinie migracji komórek odpornościowych, takich jak to, w jaki sposób cytoszkielet wysyła siły ścinające oraz jak ligandy i chemokiny integryny wpływają na indukowaną przepływem migrację leukocytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to nowy rodzaj testu migracji, który jest łatwy do wykonania dla początkujących. Korzysta wyłącznie z komercyjnie dostępnego sprzętu i odczynników, a także wolnego oprogramowania.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w komórki brzeżnej strefy B, można ją również zastosować do innych komórek odpornościowych, takich jak aktywowane limfocyty T. W dniu poprzedzającym eksperyment rozmrozić podwielokrotność ICAM-1 i rozcieńczyć ją w PBS do końcowego stężenia pięciu mikrogramów na mililitr. Następnie dodaj 30 mikrolitrów ICAM-1 do żądanych komór szkiełka przepływowego.

Umieść szkiełko w wilgotnej komorze i ustaw je na cztery stopnie Celsjusza do inkubacji przez noc. Następnego dnia umyj komorę, dodając 100 mikrolitrów PBS do jednej studzienki, a następnie pobierając 100 mikrolitrów z drugiej studzienki komory. Następnie dodać 100 mikrolitrów buforu blokującego do komory i inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 90 minut.

Następnie umyj komorę, dodając 100 mikrolitrów PBS do jednej studzienki, wycofując ją z drugiej studzienki, a następnie dodaj do komory 100 mikrolitrów buforu migracyjnego. Zjeżdżalnia jest teraz gotowa do użycia. Przechowuj go w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej do czasu eksperymentu.

Najpierw podłącz pompę płynu i podłącz jednostkę fluidyki. Następnie włącz oprogramowanie pompy. Następnie umyj rurkę raz za pomocą pięciu do 10 mililitrów buforu migracyjnego.

Zajmie to około minuty. Następnie dodaj 11,7 mililitra bufora migracyjnego równomiernie do obu zbiorników i usuń pęcherzyki powietrza. Teraz zaciśnij rurkę około 10 centymetrów od łącznika i umieść jednostkę fluidyczną w podgrzewanej komorze inkubacyjnej na mikroskopie.

W oprogramowaniu ustaw wybór prowadnicy na mikrosuwak VI 0,4, a opcję wężyka na biały. Ustaw również żądane naprężenie ścinające na około cztery dyny na centymetr kwadratowy, a czas obrazowania na 30 minut. Następnie ustaw żądane natężenie przepływu i naprężenie ścinające, wprowadzając wartości do oprogramowania pompy.

Następnie podgrzej wstępnie komorę inkubacyjną mikroskopu, jednostkę fluidyki i podwielokrotności bufora migracyjnego do 37 stopni Celsjusza. Po ogrzaniu przetestuj pompę fluidyczną, upewniając się, że bufor migracyjny przepływa tam iz powrotem w zbiornikach i że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza. Najpierw wyizoluj leukocyty i oczyść komórki brzeżnej strefy B, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.

Następnie wyczyść spód szkiełka chusteczką zwilżoną etanolem. Dodać 30 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do jednej studzienki komory i pobrać 30 mikrolitrów zmagazynowanego buforu migracyjnego z drugiej studzienki. Przykryj szkiełko i inkubuj je przez 30 minut, aby komórki mogły się przyczepić.

Następnie powoli dodawaj wstępnie podgrzany bufor migracyjny do każdej studzienki szkiełka, aż dodatni menisk wynurzy się ze studzienki. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety. Ważne jest, aby zachować spójność z czynnikami wpływającymi na adhezję komórek, dlatego należy utrzymywać i komórki pod kątem 37 stopni i unikać używania nadmiernej siły podczas pipetowania buforu do komory.

Clamp szkiełko do stolika mikroskopu i usuń nieoznaczoną stronę rurki płynowej z elementu złącza. Następnie napełnij koniec rurki buforem migracyjnym, aż z końca wynurzy się dodatni menisk bez pęcherzyków powietrza. Odwróć koniec rurki i włóż ją do górnej studzienki komory przepływowej.

Trzymając rurkę zaciśniętą, powtórz procedurę dla zaznaczonego końca rurki. Teraz przełącz system obrazowania w tryb Live i wybierz pole view, które znajduje się w środku slajdu. Tutaj ustaw ostrość na komórkach, a następnie nieznacznie zmniejsz ostrość, aby uwydatnić kontur komórek i uzyskać białe wnętrze.

Czarne tło i biały środek będą łatwiejsze w użyciu w programie do automatycznego śledzenia. Skonfiguruj program sekwencji obrazowania, aby rejestrować jeden obraz co pięć sekund przez 30 minut przy użyciu 10-krotnie suchego obiektywu. Następnie rozpocznij nagrywanie.

Zdejmij zacisk z rurki i włącz pompę. Spowoduje to, że nieprzylegające komórki zostaną zmyte, a przylegające komórki zaczną migrować. Na końcu programu do obrazowania oznacz i zapisz film.

W przypadku stosowania inhibitora lub modyfikatora migracji komórek, można go dodać do komórek w zawiesinie komórkowej przed umieszczeniem ich na szkiełku lub do bufora migracyjnego w jednostce fluidyki. Aby rozpocząć automatyczną analizę ścieżki migracji, otwórz program ImageJ. Skopiuj plik MTrack2_kt Java do folderu ImageJ Plugins.

W menu Wtyczki wybierz opcję Kompiluj i uruchom. Następnie uruchom ponownie ImageJ, a wtyczka powinna pojawić się w menu Wtyczki. Otwórz stos obrazów z filmu migracji komórek w ImageJ i przetwórz obrazy, jak pokazano tutaj, w celu przekonwertowania wideo z kolorowych klatek na obrazy o wysokim kontraście, pokazujące komórki jako czarne obiekty na białym tle.

Następnie dwukrotnie wyostrz obrazy, usuń plamki na obrazach, a następnie przekonwertuj obrazy na ośmiobitowe. W menu Obraz przejdź do podmenu Dostosuj jasność/kontrast i ustaw suwak Kontrast na maksymalny kontrast. Spowoduje to, że komórki będą wyglądać jak białe obiekty na czarnym tle.

Następnie wróć do podmenu Dostosuj próg, aby upewnić się, że komórki są wyświetlane jako czarne obiekty na białym tle. Teraz uruchom wtyczkę do automatycznego śledzenia komórek MTrack2 kt. Na ekranie opcji ustaw minimalny rozmiar cząstek na jeden piksel, a maksymalny rozmiar cząstek na 30 pikseli.

Ustaw wartość prędkości na 10 pikseli, chociaż komórki strefy brzeżnej B zazwyczaj nie przekraczają dwóch pikseli w kolejnych klatkach oddalonych od siebie o pięć sekund. Ścieżki komórek są teraz gotowe do analizy za pomocą narzędzia chemotasji ibidi. Te dwa pola pokazują ścieżki migracji komórek strefy brzeżnej B, które zostały wysiane na szkiełkach pokrytych ICAM-1.

Komórki były śledzone automatycznie za pomocą MTrack2 przy użyciu metod opisanych w tym artykule. Po lewej stronie komórki zostały zobrazowane w warunkach statycznych, a po prawej komórki zostały wystawione na działanie przepływu ścinającego wynoszącego cztery dyny na centymetr kwadratowy. Poszczególne ścieżki komórek można zaimportować do narzędzia ibidi Chemotaxis Tool w celu wygenerowania wykresów ścieżek każdego filmu.

W tym przypadku poszczególne ścieżki komórek są pokolorowane na czerwono, aby wskazać, że zakończyły się poniżej punktu początkowego, lub na czarno, jeśli zakończyły się powyżej. Przedstawiono tutaj analizę ścieżek komórek z czterech oddzielnych filmów zarówno dla warunków przepływu, jak i braku przepływu. Obejmuje to średni wskaźnik migracji kierunkowej, prędkość komórki, prostoliniowość ścieżki i końcową odległość w linii prostej dla obu warunków.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować kierunkową migrację komórek strefy brzeżnej B w kierunku przepływu ścinającego i jak automatycznie śledzić komórki. Podczas tej procedury można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia TIRF, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jak cytoszkielet i integryny reagują na naprężenia ścinające?