Otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

Protokół ten koncentruje się na dwóch metodach suszenia chemicznego, heksametylodylazanie i alkoholu T-butylowego oraz ich zastosowaniu obrazowania zarówno organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych za pomocą SEM. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona użycia specjalistycznego sprzętu suszącego takiego jak suszarka punktu krytycznego w celu przygotowania próbek do analizy. Protokół ten opisuje metody stosowania odwadniania chemicznego i analizy SEM trzech typów organizmów, ale miałby szerokie zastosowanie do badania wielu typów organizmów i tkanek.

Procedurę zademonstruje Madison Koon, studentka studiów licencjackich z mojego laboratorium. Na początek przygotuj sinice przez utrwalanie przez noc. Następnie przenieś je do urządzenia filtracyjnego o pojemności 10 ml zawierającego filtr z poliwęglanu o pojemności 25 ml.

Uszczelnij ramię boczne i lejek urządzenia filtracyjnego gumowymi korkami, aby zatrzymać kulturę w lejku. Po usunięciu obu korków, usunąć utrwalacz, delikatnie odkurzając kolbę filtracyjną. Aby przygotować euglenoidy z glonów jednokomórkowych, utrwal je, dodając 3 krople 4% tetratlenku osmu bezpośrednio do kultury, która została wcześniej przeniesiona do 10 ml urządzenia filtracyjnego.

Po 30 minutach inkubacji usunąć oba korki i usunąć utrwalacz, delikatnie odkurzając kolbę filtracyjną. Przemyć utrwalone euglenoidy trzykrotnie 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,0 w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut, trzymając kolbę i lejek zamknięte korkami w celu wstrzymania płukania. Po wyjęciu obu korków, usunąć każde płukanie za pomocą delikatnego odkurzenia kolby filtracyjnej.

W celu odwodnienia próbki przy ciągłym zanurzeniu, należy użyć serii sortowanych alkoholi etylowych przez dziesięć minut w objętości 5 ml w lejku, trzymając kolbę i lejek zamknięte korkami, aby pomieścić etanol w lejku. Po wyjęciu obu korków delikatnie odkurzyć kolbę filtracyjną, aby usunąć etanol. Przenieść próbkę do jednorazowego aluminiowego naczynia wagowego zawierającego tylko tyle 100% etanolu, aby pokryć próbkę.

Aby przeprowadzić chemiczne suszenie euglenoidów za pomocą TBA, najpierw zastąp 100% roztwór etanolu w aluminiowym naczyniu roztworem TBA i 100% etanolu 1 do 1 na dwadzieścia minut. Następnie zastąp roztwór 1 do 1 100% TBA na dwadzieścia minut i powtórz proces dwukrotnie. Usuń TBA i zastąp tylko taką ilością świeżego 100% TBA, aby pokryć próbkę.

Umieść naczynie w czterech stopniach Celsjusza na dziesięć minut, aby zamrozić TBA. Przenieść próbkę do eksykatora próżniowego z zamrożonymi wkładami żelowymi, aby utrzymać TBA w stanie zamrożonym. Użyć pompy rotacyjnej do opróżnienia i utrzymania próżni, aby umożliwić wyschnięcie próbki poprzez sublimację próżniową zamrożonego TBA przez co najmniej trzy godziny.

Aby zamontować cyjanobakterie w euglenoidach, oznacz spód aluminiowego króćca montażowego o średnicy 25 mm, aby wskazać, co jest umieszczane na górze. Następnie umieść każdy filtr na wypustce z kleju węglowego przymocowanej do górnej części króćca. Aby przygotować Drosophila melanogaster, zanurz znieczulone muchy w 1 ml utrwalacza na dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, upewniając się, że są całkowicie zanurzone.

Użyj szklanej pipety, aby usunąć utrwalacz. Przemyć utrwaloną próbkę Drosophila w 1,5 ml probówki mikrowirówkowej trzykrotnie 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,2 w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Użyj szklanej pipety do usunięcia każdego prania, uważając, aby nie usunąć próbki.

Następnie odwodnić próbkę w probówce do mikrofuge w objętości 1 ml, używając serii stopniowanych etanoli przez dziesięć minut każda. Użyj szklanej pipety do usunięcia każdego prania, uważając, aby nie usunąć próbki. Trzymaj próbkę w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z wystarczającą ilością 100% etanolu, aby ją przykryć.

Aby przeprowadzić chemiczne suszenie much za pomocą HMDS, najpierw zastąp 100% roztwór etanolu roztworem 1 do 2 HMDS i 100% etanolu na dwadzieścia minut. Następnie zastąp roztwór roztworem HMDS i 100% etanolu w proporcji 2 do 1 na dwadzieścia minut. Na koniec zastąp ten roztwór 100% HMDS na dwadzieścia minut, a następnie powtórz proces raz.

Przenieś próbkę, która znajduje się w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i goglach HMDS, do jednorazowego aluminiowego naczynia wagowego. Zastąp 100%HMDS wystarczającą ilością świeżego 100%HMDS, aby pokryć próbkę. Umieść próbkę w aluminiowym naczyniu bezpośrednio w okapie oparowym do wyschnięcia z luźną pokrywką, taką jak pudełko, aby zapobiec spadaniu zanieczyszczeń na próbkę i pozostaw do wyschnięcia na 12 do 24 godzin.

Aby zamontować Drosophila, oznacz spód aluminiowego króćca montażowego. Użyj precyzyjnej pęsety, aby umieścić suszone muchy w żądanej pozycji na zakładce z kleju węglowego przymocowanej do górnej części kikuta pod mikroskopem preparacyjnym. Nałóż srebrny klej przewodzący wokół zewnętrznych krawędzi kkońców.

Użyj wykałaczki, aby połączyć srebrną farbę z muchami, zapewniając przewodność, upewniając się, że farba nie dotyka pożądanego obszaru obrazowania. Umieść klocki w pudełku z króćcami, a następnie umieść otwarte pudełko z klockami w eksykatorze i pozwól srebrnej farbie wyschnąć przez co najmniej trzy godziny. Aby przygotować aparat do napylania napylającego, należy wykonać od 4 do 5 płukań gazowym argonem.

W zależności od próbek, które mają być powlekane, ustaw minutnik na różne ustawienia, zgodnie z opisem w rękopisie. Napyl klocki zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec zobrazuj próbki za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, który zawiera wtórny detektor elektronów z ustawieniami zależnymi od użytej próbki.

Pomyślne przygotowanie sinic do SEM przy użyciu tego protokołu pozwoliło uzyskać obrazy, na których widoczne są szczegóły komórki, w tym kształt i tekstura powierzchni, a także osłonka śluzu i wypustki z komórek. Zdjęcie SEM nitkowatego gatunku słodkowodnego z Kolorado pokazuje widoczną osłonę śluzu. Obraz SEM bakterii słodkowodnej z Ohio ujawnia pojedyncze komórki, które czasami tworzą kolonie utrzymywane razem przez cienką warstwę śluzu.

Przypominające włókna wypukłości rozciągają się z poszczególnych komórek. Zdjęcia nieznanych gatunków nitkowatych z ujścia rzeki o wysokim zasoleniu w wodach przybrzeżnych Teksasu pokazują pojedyncze i dzielące się komórki. SEM wykorzystano do wizualizacji pasków błonki dwóch różnych gatunków Euglenoidów.

Porównując Monomorphina i Aenigmatica z Monomorphina pseudo pyrum, widoczny spiralny układ pasków błonki, które wyłaniają się na tylnym końcu, tworząc ogon, pomaga w filogenezie do zakończenia. Obrazy SEM normalnych oczu drosophila pokazują uporządkowany układ włosia i soczewek, ale ekspresja białek związanych z chorobą Alzheimera tworzy szorstki fenotyp oka. Geny, które tłumią lub wzmacniają fenotyp szorstkiego oka, mogą odgrywać fizjologiczną rolę w postępie choroby.

Oto przykłady potencjalnych upadków, których należy unikać, w tym przykład zapadniętej struktury oka z powodu niewłaściwej techniki suszenia i ładunku elektronowego z powodu niewystarczającego kodowania rozpylania, które pojawia się podczas akwizycji obrazu. Opisane tutaj protokoły wykorzystywały organizmy w dużym stopniu przy szanowanym współudziale, ale wszystkie są podatne na analizę SEM w celu zebrania użytecznych, morfologicznych informacji, które są krytyczne dla odkryć naukowych obejmujących wiele subdyscyplin biologii. Nie zapominaj, że praca z alkoholem T-butylowym, heksametyldisilazanem i tetratlenkiem osmu może być niebezpieczna i zawsze należy przestrzegać odpowiednich środków bezpieczeństwa w celu ochrony użytkowników, zwłaszcza studentów, którzy będą mieli do czynienia z tymi chemikaliami.