Name: Otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę suszenia chemicznego do analizy morfologicznej organizmów prokariotycznych i eukariotycznych w mikroskopii elektronowej SEM. Protokół wykorzystuje HMDS i TBA do przygotowania próbek bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu dla MLS i Summer Scholar Award dla MAK od Biura Badań i Studiów Podyplomowych na Central Michigan University. Sinice zostały dostarczone przez laboratorium Zimba i planktonu, będące częścią Center for Coastal Studies, Texas A&M University w Corpus Christi. Euglenoidy zostały dostarczone przez laboratorium Triemera na Uniwersytecie Stanowym Michigan.

1. Przygotowanie i utrwalenie
<ol>
	<li>Przygotuj sinice.
	<ol>
		<li>Hoduj kultury jednoosobowe w F/2 media24,25 w temperaturze 28 °C w cyklu 14:10 h jasnociemnym. Przenieść wystarczającą ilość kultury do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml tak, aby po odczekaniu 15 minut na osiadanie, osad bakteryjny miał wielkość około 0,05 ml. Usunąć pożywkę i zastąpić ją 1,5 ml utrwalacza (1,25% aldehydu glutarowego, 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,0), delikatnie odwrócić kilka razy i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś stałe komórki za pomocą szklanej pipety do zestawu filtracyjnego o pojemności 10 ml (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 1) zawierającego filtr z poliwęglanu o średnicy 25 mm z porami 0,8 lub 0,2 μm, w zależności od wielkości komórek. Uszczelnij ramię boczne i lejek gumowymi korkami, aby zatrzymać kulturę w lejku. Usunąć utrwalacz poprzez delikatne podciśnienie na kolbie filtracyjnej, po usunięciu obu korków. 
		Uwaga: Jeśli gęstość komórek na filtrze poliwęglanowym nie jest optymalna, dostosuj ilość użytej kultury wyjściowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj glony jednokomórkowe (euglenoidy).
	<ol>
		<li>Hoduj kultury jednoglonów w pożywkach AF-6 pożywka26 z 150 ml L-1 komercyjnie dostępnego podłoża glebowo-wodnego dodanego do podłoża, w temperaturze 22 °C w cyklu 14:10 h jasnociemnym. Przenieś 2 ml kultury o niskiej gęstości (OD600 < 0,5) za pomocą szklanej pipety do 10 ml zestawu filtracyjnego (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1) zawierającego filtr poliwęglanowy 25 mm z porami 8 μm. Uszczelnij ramię boczne i lejek gumowymi korkami, aby zatrzymać kulturę w lejku. 
		Uwaga: Jeśli gęstość komórek na filtrze poliwęglanowym nie jest optymalna, dostosuj ilość użytej kultury wyjściowej.</li>
		<li>Dodać trzy krople 4% tetratlenku osmu (OsO4) bezpośrednio do kultury i pozostawić do inkubacji na 30 minut. Usunąć utrwalacz za pomocą delikatnego podciśnienia na kolbie filtracyjnej, po usunięciu obu korków. 
		Uwaga: OsO4 jest ostrą toksyną (drogą skórną, doustną i wziewną), dla skóry, uszkadzającą oczy i działającą uczulająco na drogi oddechowe. Z OsO4 należy obchodzić się pod wyciągiem chemicznym przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej, w tym rękawic, fartucha laboratoryjnego i ochrony oczu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj Drosophila melanogaster (muszka owocowa)23.
	<ol>
		<li>Znieczulenie dorosłych much za pomocą 100% dwutlenku węgla. Umieść znieczulone dorosłe osoby (około 10 do 30 much) w małej plastikowej fiolce z zakrętką lub probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Zanurzyć znieczulone muchy w 1 ml utrwalacza (1,25% aldehydu glutarowego, 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,2) na 2 godziny (lub na noc) w temperaturze 4 °C. Jeśli muchy wypłyną na powierzchnię utrwalacza, dodaj kilka kropli 2,5% eteru tert-oktylofenylowego glikolu polietylenowego, aby osłabić napięcie powierzchniowe utrwalacza, umożliwiając całkowite zanurzenie tkanki. Usunąć utrwalacz za pomocą szklanej pipety.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mycie i odwodnienie
<ol>
	<li>Umyj i odwodnij sinice.
	<ol>
		<li>Przemyć utrwaloną próbkę trzykrotnie 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,0 w temperaturze pokojowej przez 10 minut każda. Kolbę i lejek należy zakorkować, aby utrzymać pranie. Każde płukanie należy delikatnie odkurzyć kolby filtracyjnej, po usunięciu obu korków.</li>
		<li>Odwodnić próbkę, utrzymując ciągłe zanurzenie, używając serii stopniowanego etanolu, przez 10 minut w objętości 5 ml w lejku. Stopniowane stężenia etanolu to: 25%, 50%, 75%, 95% i 2 zmiany 100% etanolu. Kolbę i lejek należy przechowywać w korku, aby zatrzymać etanol w lejku, zapobiegając jego utracie zarówno w wyniku parowania, jak i pasywnego przepływu przez filtr.</li>
		<li>Usunąć etanol za pomocą delikatnego podciśnienia z kolby filtracyjnej, po usunięciu obu korków. Przenieś filtr/próbkę do jednorazowego aluminiowego naczynia wagowego zawierającego tylko tyle 100% etanolu, aby pokryć próbkę przed suszeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj i odwadnij glony jednokomórkowe (euglenoidy).
	<ol>
		<li>Przemyć utrwaloną próbkę trzykrotnie 5 ml dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej przez 10 minut każde. Kolbę i lejek zatkać korkiem, tak aby zawierał płyn do lejka. Każde płukanie należy delikatnie odkurzyć kolby filtracyjnej, po usunięciu obu korków.</li>
		<li>Odwodnić próbkę, utrzymując ciągłe zanurzenie, używając serii stopniowanego etanolu przez 10 minut w objętości 5 ml w lejku. Stopniowane stężenia etanolu to: 25%, 50%, 75%, 95% i 2 zmiany 100% etanolu. Kolbę i lejek należy przechowywać w korku, aby zatrzymać etanol w lejku, zapobiegając jego utracie zarówno w wyniku parowania, jak i pasywnego przepływu przez filtr.</li>
		<li>Usunąć etanol za pomocą delikatnego podciśnienia z kolby filtracyjnej, po usunięciu obu korków. Przenieś filtr/próbkę do jednorazowego aluminiowego naczynia wagowego zawierającego tylko tyle 100% etanolu, aby pokryć próbkę przed suszeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj i odwodnij Drosophila melanogaster (muszka owocowa).
	<ol>
		<li>Przemyć utrwaloną próbkę trzykrotnie 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,2 w temperaturze pokojowej przez 10 minut w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Każde pranie należy usuwać szklaną pipetą, uważając, aby nie usunąć much.</li>
		<li>Odwodnić próbkę za pomocą serii stopniowanych etanoli przez 10 minut w objętości 1 ml w probówce do mikrofuge. Stężenia etanolu wynoszą: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Usuń etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie usunąć much.</li>
		<li>Przechowywać próbkę w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z wystarczającą ilością 100% etanolu, aby pokryć próbkę przed suszeniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Suszenie
<ol>
	<li>Przeprowadź suszenie chemiczne przy użyciu alkoholu t-butylowego (TBA)27.
	<ol>
		<li>Zastąp 100% roztwór etanolu roztworem TBA i 100% etanolu 1:1 na 20 min. Zastąp roztwór 1:1 100% TBA na 20 min. Powtórz dwukrotnie. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 37 °C, aby TBA nie zamarzł. 
		Uwaga: 100% TBA ma temperaturę zamarzania 25,5 °C; Roztwór 1:1 nie zamarznie w temperaturze pokojowej. TBA jest łatwopalny, powoduje poważne podrażnienie oczu, jest szkodliwy w przypadku wdychania i może powodować podrażnienie dróg oddechowych, senność lub zawroty głowy. TBA należy obchodzić się z dygestoriami chemicznymi przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic, fartucha laboratoryjnego i ochrony oczu.</li>
		<li>Przenieść próbkę w TBA, jeśli znajduje się w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, do jednorazowego aluminiowego naczynia wagowego. Po umieszczeniu w aluminiowym naczyniu wagowym usuń TBA i zastąp go wystarczającą ilością świeżego 100% TBA, aby pokryć próbkę. Zamrażać TBA w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Przenieść do eksykatora próżniowego (słoika dzwonowego) z zamrożonymi wkładami żelowymi, aby utrzymać TBA w stanie zamrożonym. Opróżnić i utrzymać próżnię za pomocą pompy rotacyjnej, aby umożliwić wyschnięcie próbki poprzez sublimację próżniową zamrożonego TBA przez co najmniej 3 godziny lub przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź suszenie chemiczne przy użyciu heksametylodylazanu (HMDS)20.
	<ol>
		<li>Zastąp 100% roztwór etanolu roztworem HMDS i 100% etanolu w proporcji 1:2 przez 20 min. Zastąp roztwór 1:2 roztworem HMDS i 100% etanolu w proporcji 2:1 na 20 min. Zastąp roztwór 2:1 roztworem 100% HMDS na 20 min. Powtórz raz. 
		Uwaga: HMDS jest łatwopalny i jest ostrą toksyną (drogą skórną). Z HMDS należy obchodzić się pod wyciągiem chemicznym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic, fartucha laboratoryjnego i ochrony oczu.</li>
		<li>Przenieść próbkę w HMDS, jeśli znajduje się w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, do jednorazowego aluminiowego naczynia wagowego. Po umieszczeniu w aluminiowym naczyniu wagowym wymień 100% gogle HMDS na tyle świeże, aby pokryć próbkę.</li>
		<li>Przenieść próbkę do plastikowego lub szklanego eksykatora bez próżni ze świeżym środkiem osuszającym (o głębokości 5-6 cm) i umieścić w dygestoriach chemicznych. Alternatywnie, umieść próbkę bezpośrednio w dygestoriach chemicznych do wyschnięcia z luźną pokrywką, taką jak pudełko, aby zapobiec spadaniu zanieczyszczeń na próbkę. Pozostawić próbkę do wyschnięcia na 12–24 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Montaż
<ol>
	<li>Zamontuj cyjanobakterie i euglenoidy.
	<ol>
		<li>Oznacz spód aluminiowego króćca montażowego o średnicy 12 lub 25 mm, aby wskazać, co jest umieszczane na górze. Pokrój filtr poliwęglanowy z wysuszonymi komórkami na ćwiartki za pomocą czystej żyletki lub skalpela, jeśli używasz króćca 12 mm, lub umieść cały filtr, jeśli używasz króćca 25 mm.</li>
		<li>Umieść każdy filtr na kleju lub zakładce kleju węglowego przymocowanej do górnej części króćca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mount Drosophila melanogaster (muszka owocowa).
	<ol>
		<li>Oznacz dolną część aluminiowego króćca montażowego, aby wskazać, co jest umieszczane na górze. 
		Umieść wysuszone muchy w żądanej pozycji na kleju lub kleju węglowym przymocowanym do górnej części kikuta pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą precyzyjnej pęsety.</li>
		<li>Nałóż srebrny klej przewodzący, tj. srebrną farbę, wokół zewnętrznych krawędzi kkońców. Połącz srebrną farbę z muchami za pomocą wykałaczki, aby zapewnić przewodność. Nie pozwól, aby farba dotknęła żądanego obszaru obrazowania.</li>
		<li>Umieść króćce w pudełku z uchwytem na króćce i umieść otwarte pudełko z uchwytem na króćce w eksykatorze. Pozostaw srebrną farbę do wyschnięcia na co najmniej 3 godziny lub na noc, aby uzyskać najlepsze rezultaty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Powłoka napylająca
<ol>
	<li>Przygotuj aparat do napylania napylającego, wykonując cztery do pięciu płukań argonem. Jeśli wilgotność jest wysoka (tj. powietrze w pomieszczeniu jest wilgotne, zwykle około 50% wilgotności względnej), wykonaj od sześciu do siedmiu płukań. Napyl króćce zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Próbki sierści na podstawie użytej próbki:
	<ol>
		<li>W przypadku filtrów z sinicami ustaw timer tak, aby napylał warstwę na 180 s prosto.</li>
		<li>W przypadku filtrów z algami eukariotycznymi, tj. euglenoidami, ustaw timer tak, aby napylał warstwę przez 120 s prosto, a następnie 20 s z trzech stron pod kątem 45°.</li>
		<li>W przypadku dużych próbek, tj. głowic muchowych, ustaw timer tak, aby napylał warstwę przez 60 s prosto, a następnie 30 s z każdej strony pod kątem 45°. 
		Uwaga: Po zakończeniu powlekania kikuty powinny mieć kolor jasnoszary.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Obrazowanie
<ol>
	<li>Obrazowanie próbek za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, który zawiera detektor elektronów wtórnych (SE).
	<ol>
		<li>W przypadku sinic należy zastosować następujące ustawienia: napięcie akceleratora (AC) 3-5 kV, prąd sondy 20-30 (PC) i odległość robocza 5 mm (WD). W przypadku euglenoidów użyj 3 kV AC, 30 PC i 5 mm WD. W przypadku much należy użyć 5 kV AC, 30 PC i 5 do 10 mm WD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj powiększenie w zależności od rozmiaru detalu lub obiektu, który ma być wizualizowany. Dostosuj stygmaty, przysłony i ostrość, aż uzyskasz wyraźny obraz. Przechwyć obraz przy użyciu ustawień wysokiej rozdzielczości zgodnie z instrukcjami producenta SEM.</li>
</ol>

<ol><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+microscopy%2C+principles+and+techniques+for+biologists%22">Electron microscopy, principles and techniques for biologists</a>. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).</li>
<li>Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldstein%2C+J+%22Scanning+electron+microscopy+and+X-ray+microanalysis%22">Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis</a>. , Springer. New York. (2003).</li>
<li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEgerton%2C+RF+%22Physical+principles+of+electron+microscopy%3A+an+introduction+to+TEM%2C+SEM%2C+and+AEM%22">Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM</a>. , Springer. New York. (2005).</li>
<li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Brain+Mitochondria+Using+Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (113), (2016).</li>
<li>Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Electron+Microscopy+%28SEM%29+Protocols+for+Problematic+Plant%2C+Oomycete%2C+and+Fungal+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li>
<li>Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+Investigating+the+Anatomy+of+the+Ant+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System.</a> Journal of visualized experiments. (129), (2017).</li>
<li>Endres, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+to+Characterize+the+Morphological+Changes+of+Clostridium+difficile+in+Response+to+Antibiotic+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment.</a> Journal of visualized experiments. (123), (2017).</li>
<li>Chan, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Calcification+Events+Using+Live+Optical+and+Electron+Microscopy+Techniques+in+a+Marine+Tubeworm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm.</a> Journal of visualized experiments. (120), (2017).</li>
<li>Miquel Guennoc,, C,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Method+for+Qualitative+Multi-scale+Analysis+of+Bacterial+Biofilms+on+Filamentous+Fungal+Colonies+Using+Confocal+and+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> Journal of visualized experiments. (119), (2017).</li>
<li>Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+Studying+B.+subtilis+Biofilms+as+a+Model+for+Characterizing+Small+Molecule+Biofilm+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors.</a> Journal of visualized experiments. (116), (2016).</li>
<li>Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Keratin-based+Nanofiber+for+Biomedical+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering.</a> Journal of visualized experiments. (108), e53381(2016).</li>
<li>Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+methods+for+the+analysis+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles.</a> Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).</li>
<li>Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+the+mechanical+properties+of+conducting+polymer+coating-substrate+structures+and+their+influencing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).</li>
<li>Hortola, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEM+examination+of+human+erythrocytes+in+uncoated+bloodstains+on+stone%3A+use+of+conventional+as+environmental-like+SEM+in+a+soft+biological+tissue+%28and+hard+inorganic+material%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material).</a> Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).</li>
<li>Joy, D. C. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/36d5/4331704e59ee5cd7c87b0e174cb4188a8f2d.pdf">Scanning electron microscopy for materials characterization.</a> Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).</li>
<li>Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0037073811000650">Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada.</a> Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).</li>
<li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+Labeling+for+Scanning+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li>
<li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).</li>
<li>Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexamethyldisilazane+in+preparation+of+retinal+tissue+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy.</a> Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).</li>
<li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+using+hexamethyldisilazane+for+preparation+of+soft+insect+tissues+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22Preparation+of+Drosophila+eye+specimens+for+scanning+electron+microscopy%22">Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy</a>. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).</li>
<li>Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22549162">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).</li>
<li>Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+model+system+to+study+tau+action%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila model system to study tau action.</a> Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).</li>
<li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li>
<li>Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuillard%2C+RRL+%22Culture+of+Marine+Invertebrate+Animals%22">Culture of Marine Invertebrate Animals</a>. , Plenum Press. New York. (1975).</li>
<li>Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatanabe%2C+MM+%22National+Institute+for+Environmental+Studies%22">National Institute for Environmental Studies</a>. , Tsukuba, Japan. 159(1997).</li>
<li>Inoue, T., Osatake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+drying+method+of+biological+specimens+for+scanning+electron+microscopy%3A+the+t-butyl+alcohol+freeze-drying+method%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Histology+and+Cytology%22%5BJournal%5D)">A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method.</a> Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).</li>
<li>Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatotoxic+cyanobacteria%3A+a+review+of+the+biological+importance+of+microcystins+in+freshwater+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health.+Part+B%2C+Critical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).</li>
<li>Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+fixation+and+photosynthetic+oxygen+evolution+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria.</a> Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).</li>
<li>Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10531-013-0561-x">How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number.</a> Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).</li>
<li>Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1574-6968.1986.tb01396.x">Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces.</a> FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).</li>
<li>Diestra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+oil-degrading+Microcoleus+consortium+by+means+of+confocal+scanning+microscopy%2C+scanning+electron+microscopy+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.</a> Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).</li>
<li>Komárek, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10750-009-0030-4">Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera.</a> Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).</li>
<li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+I.+Patterns+of+strips+and+pores%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).</li>
<li>Leander, B. S., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphology+of+the+euglenid+pellicle.+II.+Diversity+of+strip+substructure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).</li>
<li>Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+evolution+of+the+euglenid+pellicle%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Trends in the evolution of the euglenid pellicle.</a> Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).</li>
<li>Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10">http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10</a> (2012).</li>
<li>Shulman, J. M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modifiers+of+tauopathy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila.</a> Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).</li>
<li>Reinecke, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implicating+calpain+in+tau-mediated+toxicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo.</a> PLoS One. 6 (8), e23865(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy protokół wykorzystujący SEM w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat zewnętrznych cech morfologicznych trzech typów organizmów, które inni mogą zastosować do badania cech wielu typów organizmów lub tkanek. Na każdym etapie protokołu mogą wystąpić potencjalne punkty błędu, które zostały szczegółowo omówione poniżej.
Chociaż podane tutaj objętości utrwalacza i płukania są specyficzne, ogólnie rzecz biorąc, utrwalacz i płukanie powinny być 5-10 razy większe niż ...

Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) wykorzystuje skupioną wiązkę wysokoenergetycznych elektronów do generowania obrazu z elektronów wtórnych, który pokazuje morfologię i topografię próbki1. SEM może być używany do bezpośredniego określania fizycznego rozmiaru próbki, struktury powierzchni i trójwymiarowego kształtu, a także oferuje większą rozdzielczość i większą głębię ostrości w porównaniu z mikroskopią świetlną. Inna forma mikroskopii elektronowej (EM), transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), wykorzystuje skupione elektrony, które przechodzą przez próbkę, generując obrazy z drobnymi szczegółami struktury wewnętrznej. Chociaż TEM ma wyższą rozdzielczość niż światło lub SEM i może być używany do rozdzielania struktur tak małych jak pojedyncze atomy, ma trzy główne wady: obszerne przygotowanie próbki, małe pole widzenia i płytką głębię ostrości2,3. Chociaż istnieją inne wizualizowane protokoły wykorzystujące SEM do badania określonych komórek, organelli lub tkanek4,5,6,7,8,9,10 , ten protokół jest wyjątkowy, ponieważ opisujemy metody, które można szeroko zastosować do szerokiego zakresu organizmów w celu morfologicznym ocena.
SEM znalazł szerokie zastosowania do badania materiałów nieorganicznych, w tym nanocząstek11,12, polymers13, oraz liczne zastosowania w naukach geologicznych, przemysłowych i materiałoznawczych14,15,16. W biologii SEM od dawna jest stosowany jako metoda badania próbek biologicznych, począwszy od pojedynczych białek, a skończywszy na całych organizmach17,18. SEM ma szczególną wartość, ponieważ morfologiczne szczegóły powierzchni mogą być wykorzystywane do informowania o odkryciach naukowych. Analiza SEM to szybka, niedroga i prosta metoda uzyskiwania szczegółowych informacji o strukturze, rozmiarze i charakterystyce powierzchni szerokiej gamy próbek biologicznych.
Ponieważ SEM zwykle działa w wysokiej próżni (minimum 10-6 Torr), aby utrzymać spójną wiązkę szybkich elektronów, żadne ciecze (woda, oleje, alkohole) nie są dozwolone w komorze próbki, ponieważ ciecze uniemożliwiają tworzenie się próżni. W związku z tym wszystkie próbki badane za pomocą SEM muszą zostać odwodnione, zwykle przy użyciu serii stopniowanych etanoli, a następnie poddawane procesowi suszenia w celu usunięcia etanolu. Istnieje kilka metod suszenia tkanek biologicznych do stosowania w SEM, w tym suszenie powietrzem, liofilizacja, użycie urządzenia do suszenia w punkcie krytycznym (CPD) lub suszenie chemiczne przy użyciu alkoholu t-butylowego (TBA) lub heksametylodylazanu (HMDS)19,20,21,22. Najczęściej wybór metody suszenia ma charakter empiryczny, ponieważ każda próbka biologiczna może inaczej reagować na każdą metodę suszenia. Dla każdej próbki wszystkie te metody mogą być odpowiednie, więc porównanie zalet i wad każdej z nich jest przydatne przy wyborze odpowiedniej metody.
Podczas gdy suszenie próbki na powietrzu w temperaturze pokojowej lub w piecu do suszenia (60 °C) jest najprostszą metodą, większość próbek biologicznych wykazuje uszkodzenia spowodowane suszeniem, takie jak wysychanie i zapadanie się, co skutkuje zniekształceniem próbki. Proces liofilizacji usuwa również wodę (lub lód) z próbki, ale wymaga błyskawicznego zamrożenia próbek i umieszczenia ich w próżni w celu usunięcia lodu w procesie sublimacji, co może spowodować uszkodzenie próbki. Dodatkowo użytkownik musi mieć dostęp do liofilizatora. Najczęściej stosowaną metodą odwadniania próbek do SEM jest suszenie w punkcie krytycznym (CPD). W CPD etanol w próbce jest zastępowany ciekłym dwutlenkiem węgla (CO2 ) i w określonych warunkach temperatury i ciśnienia, znanych jako punkt krytyczny (31,1 °C i 1,073 psi), CO2 odparowuje bez wytwarzania napięcia powierzchniowego, skutecznie zachowując w ten sposób cechy morfologiczne i strukturalne próbki. Chociaż doskonalenie zawodowe jest generalnie standardową metodą, ma kilka wad. Po pierwsze, proces ten wymaga dostępu do suszarki w punkcie krytycznym, co jest nie tylko drogie, ale także wymaga użycia ciekłego dwutlenku węgla. Po drugie, wielkość próbki, którą można wysuszyć, jest ograniczona do wielkości komory suszarki w punkcie krytycznym. Po trzecie, wymiana cieczy podczas CPD może powodować turbulencje, które mogą uszkodzić próbkę.
Suszenie chemiczne oferuje wiele zalet w porównaniu z CPD i służy jako odpowiednia alternatywa, która staje się szeroko stosowana w przygotowywaniu próbek SEM. Zastosowanie chemicznych odwadniaczy, takich jak TBA i HMDS, stanowi szybką, niedrogą i prostą alternatywę dla innych metod, przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej próbki. Niedawno wykazaliśmy, że nie było różnicy w integralności tkanki ani jakości końcowego obrazu wykonanego przy użyciu CPD lub TBA jako metody suszenia w tkance siatkówki dorosłego Drosophila23. W przeciwieństwie do CPD, TBA i HMDS nie wymagają przyrządu do suszenia ani ciekłego CO2 i nie ma ograniczeń co do wielkości suszonej próbki. Oprócz uzyskania chemikaliów, do zakończenia procesu suszenia wymagany jest tylko standardowy wyciąg chemiczny i odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). Chociaż zarówno TBA, jak i HMDS są łatwopalne, TBA jest mniej toksyczny i tańszy (około 1/3 kosztu HMDS) niż HMDS.
W tym artykule opisujemy, jak naprawiać, myć, odwadniać, suszyć, montować, napylać i obrazować trzy typy organizmów: cyjanobakterie (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. i nieznany sp.), dwa euglenoidy z rodzaju Monomorphina (M. aenigmatica i M. pseudopyrum) oraz muszka owocowa (Drosophila melanogaster). Organizmy te reprezentują szeroki zakres wielkości (od 0,5 μm do 4 mm) i różnorodności komórkowej (od jednokomórkowych do wielokomórkowych), ale wszystkie są łatwo podatne na analizę SEM, a do przygotowania próbki potrzebne są tylko niewielkie różnice. Protokół ten opisuje metody stosowania odwadniania chemicznego i analizy SEM do badania szczegółów morfologicznych trzech typów organizmów i miałby szerokie zastosowanie do badania wielu typów organizmów i tkanek.

<table><tbody><tr><td>złoto&ndash; pallad</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>91212</td><td></td></tr><tr><td>Srebrny klej przewodzący 503</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Membrany trawione Whatman Nuclepore; średnica 25 mm, wielkość porów 8 i mu; m, poliwęglanowe</td><td>membrany trawione Sigma</td><td>WHA110614</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore; średnica 25 mm, wielkość porów 0,8 & mu; m, poliwęglan,</td><td>Sigma</td><td>WHA110659</td><td></td></tr><tr><td>Membrany trawione ścieżkowo Whatman Nuclepore; średnica 25 mm, wielkość porów 0,2 &mu; m, poliwęglanowa</td><td>aluminiowa szalka wagowa Sigma</td><td>WHA110606</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-100</td><td></td></tr><tr><td>aluminiowe klocki montażowe (12 mm)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>75210</td><td></td></tr><tr><td>aluminiowe króćce montażowe (25 mm)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>75186</td><td></td></tr><tr><td>Zakładki samoprzylepne&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>76760</td><td></td></tr><tr><td>przewodzący klej węglowy</td><td>Tabs Electron Microscopy Sciences</td><td>77825</td><td></td></tr><tr><td>F/2 media</td><td>Kolekcja kultur glonów na Uniwersytecie Teksańskim w Austin</td><td>https://utex.org/products/f_2-medium</td><td>Nie podano numeru katalogowego - patrz link&nbsp;</td></tr><tr><td>AF6 media</td><td>Bigelow - Narodowe Centrum Glonów i Mikrobioty Marin</td><td>https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td><td>Nie podano numeru katalogowego - patrz link&nbsp;</td></tr><tr><td>Gleba wodna podłoże</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>153785</td><td></td></tr><tr><td>Eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego (Triton X-100)</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Hummer 6.2 Sphopper Coater</td><td>Anatech USA</td><td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td><td>Nie podano numeru katalogowego - patrz link&nbsp;</td></tr><tr><td>Hitachi 3400N-II SEM&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2& gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE</td><td>Wygląda na to, że firma nie sprzedaje już tego modelu&nbsp;</td></tr></tbody></table>

otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (sem)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) to powszechnie dostępna technika, która została zastosowana do badania próbek biologicznych, począwszy od pojedynczych białek, a skończywszy na komórkach, tkankach, organellach, a nawet całych organizmach. Protokół ten koncentruje się na dwóch metodach suszenia chemicznego, heksametylodylazanie (HMDS) i alkoholu t-butylowego (TBA), oraz ich zastosowaniu do obrazowania organizmów prokariotycznych i eukariotycznych za pomocą SEM. W tym artykule opisujemy, jak utrwalać, myć, odwadniać, suszyć, montować, napylać i obrazować trzy rodzaje organizmów: cyjanobakterie (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. i nieznany sp.), dwa euglenoidy z rodzaju Monomorphina (M. aenigmatica i M. pseudopyrum) oraz muszka owocowa (Drosophila melanogaster). Celem tego protokołu jest opisanie szybkiej, niedrogiej i prostej metody uzyskiwania szczegółowych informacji o strukturze, rozmiarze i charakterystyce powierzchni okazów, które można szeroko zastosować do szerokiego zakresu organizmów w celu oceny morfologicznej. Pomyślne ukończenie tego protokołu pozwoli innym na wykorzystanie SEM do wizualizacji próbek poprzez zastosowanie tych technik w swoim systemie.

Sianobakterie są prokariotyczną grupą organizmów, które odgrywają kluczową rolę w globalnych cyklach węgla, tlenu i azotu28,29. Z szacowanych 6000 gatunków sianobakterii30 większość posiada śluzową otoczkę, która pokrywa komórki i łączy je ze sobą oraz z innymi strukturami31, co wraz z kształtem może być rozróżnione pod mikroskopem32. Rozmiar komórek, ich kszt...

Analiza SEM jest skuteczną metodą pomagającą w identyfikacji gatunków lub dyskryminacji fenotypowej. Protokół ten opisuje metody badania określonych szczegółów morfologicznych trzech reprezentatywnych typów organizmów i miałby szerokie zastosowanie do badania cech wielu typów organizmów i tkanek.

Otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Protokół ten koncentruje się na dwóch metodach suszenia chemicznego, heksametylodylazanie i alkoholu T-butylowego oraz ich zastosowaniu obrazowania zarówno organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych za pomocą SEM. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona użycia specjalistycznego sprzętu suszącego takiego jak suszarka punktu krytycznego w celu przygotowania próbek do analizy. Protokół ten opisuje metody stosowania odwadniania chemicznego i analizy SEM trzech typów organizmów, ale miałby szerokie zastosowanie do badania wielu typów organizmów i tkanek.Procedurę zademonstruje Madison Koon, studentka studiów licencjackich z mojego laboratorium. Na początek przygotuj sinice przez utrwalanie przez noc. Następnie przenieś je do urządzenia filtracyjnego o pojemności 10 ml zawierającego filtr z poliwęglanu o pojemności 25 ml.Uszczelnij ramię boczne i lejek urządzenia filtracyjnego gumowymi korkami, aby zatrzymać kulturę w lejku. Po usunięciu obu korków, usunąć utrwalacz, delikatnie odkurzając kolbę filtracyjną. Aby przygotować euglenoidy z glonów jednokomórkowych, utrwal je, dodając 3 krople 4% tetratlenku osmu bezpośrednio do kultury, która została wcześniej przeniesiona do 10 ml urządzenia filtracyjnego.Po 30 minutach inkubacji usunąć oba korki i usunąć utrwalacz, delikatnie odkurzając kolbę filtracyjną. Przemyć utrwalone euglenoidy trzykrotnie 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,0 w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut, trzymając kolbę i lejek zamknięte korkami w celu wstrzymania płukania. Po wyjęciu obu korków, usunąć każde płukanie za pomocą delikatnego odkurzenia kolby filtracyjnej.W celu odwodnienia próbki przy ciągłym zanurzeniu, należy użyć serii sortowanych alkoholi etylowych przez dziesięć minut w objętości 5 ml w lejku, trzymając kolbę i lejek zamknięte korkami, aby pomieścić etanol w lejku. Po wyjęciu obu korków delikatnie odkurzyć kolbę filtracyjną, aby usunąć etanol. Przenieść próbkę do jednorazowego aluminiowego naczynia wagowego zawierającego tylko tyle 100% etanolu, aby pokryć próbkę.Aby przeprowadzić chemiczne suszenie euglenoidów za pomocą TBA, najpierw zastąp 100% roztwór etanolu w aluminiowym naczyniu roztworem TBA i 100% etanolu 1 do 1 na dwadzieścia minut. Następnie zastąp roztwór 1 do 1 100% TBA na dwadzieścia minut i powtórz proces dwukrotnie. Usuń TBA i zastąp tylko taką ilością świeżego 100% TBA, aby pokryć próbkę.Umieść naczynie w czterech stopniach Celsjusza na dziesięć minut, aby zamrozić TBA. Przenieść próbkę do eksykatora próżniowego z zamrożonymi wkładami żelowymi, aby utrzymać TBA w stanie zamrożonym. Użyć pompy rotacyjnej do opróżnienia i utrzymania próżni, aby umożliwić wyschnięcie próbki poprzez sublimację próżniową zamrożonego TBA przez co najmniej trzy godziny.Aby zamontować cyjanobakterie w euglenoidach, oznacz spód aluminiowego króćca montażowego o średnicy 25 mm, aby wskazać, co jest umieszczane na górze. Następnie umieść każdy filtr na wypustce z kleju węglowego przymocowanej do górnej części króćca. Aby przygotować Drosophila melanogaster, zanurz znieczulone muchy w 1 ml utrwalacza na dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, upewniając się, że są całkowicie zanurzone.Użyj szklanej pipety, aby usunąć utrwalacz. Przemyć utrwaloną próbkę Drosophila w 1,5 ml probówki mikrowirówkowej trzykrotnie 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,2 w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Użyj szklanej pipety do usunięcia każdego prania, uważając, aby nie usunąć próbki.Następnie odwodnić próbkę w probówce do mikrofuge w objętości 1 ml, używając serii stopniowanych etanoli przez dziesięć minut każda. Użyj szklanej pipety do usunięcia każdego prania, uważając, aby nie usunąć próbki. Trzymaj próbkę w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z wystarczającą ilością 100% etanolu, aby ją przykryć.Aby przeprowadzić chemiczne suszenie much za pomocą HMDS, najpierw zastąp 100% roztwór etanolu roztworem 1 do 2 HMDS i 100% etanolu na dwadzieścia minut. Następnie zastąp roztwór roztworem HMDS i 100% etanolu w proporcji 2 do 1 na dwadzieścia minut. Na koniec zastąp ten roztwór 100% HMDS na dwadzieścia minut, a następnie powtórz proces raz.Przenieś próbkę, która znajduje się w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i goglach HMDS, do jednorazowego aluminiowego naczynia wagowego. Zastąp 100%HMDS wystarczającą ilością świeżego 100%HMDS, aby pokryć próbkę. Umieść próbkę w aluminiowym naczyniu bezpośrednio w okapie oparowym do wyschnięcia z luźną pokrywką, taką jak pudełko, aby zapobiec spadaniu zanieczyszczeń na próbkę i pozostaw do wyschnięcia na 12 do 24 godzin.Aby zamontować Drosophila, oznacz spód aluminiowego króćca montażowego. Użyj precyzyjnej pęsety, aby umieścić suszone muchy w żądanej pozycji na zakładce z kleju węglowego przymocowanej do górnej części kikuta pod mikroskopem preparacyjnym. Nałóż srebrny klej przewodzący wokół zewnętrznych krawędzi kkońców.Użyj wykałaczki, aby połączyć srebrną farbę z muchami, zapewniając przewodność, upewniając się, że farba nie dotyka pożądanego obszaru obrazowania. Umieść klocki w pudełku z króćcami, a następnie umieść otwarte pudełko z klockami w eksykatorze i pozwól srebrnej farbie wyschnąć przez co najmniej trzy godziny. Aby przygotować aparat do napylania napylającego, należy wykonać od 4 do 5 płukań gazowym argonem.W zależności od próbek, które mają być powlekane, ustaw minutnik na różne ustawienia, zgodnie z opisem w rękopisie. Napyl klocki zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec zobrazuj próbki za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, który zawiera wtórny detektor elektronów z ustawieniami zależnymi od użytej próbki.Pomyślne przygotowanie sinic do SEM przy użyciu tego protokołu pozwoliło uzyskać obrazy, na których widoczne są szczegóły komórki, w tym kształt i tekstura powierzchni, a także osłonka śluzu i wypustki z komórek. Zdjęcie SEM nitkowatego gatunku słodkowodnego z Kolorado pokazuje widoczną osłonę śluzu. Obraz SEM bakterii słodkowodnej z Ohio ujawnia pojedyncze komórki, które czasami tworzą kolonie utrzymywane razem przez cienką warstwę śluzu.Przypominające włókna wypukłości rozciągają się z poszczególnych komórek. Zdjęcia nieznanych gatunków nitkowatych z ujścia rzeki o wysokim zasoleniu w wodach przybrzeżnych Teksasu pokazują pojedyncze i dzielące się komórki. SEM wykorzystano do wizualizacji pasków błonki dwóch różnych gatunków Euglenoidów.Porównując Monomorphina i Aenigmatica z Monomorphina pseudo pyrum, widoczny spiralny układ pasków błonki, które wyłaniają się na tylnym końcu, tworząc ogon, pomaga w filogenezie do zakończenia. Obrazy SEM normalnych oczu drosophila pokazują uporządkowany układ włosia i soczewek, ale ekspresja białek związanych z chorobą Alzheimera tworzy szorstki fenotyp oka. Geny, które tłumią lub wzmacniają fenotyp szorstkiego oka, mogą odgrywać fizjologiczną rolę w postępie choroby.Oto przykłady potencjalnych upadków, których należy unikać, w tym przykład zapadniętej struktury oka z powodu niewłaściwej techniki suszenia i ładunku elektronowego z powodu niewystarczającego kodowania rozpylania, które pojawia się podczas akwizycji obrazu. Opisane tutaj protokoły wykorzystywały organizmy w dużym stopniu przy szanowanym współudziale, ale wszystkie są podatne na analizę SEM w celu zebrania użytecznych, morfologicznych informacji, które są krytyczne dla odkryć naukowych obejmujących wiele subdyscyplin biologii. Nie zapominaj, że praca z alkoholem T-butylowym, heksametyldisilazanem i tetratlenkiem osmu może być niebezpieczna i zawsze należy przestrzegać odpowiednich środków bezpieczeństwa w celu ochrony użytkowników, zwłaszcza studentów, którzy będą mieli do czynienia z tymi chemikaliami.

preparation-prokaryotic-eukaryotic-organisms-using-chemical-drying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) to potężne narzędzie do obrazowania - przede wszystkim - cech powierzchni próbki biologicznej. Właściwe przygotowanie próbki ma jednak kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości obrazów. Ten film skupia się na etapach odwadniania i suszenia podczas przygotowywania nienaruszonej dorosłej Drosophila do SEM.

Suszenie chemiczne: przygotowanie próbki biologicznej do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

Źródło: Bucher, T. i in., Metodologie badań biofilmów B. subtilis jako modelu do charakteryzacji inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp.(2016)Ten film pokazuje przygotowanie dojrzałych kolonii biofilmu bakteryjnego do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Obejmuje etapy utrwalania, odwodnienia, montażu oraz nakładania powłok metalowych, aby zachować i zobrazować morfologię biofilmu.

Przygotowanie kolonii biofilmu bakteryjnego do analizy morfologicznej

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

To badanie przedstawia niezawodne i łatwe procedury uzyskiwania seryjnych ultracienkich odcinków mikroorganizmu bez drogiego sprzętu w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły przetwarzania dla obrazowania delikatnych próbek tkanek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Opisano trzy różne metody przetwarzania, a mianowicie suszenie chemiczne heksametylu disilazana (HMDS), proste suszenie powietrzem i suszenie w punkcie krytycznym dla przygotowania sztywnych skorupek jaj, zarodków we wczesnych stadiach rozwojowych i kultur grzybów.

Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Poznaj metodę suszenia chemicznego do analizy morfologicznej organizmów prokariotycznych i eukariotycznych w mikroskopii elektronowej SEM. Protokół wykorzystuje HMDS i TBA do przygotowania próbek bez specjalistycznego sprzętu.

Otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) (Wideo) | JoVE Journal

Otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

Przeglądaj więcej filmów