Edycja genomu ludzkiego patogenu grzybowego Candida albicans za pośrednictwem CRISPR

Ta metoda może pomóc w ujawnieniu różnic między grzybami a ssakami na poziomie molekularnym. Takie różnice można wykorzystać do identyfikacji nowych podejść terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że skuteczniej modyfikuje genom C.Albicans niż klasyczne techniki rekombinacji homologicznej.

Aby zidentyfikować sekwencję przewodnika RNA, zidentyfikuj sekwencję NGG PAM w pobliżu miejsca, w którym zostanie wstawiony kodon stop. Pokazane tutaj są wszystkie sekwencje PAM znalezione w pierwszych 100 parach zasad TPK2, cyklicznej podjednostki katalitycznej kinazy AMP. Zidentyfikuj trzecią sekwencję startera prowadnicy do przodu.

Sekwencja ta będzie składać się z 20 zasad bezpośrednio przed miejscem NGG PAM i nie będzie zawierać więcej niż pięć T w rzędzie. Kliknij lewym przyciskiem myszy na bazę bezpośrednio przed NGG i przeciągnij kursor 20 baz. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy zakładkę startera, aby dodać podkład.

Teraz zidentyfikuj trzecią sekwencję startera odwróconego przewodnika, która będzie uzupełnieniem sekwencji przewodnika do przodu. Przesuń w lewo na podstawę bezpośrednio przed NGG i przeciągnij kursor o 20 baz. Dla każdego podkładu kliknij lewym przyciskiem myszy zakładkę podkładu, aby dodać podkład.

Kliknij prawym przyciskiem myszy starter i wybierz polecenie kopiuj dane startera. Wklej sekwencje do programu do edycji tekstu. Dodaj sekwencje zwisów do oligonukleotydów prowadzących do przodu i do tyłu, aby ułatwić klonowanie.

Dodaj sekwencję nukleotydową ATTTG do pięciu pierwszych końców trzeciego startera przewodnika do przodu i dodaj G do trzech pierwszych końców trzeciego startera przewodnika do przodu. Na koniec, w sekwencji nukleotydów AAAAC do pięciu pierwszych końców startera odwrotnego przewodnika trzy i dodaj C do trzech głównych końców startera odwrotnego przewodnika trzy przed zakupem. Przetestuj barwnik zoptymalizowany przez Candida wektor ekspresji cas9, dodając pv1524, 10x bufor, bs9b1 i wodę do 50 mikrolitrów w 1,5 mililitrowej probówce i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Schłodzić mieszaninę wytrawiającą do temperatury pokojowej i wirować przez 30 sekund w temperaturze 2348 razy G, aby doprowadzić kondensację na dno probówki. Aby fosfataza traktowała strawiony kręgosłup, dodaj jeden mikrolitr fosfatazy jelitowej cielęcej do mieszanki trawiennej. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę wcześniej.

Teraz fosforyluj i wyżarzaj trzeci starter do przodu i trzeci starter do odwrotnej prowadnicy, łącząc je z 10x buforem ligazy T4, kinazą polinukleotydową T4 i wodą w probówce PCR. Dodaj 10x bufor ligazy T4, kinazę polinukleotydową T4 i wodę klasy biologii molekularnej do drugiej probówki PCR jako kontrolę negatywną. Mieszaniny reakcyjne inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut.

Schłodzić mieszaninę w najwolniejszym tempie narastania do 16 stopni Celsjusza, aby wyżarzyć oligonukleotydy. Następnie inkubować wyżarzoną mieszaninę oligonugojadów w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Teraz podwiązać wyżarzone oligonukleotydy do strawionego PV1524.

W pierwszej probówce do PCR dodaj 10x bufor ligazy T4, ligazę DNA t4, wyżarzoną mieszankę oligo, przetrawiony oczyszczony plazmid poddany działaniu i wodę do całkowitej objętości 10 mikrolitrów. Podobnie należy przygotować drugą probówkę do PCR, używając mieszaniny kontroli ujemnej zamiast wyżarzonej mieszanki oligo. Inkubować obie probówki w termocyklerze w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 30 minut, następnie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, a na koniec schłodzić do 25 stopni Celsjusza.

Po podwiązaniu przekształć mieszaniny ligacji w chemicznie kompetentne komórki, a następnie oczyść i zsekwencjonuj plazmidy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zaprojektować szablon naprawy, wstaw kodon stop, klikając lewym przyciskiem myszy sekwencję genu i dodając nukleotydy, które kodują kodon stop i miejsce trawienia restrykcyjnego. Kliknij lewym przyciskiem myszy 10 baz w dół od miejsca, w którym zostanie dokonana mutacja i przeciągnij kursor 60 baz w górę.

Przesuń w lewo zakładkę podkładu, aby dodać podkład. Spowoduje to dodanie szablonu naprawy do przodu o trzy. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy 10 baz przed miejscem, w którym mutacja zostanie dokonana i przeciągnij kursor 60 baz w dół.

Kliknij lewym przyciskiem myszy zakładkę startera, aby dodać podkład. Spowoduje to dodanie szablonu naprawy do tyłu trzeciego. Aby wygenerować szablon naprawy, dodaj szablon naprawy do przodu, szablon naprawy do tyłu, trifosforany deoksynukleotydów, bufor, polimerazę TACH i wodę do każdej z czterech probówek PCR.

Teraz wykonaj przedłużenie startera, przeprowadzając od 20 do 30 rund PCR. Aby strawić prawidłowo sklonowane plazmidy, dodaj plazmid, 10x bufor, albuminę surowicy bydlęcej, KPN 1, SAC 1 i wodę do całkowitej objętości 40 mikrolitrów w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

W międzyczasie wyhoduj przez noc kulturę C.albicans SC5314, prototrofa typu dzikiego, w temperaturze 25 stopni Celsjusza w YPD uzupełnionym urydyną. Hoduj kulturę do gęstości optycznej 600 nanometrów lub OD 600 mniej niż sześciu. Osadzaj pięć jednostek OD 600 komórek na transformację, wirując przez pięć minut z prędkością 2348 razy G. Następnie zawieś granulowane komórki w 100 mikrolitrach TE / octanu litu.

Teraz do 1,5-mililitrowej probówki i w kolejności dodaj ponownie zawieszone komórki, ugotowane i szybko schłodzone DNA plemników łososia, trawienie osocza, oczyszczoną matrycę naprawczą i bufor płytki. Przygotować kontrolę ujemną w ten sam sposób, z wyjątkiem zastąpienia wody objętością równą objętości przekształcającego się DNA. Po inkubacji przemian przez noc, podgrzej komórki, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 44 stopni Celsjusza na 25 minut.

Wirować przez pięć minut w temperaturze 2348 razy G w wirówce stołowej i usunąć sklarowany sklarent z mieszaniny płytkowej. Umyć raz, dodając jeden mililitr YPD uzupełnionego urydyną i ponownie odwirować. Po zawieszeniu komórek w 0,1 mililitra YPD uzupełnionego urydyną, zawiesinę inkubować na bębnie rolkowym lub wytrząsarce w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia posmaruj komórki YPD suplementowanym urydyną z 200 mikrogramami na mililitr nourseotrycyny. Kolonie pojawią się w ciągu dwóch do pięciu dni i powinny być prążkowane dla pojedynczych kolonii, jak opisano w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić PCR kolonii, zaprojektuj starter kontrolny do przodu około 200 par zasad przed wprowadzonym miejscem ograniczenia, a także starter odwrotny około 300 par zasad poniżej.

Do probówki dodać 0,3 mikrolitra startera do kontroli wstępnej, 0,3 mikrolitra startera do kontroli wstecznej, 0,3 mikrolitra polimerazy termostabilnej, trzy mikrolitry dNTP, trzy mikrolitry buforu XTAC i 23 mikrolitry wody. Następnie dodaj 0,25 mikrolitra pojedynczej kolonii drożdży do mieszaniny za pomocą końcówki pipety P10 i uważając, aby nie przeszkadzać agerowi. Po amplifikacji DNA metodą PCR, uruchom pięć mikrolitrów PCR na żelu, aby upewnić się, że amplifikacja się powiedzie, uważając, aby nie naruszyć osadu resztek komórek na dnie probówki.

Reprezentatywne wyniki edycji genomu za pośrednictwem CRISPR u C.Albicans przedstawiono tutaj. C.Albicans został przekształcony za pomocą przewodników RNA i szablonów naprawczych, które są ukierunkowane na C.Albicans TPK2. Restrykcyjne miejsce trawienia EcoR1 i kodony stop w szablonie naprawczym zakłócają miejsce PAM i ułatwiają badania przesiewowe w poszukiwaniu prawidłowych mutantów.

Colony PCR, po którym następuje trawienie restrykcyjne, szybko odróżnia typ dziki od sekwencji edytowanych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sprawdzeniu, czy do PV1524 nie ma wielu kopii przewodnikowych RNA. Ponieważ obniży to wydajność edycji genomu.

Nie zapominaj, że C.Albicans jest patogenem BL2 i zawsze, gdy jest to stosowne, należy nosić strój laboratoryjny i przestrzegać wszystkich procedur bezpieczeństwa podczas wykonywania tej procedury.