Name: Mikronizacja mechaniczna lipoaspiratów w terapii regeneracyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Poznaj metodę mechaniczną izolacji frakcji naczyniowo-mieszkowej z tkanki tłuszczowej bez kolagenazy. Protokół zachowuje macierz zewnątrzkomórkową i zmniejsza ryzyko zakażenia w terapii regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk o Przyrodzie Chin (81471881, 81601702, 81671931), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong w Chinach (2014A030310155) oraz Fundację Administratora Szpitala Nanfang (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki w Szpitalu Nanfang w Kantonie, Chiny. Tkankę tłuszczową pobrano od zdrowych dawców, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Szpitalu Nanfang i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (Chiny).
1. Przygotowanie żelu ECM/SVF
<ol>
	<li>Zbierz tłuszcz.
	<ol>
		<li>Wykonaj liposukcję na człowieku za pomocą 3-miliportowej kaniuli wieloportowej, która zawiera kilka ostrych bocznych otworów o średnicy 1 mm, przy ciśnieniu ssania -0,75 atm.</li>
		<li>Zbierz 200 ml lipoaspiratów w sterylnej torbie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj tłuszcz Colemana.
	<ol>
		<li>Przenieś lipoaspiraty do czterech probówek o pojemności 50 ml i pozwól zebranemu tłuszczowi stać nieruchomo przez 10 minut.</li>
		<li>Zbierz tłuszcz z górnej warstwy do dwóch probówek o pojemności 50 ml za pomocą pipety z szeroką końcówką do przeniesienia i wyrzuć płynną część z dolnej warstwy.</li>
		<li>Używając probówek o pojemności 50 ml, odwirować warstwę tłuszczu o sile 1 200 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 minuty.</li>
		<li>Zdefiniuj górną warstwę (około 80 ml) jako tłuszcz Colemana.</li>
		<li>Przenieś górne 2/3 tłuszczu Colemana do probówki o pojemności 20 ml za pomocą pipety z szeroką końcówką i zdefiniuj tę porcję jako tłuszcz o niskiej gęstości.</li>
		<li>Przenieś dolną 1/3 tłuszczu Colemana do innej probówki o pojemności 20 ml za pomocą pipety z szeroką końcówką i zdefiniuj tę porcję jako tłuszcz o dużej gęstości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyprodukuj żel ECM/SVF z tłuszczu o niskiej gęstości.
	<ol>
		<li>Za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 20 ml połączonych złączem Luer-Lock typu żeńskiego (o średnicy wewnętrznej 2,4 mm) należy wprowadzić 20 ml tłuszczu o niskiej gęstości.</li>
		<li>Utrzymuj stabilną prędkość zmiany biegów (na poziomie 20 ml/s) i powtórz od 6 do 8 razy.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Zbierz porcję oleju znajdującą się na górze w probówce o pojemności 10 ml za pomocą pipety z szeroką końcówką w temperaturze pokojowej do dalszego użycia.</li>
		<li>Zbierz lepką substancję w środkowej warstwie, którą jest żel ECM/SVF (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), za pomocą pipety z szeroką końcówką i wyrzuć płyn z dolnej warstwy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyprodukuj żel ECM/SVF z tłuszczu o dużej gęstości.
	<ol>
		<li>Dodać 5 ml oleju (zebranego z kroku 1.3.4) do 15 ml tłuszczu o dużej gęstości.</li>
		<li>Mieszaj zmieszany tłuszcz między strzykawkami od 6 do 8 razy, aż do momentu, gdy w emulsji pojawi się kłaczek.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Wylej porcję oleju na wierzchu.</li>
		<li>Zebrać lepką substancję w środkowej warstwie (żel ECM/SVF) za pomocą pipety z szeroką końcówką i wyrzucić płyn z dolnej warstwy.</li>
		<li>Wymieszać żel ECM/SVF z kroków 1.3.5 i 1.4.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Model przeszczepu żelu ECM/SVF dla myszy nude
<ol>
	<li>Znieczulenie nagich myszy (8 tygodni, samica) znieczuleniem wziewnym izofluranem (1% - 3%) w sali operacyjnej dla zwierząt.</li>
	<li>Przenieść żel ECM/SVF do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Połączyć strzykawkę o pojemności 1 ml z kaniulą infiltracyjną.</li>
	<li>Włóż kaniulę podskórnie do każdego boku myszy.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,3 ml żelu ECM/SVF.</li>
</ol>
3. Pobieranie tkanek 3, 15 i 90 dni po wstrzyknięciu ECM/SVF-żelu
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy znieczuleniem wziewnym izofluranem (1% - 3%).</li>
	<li>Poświęć myszy metodą zwichnięcia szyjki macicy.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej grzbietowej skóry myszy nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Wypreparuj i zbierz przeszczepy tłuszczu po obu stronach myszy. Osadź przeszczepy tłuszczu w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>Odwodnić tkankę w rosnących stężeniach etanolu: 70% etanolu, dwie przemiany po 1 godzinie; 80% etanolu, jedna zmiana, 1 godzina; 95% etanolu, jedna zmiana, 1 godzina; 100% etanolu, trzy przemiany po 1,5 h każda; ksylen, trzy przemiany, 1,5 h każda.</li>
	<li>Naciekać tkankę woskiem parafinowym (58 - 60 °C), dwie przemiany po 2 godziny każda.</li>
	<li>Osadź tkankę w blokach parafiny. Wytnij odcinki o grubości około 4 μm i umieść je na szkiełkach.</li>
</ol>
4. Barwienie hematoksyliną i eozyną
<ol>
	<li>Odparafinować szkiełka parafinowe poprzez namoczenie ich w ksylenie I, II i III (po 10 minut).</li>
	<li>Uwodnić skrawki tkanki, przepuszczając je przez malejące stężenia (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) kąpieli etanolowych przez 3 minuty każda.</li>
	<li>Opłucz skrawki tkanki w wodzie destylowanej (5 min).</li>
	<li>Wybarwić skrawki tkanek w hematoksylinie przez 5 minut.</li>
	<li>Opłucz skrawki chusteczki pod bieżącą wodą z kranu przez 20 minut. Odbarwiaj w 1% kwaśnym alkoholu (1% HCl w 70% alkoholu) przez 5 s. Płucz pod bieżącą wodą z kranu, aż skrawki znów staną się niebieskie.</li>
	<li>Dodaj dwie do trzech kropli barwnika Eozyna Y bezpośrednio na szkiełka za pomocą pipety i pozwól barwnikowi zastygnąć przez 10 minut.</li>
	<li>Myj szkiełka w wodzie z kranu przez 1 - 5 minut.</li>
	<li>Odwadniać szkiełka w rosnących stężeniach (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) etanolu przez 3 minuty każda.</li>
	<li>Wyczyść szkiełka z ksylenu I i II na 5 minut każda.</li>
	<li>Zamontuj prowadnice w mediach montażowych.</li>
</ol>
5. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Odparafinować skrawki tkanek w ksylenie I, II i III (po 5 minut).</li>
	<li>Uwodnij skrawki tkanki, przepuszczając je przez kąpiele alkoholowe o różnych stężeniach (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) przez 3 minuty każda.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 3% roztworzeH2O2w metanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Opłucz szkiełka 2x wodą destylowaną po 5 minut każda.</li>
	<li>Upuść slajdy do kosza na slajdy. Dodać 300 ml 10 mM buforu cytrynianowego (pH 6,0) i inkubować szkiełka w temperaturze 95-100 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Schłodzić szkiełka w RT przez 20 minut.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) po 5 minut.</li>
	<li>Na szkiełka dodać 100 μl 10% płodowej surowicy bydlęcej i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować skrawki z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (świnka morska anty-mysia Perilipin, 1:400) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka za pomocą PBS 3x, po 5 minut każda.</li>
	<li>Inkubować skrawki z drugorzędowym roztworem przeciwciał (anty-świnka morska kóz-488 IgG) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka za pomocą PBS 3x, po 5 minut każda.</li>
	<li>Wytrzyj wodę wokół sekcji czystą bibułą.</li>
	<li>Wrzuć 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) i sprzężoną izolektynę Alexa Fluor 488 do okręgu, aby zakryć sekcję na szkiełku.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe i pozostaw je do wyschnięcia w ciemności.</li>
	<li>Obserwuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Bateman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fat+to+Fight+Disease%3A+A+Systematic+Review+of+Non-Homologous+Adipose-Derived+Stromal%2FStem+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies.</a> Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).</li>
<li>Baer, P. C., Geiger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%3A+tissue+localization%2C+characterization%2C+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity.</a> Stem Cells International. , 812693(2012).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).</li>
<li>Halme, D. G., Kessler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+regulation+of+stem-cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">FDA regulation of stem-cell-based therapies.</a> New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>van Dongen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intraoperative+procedures+for+isolation+of+clinical+grade+stromal+vascular+fraction+for+regenerative+purposes%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).</li>
<li>van Dongen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractionation+of+adipose+tissue+procedure+to+obtain+stromal+vascular+fractions+for+regenerative+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).</li>
<li>Mashiko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Micronization+of+Lipoaspirates%3A+Squeeze+and+Emulsification+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micronized+cellular+adipose+matrix+as+a+therapeutic+injectable+for+diabetic+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer.</a> Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+flap+survival+improvement+by+composition-selective+fat+grafting+with+novel+adipose+tissue+derived+product+-+stromal+vascular+fraction+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).</li>
<li>Tonnard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofat+grafting%3A+basic+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Nanofat grafting: basic research and clinical applications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Extracellular+Matrix%2FStromal+Vascular+Fraction+Gel%3A+A+Novel+Adipose+Tissue-Derived+Injectable+for+Stem+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Stromal+Vascular+Fraction+Gel+Grafting%3A+A+New+Method+for+Tissue+Volumization+and+Rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation.</a> Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Volume+Retention+of+Stromal+Vascular+Fraction+Gel+Grafting+with+Enhanced+Angiogenesis+and+Adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+stem+cell-derived+exosomes+in+tissue+engineering+and+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).</li>
<li>Allen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grading+lipoaspirate%3A+is+there+an+optimal+density+for+fat+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).</li>
<li>Qiu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Centrifuged+Lipoaspirate+Fractions+Suitable+for+Postgrafting+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Terapia regeneracyjna oparta na komórkach macierzystych wykazała ogromne potencjalne korzyści w różnych chorobach. ASC są znakomitymi kandydatami terapeutycznymi, ponieważ są łatwe do uzyskania i mają zdolność do naprawy tkanek i regeneracji nowych tkanek15. Istnieją jednak ograniczenia w rozszerzaniu jego zastosowania klinicznego, ponieważ wymaga skomplikowanych procedur izolowania komórek i kolagenazy do przetwarzania6. Dlatego tak ważne jest opracowanie prostej techniki ...

Terapie komórkami macierzystymi wprowadzają zmianę paradygmatu naprawy i regeneracji tkanek, dzięki czemu mogą oferować alternatywny schemat terapeutyczny dla różnych chorób1. Komórki macierzyste (np. indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste i embrionalne komórki macierzyste) mają ogromny potencjał terapeutyczny, ale są ograniczone ze względu na regulację komórkową i względy etyczne. Mezenchymalne komórki zrębowe/macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) są łatwe do uzyskania z lipoaspiratów i nie podlegają tym samym ograniczeniom; W związku z tym stał się idealnym typem komórki dla praktycznej medycyny regeneracyjnej<klasa SUP="xref">2. Ponadto są nieimmunogenne i mają obfite zasoby z autologicznego tłuszczu 3.
Obecnie, ASC są uzyskiwane głównie przez trawienie tkanki tłuszczowej za pośrednictwem kolagenazy. Frakcja naczyniowa zrębu (SVF) tkanki tłuszczowej zawiera ASC, śródbłonkową komórkę progenitorową, perycyty i komórki odpornościowe. Chociaż wykazano, że enzymatyczne uzyskiwanie dużej gęstości SVF/ASC ma korzystne działanie, ustawodawstwo w kilku krajach ściśle reguluje kliniczne zastosowanie produktów na bazie komórek przy użyciu kolagenazy4. Trawienie tkanki tłuszczowej kolagenazą przez 30 min do 1 h w celu uzyskania komórek SVF zwiększa ryzyko zarówno powstania materiału egzogennego w preparacie, jak i zanieczyszczenia biologicznego. Hodowla adherentna i oczyszczanie ASC, które trwa od dni do tygodni, wymaga specjalnego sprzętu laboratoryjnego. Ponadto w większości badań komórki SVF i ASC są używane w zawiesinie. Bez ochrony macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) lub innego nośnika, wolne komórki są wrażliwe, powodują słabą retencję komórek po wstrzyknięciu i pogarszają wynik terapeutyczny5. Wszystkie te powody ograniczają dalsze stosowanie terapii komórkami macierzystymi.
Aby uzyskać ASC z tkanki tłuszczowej bez trawienia za pośrednictwem kolagenazy, opracowano kilka procedur przetwarzania mechanicznego, w tym wirowanie, mechaniczne siekanie, szatkowanie, puree i mielenie6,7,8,9. Uważa się, że metody te kondensują tkanki i ASC poprzez mechaniczne rozbijanie dojrzałych adipocytów i ich pęcherzyków zawierających olej. Co więcej, preparaty te, zawierające wysokie stężenia ASC, wykazały znaczny potencjał terapeutyczny jako medycyna regeneracyjna w modelach zwierzęcych8,9,10.
W 2013 roku Tonnard et al. wprowadzili technikę szczepienia nanotłuszczami, która polega na wytwarzaniu emulgowanych lipoaspiratów poprzez przetwarzanie międzystrzykawkowe 11. Siła ścinająca wytworzona przez przesunięcie między strzykawkami może selektywnie rozbijać dojrzałe adipocyty. Na podstawie ich ustaleń opracowaliśmy czysto mechaniczną metodę przetwarzania, która usuwa większość lipidów i płynów z lipoaaspiratów, pozostawiając tylko komórki SVF i frakcjonowany ECM, czyli ECM/SVF-gel12. W tym artykule opisujemy szczegóły procesu mechanicznego przetwarzania tkanki tłuszczowej pochodzącej z człowieka w celu wytworzenia żelu ECM/SVF.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężona izolektyna GS-IB4</td><td>Sondy molekularne</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>perylipina przeciw myszym świnkom morskim</td><td>Progen</td><td>GP29</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>pipeta z szeroką końcówką</td><td>Celltreat</td><td>229211B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>TCS SP2</td><td></td></tr><tr><td>nago ładny&nbsp;</td><td>Southern Mdical University</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop świetlny&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka</td><td>Cornig</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>sterylna torba</td><td>Laishi</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>mikrotom</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Wirówka CM1900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Heraus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikronizacja mechaniczna lipoaspiratów w terapii regeneracyjnej

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Frakcja naczyniowa zrębu (SVF) stała się narzędziem regeneracyjnym dla różnych chorób; jednak ustawodawstwo ściśle reguluje kliniczne zastosowanie produktów komórkowych z użyciem kolagenazy. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania wstrzykiwalnej mieszaniny komórek SVF i natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanki tłuszczowej w procesie czysto mechanicznym. Lipoaspiraty umieszcza się w wirówce i odwirowuje w temperaturze 1 200 x g przez 3 minuty. Środkowa warstwa jest zbierana i dzielona na dwie warstwy (tłuszcz o dużej gęstości na dole i tłuszcz o niskiej gęstości na górze). Górna warstwa jest bezpośrednio emulgowana przez przesuwanie między strzykawkami, z szybkością 20 ml / s przez 6 do 8 razy. Zemulgowany tłuszcz jest odwirowywany przy 2 000 x g przez 3 minuty, a lepka substancja pod warstwą oleju jest zbierana i definiowana jako macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)/żel SVF. Olej z wierzchniej warstwy jest zbierany. Około 5 ml oleju dodaje się do 15 ml tłuszczu o dużej gęstości i emulguje przez przesunięcie między strzykawkami, z szybkością 20 ml / s przez 6 do 8 razy. Zemulgowany tłuszcz jest odwirowywany przy 2.000 x g przez 3 minuty, a lepką substancją jest również żel ECM/SVF. Po przeszczepieniu żelu ECM/SVF nagim myszom, przeszczep jest pobierany i oceniany za pomocą badania histologicznego. Wynik pokazuje, że produkt ten ma potencjał do regeneracji do normalnej tkanki tłuszczowej. Ta procedura jest prostą, skuteczną procedurą dysocjacji mechanicznej w celu zagęszczenia komórek SVF osadzonych w ich naturalnym wspierającym ECM w celach regeneracyjnych.

Po przetworzeniu tłuszczu metodą Colemana do postaci żelu ECM/SVF, objętość usuniętego oleju stanowi 80% objętości końcowej, a jedynie 20% tkanki tłuszczowej zachowanej pod warstwą oleju jest uznawane za żel ECM/SVF (Rycina 1A). Żel ECM/SVF ma gładką, przypominającą ciecz teksturę, która umożliwia jego podanie przez cienką igłę 27 G; natomiast tłuszcz metodą Colemana składa się z integralnej struktury tłuszczowej z dużymi włóknami i może być ...

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania frakcji naczyniowej zrębu z tkanki tłuszczowej poprzez szereg procesów mechanicznych, które obejmują emulgację i wielokrotne wirowanie.

Mikronizacja mechaniczna lipoaspiratów w terapii regeneracyjnej

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Otrzymywanie zrębowych frakcji naczyniowych, czyli SVF, z lipoaspiratów wymaga trawienia kolagenazą, co zwiększa ryzyko zanieczyszczenia biologicznego. Należy opracować lepszy sposób na uzyskanie SVF bez kolagenazy. Techniki te umożliwiają nam uzyskanie SVF w jego natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą prostego procesu mechanicznego.Procedurę zademonstruje Xihang Chen, absolwent z naszego laboratorium. Po uzyskaniu próbek tłuszczu przenieś lipoaspiraty do jednej 50-mililitrowej probówki i pozwól zebranemu tłuszczowi zrównoważyć się przez 10 minut. Następnie użyj pipety z szeroką końcówką, aby wyciągnąć tłuszcz z górnej warstwy probówki do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwirować tłuszcz przez odwirowanie.Górna warstwa w tubie to frakcja tłuszczowa Colemana. Przenieś górne 2/3 tłuszczu Colemana do nowej 15-mililitrowej tuby. Ta porcja jest uważana za tłuszcz o niskiej gęstości.Przenieś dolną jedną trzecią tłuszczu Colemana do drugiej 15-mililitrowej tubki. Ta porcja jest uważana za tłuszcz o wysokiej gęstości. Aby wytworzyć żel frakcji naczyniowej zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej z tłuszczu o niskiej gęstości, użyj dwóch 20-mililitrowych strzykawek połączonych żeńskim na żeńskim złączem luer lock, aby przesunąć 10 mililitrów tłuszczu o niskiej gęstości.Jest to kluczowy krok do zniszczenia adipocytów. Szybkość i czas przesuwania między strzykawkami wpływa na jakość produktu końcowego. Po ostatniej sesji międzyzmianowej zbierz tłuszcz przez odwirowanie i przenieś górną warstwę oleju do 15-mililitrowej probówki.Następnie przenieś lepką środkową warstwę żelu frakcji naczyniowej zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Aby wytworzyć żel frakcji naczyniowej zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej z tłuszczu o dużej gęstości, dodaj dwa mililitry frakcji oleju o niskiej gęstości do pięciu mililitrów próbki tłuszczu o dużej gęstości. Przesunąć zmieszany tłuszcz, jak pokazano, aż do momentu zaobserwowania flokulatu w emulsji.Zebrać flokulat przez odwirowanie i wyrzucić górną warstwę oleju. Następnie zbierz lepką warstwę środkową i wymieszaj tę frakcję z próbką żelu zrębu frakcji naczyniowej macierzy zewnątrzkomórkowej o niskiej gęstości. Po przetworzeniu tłuszczu Colemana w żel frakcji naczyniowej zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, objętość wyrzuconego oleju zajmuje 80% końcowej objętości, a tylko 20% tkanki tłuszczowej zachowanej pod warstwą oleju uważa się za żel frakcji naczyniowej zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej.Żel frakcji naczyniowej zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej ma gładką konsystencję przypominającą płyn, która umożliwia przejście przez cienką igłę o rozmiarze 27. Jednak tłuszcz Colemana składa się z integralnej struktury tłuszczowej z dużymi włóknami, które mogą przejść tylko przez kaniulę o rozmiarze 18. W trzeciej dobie po przeszczepie pojawia się duża liczba małych preadipocytów z wieloma wewnątrzkomórkowymi kropelkami lipidów, rozległą, dobrze unaczynioną tkanką łączną i naciekającymi komórkami zapalnymi.Począwszy od 15 dnia, liczba komórek zapalnych zaczyna się stopniowo zmniejszać, a adipocyty zaczynają dojrzewać. Do 90 dnia większość unaczynionej tkanki łącznej w przeszczepach została zastąpiona dojrzałymi adipocytami. Przeszczepy żelowe frakcji zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej zawierają również kilka adipocytów perylipino-dodatnich trzy dni po przeszczepie, z preadipocytami o małych rozmiarach, z wieloma wewnątrzkomórkowymi kropelkami lipidów, które zaczynają pojawiać się w 15 dniu.W każdym polu dnia 90 odcinków przeszczepu żelowego macierzy zewnątrzkomórkowej zrębu frakcji naczyniowej wykazuje liczne adipocyty perylipinowo-dodatnie i nowo powstałe naczynia krwionośne. Cytometrię przepływową można przeprowadzić w celu określenia populacji komórkowej w produkcie. Można wykonać skaningową mikroskopię elektronową w celu wizualizacji mikrostruktury produktu.Technika ta zapewnia chirurgom i badaczom prostą metodę uzyskania produktu o wysokim stężeniu komórek SVF z natywnymi włóknami macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanki tłuszczowej.

mechanical-micronization-of-lipoaspirates-for-regenerative-therapy

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Węzły chłonne to tkanki immunologiczne, które koordynują odpowiedź immunologiczną i są kluczowym celem dla szczepionek. Biomateriały zostały wykorzystane do lepszego celowania w węzły chłonne i kontrolowania dostarczania antygenów lub adiuwantów. W artykule opisano technikę łączącą te idee w celu wstrzykiwania biokompatybilnych cząstek polimeru do węzłów chłonnych.

Iniekcja do węzłów chłonnych biodegradowalnych cząstek polimeru

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania frakcji zrębowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej i jej zastosowanie do poprawy funkcji kolana poprzez regenerację tkanki chrzęstnej u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.

Protokół kliniczny wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej w celu potencjalnej regeneracji chrząstki

Precyzyjne ujawnienie metod i protokołów jest kluczowe dla powszechnego stosowania terapii komórkami macierzystymi. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji komórek regeneracyjnych pochodzących z tkanki tłuszczowej, stosowany do pojedynczego wstrzyknięcia do ciał jamistych w leczeniu zaburzeń erekcji (ED) po radykalnej prostatektomii (RP).

Izolacja komórek regeneracyjnych pochodzących z tkanki tłuszczowej w leczeniu zaburzeń erekcji po radykalnej prostatektomii

Tutaj prezentujemy mikrofragmentację ludzkiej tkanki tłuszczowej bez enzymów przy użyciu urządzenia systemu zamkniętego. Ta nowa metoda pozwala na uzyskanie submilimetrowych skupisk tkanki tłuszczowej nadających się do przeszczepu in vivo, hodowli in vitro oraz dalszej izolacji i charakterystyki komórek.

Mikrofragmentacja ludzkiej tkanki tłuszczowej do fenotypowania komórek i charakterystyki sekretomu

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu (SVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym oferuje łatwy i skuteczny nośnik dla żywotnych komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej dla różnych wskazań, w tym inżynierii tkankowej i/lub gojenia się ran. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie mechanicznego konstruktu hydrożelowego SVF (mSVF)-fibryna do badań translacyjnych i zastosowań klinicznych.

Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania

Tutaj prezentujemy protokół, który może przekształcić autologiczną tkankę tłuszczową w różne substancje składowe tkanki tłuszczowej o różnych właściwościach i funkcjach fizykochemicznych.

Innowacyjne frakcjonowanie tkanki tłuszczowej do przekształcania tłuszczu w specjalistyczne składniki

Protokół ten opisuje wytwarzanie rozpuszczalnych plastrów mikronakłutych zawierających nanomicele α-laktalbuminy wypełnione kapsaicyną. Metoda ta oferuje powtarzalne, minimalnie inwazyjne podejście do ukierunkowanego transdermalnego dostarczania hydrofobowych bioaktywnych substancji do tkanki tłuszczowej, ułatwiając efektywną lokalną redukcję tłuszczu i potencjalnie rozszerzając zastosowanie w leczeniu otyłości.

Wytwarzanie rozpuszczalnych plastrów mikroigiełkowych wypełnionych nanomicelami α-laktalbuminy do transdermalnego dostarczania kapsaicyny i redukcji tkanki tłuszczowej

Poznaj metodę mechaniczną izolacji frakcji naczyniowo-mieszkowej z tkanki tłuszczowej bez kolagenazy. Protokół zachowuje macierz zewnątrzkomórkową i zmniejsza ryzyko zakażenia w terapii regeneracyjnej.

Mikronizacja mechaniczna lipoaspiratów w terapii regeneracyjnej

Przeglądaj więcej filmów