Name: Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metody analizy efeksu patogenów wewnątrzkomórkowych przy użyciu testów zakażenia in vitro i in vivo. Techniki te pozwalają ocenić aktywność czynników gospodarza oraz skuteczność wydalania patogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Myszy były traktowane humanitarnie zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi rządowymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health, a ich użycie zostało zatwierdzone dla całego badania przez University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (protokół 16-053).
1. Przygotowanie komórek do infekcji
<ol>
	<li>Rozmnażać mysią linię komórkową podobną do makrofagów RAW 264.7 w pożywkach do hodowli tkankowych DMEM uzupełnionych 10% płodową surowicą cielęcą (odtąd określaną jako DMEM/FCS) przy użyciu kolby o pojemności 125 ml i inkubatora do hodowli tkankowych utrzymywanego w temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
	<li>Dzień przed zakażeniem należy użyć skrobaka do komórek, aby usunąć komórki z kolby rozprężnej i zebrać w stożkowej probówce z zakrętką o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 800 x g przez 10 minut, zdekantować supernatant i zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM/FCS (bez antybiotyków) i oznaczyć miano za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Dostosuj miano do 2 x 106 komórek/ml i dodaj 0,10 ml (2 x 105 komórek) do studzienek 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że zawiesina komórek pokrywa całą powierzchnię studzienki.
	<ol>
		<li>Umieść komórki w dodatkowych studzienkach dla późniejszego źródła kondycjonowanych pożywek. Umieść również 0,10 ml DMEM/FCS w trzech dodatkowych studzienkach, aby służyły jako "kontrola bez komórek".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Następnego dnia nie wyjmować z inkubatora, dopóki inokulum bakterii nie zostanie przygotowane i nie będzie gotowe do użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie Listeria monocytogenes (Lm) do zakażenia
<ol>
	<li>Zaszczepić 2 ml naparu mózgowo-sercowego (BHI) pojedynczą kolonią ze świeżo pokrytej płytki agarowej (<2 dni) Lm i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 130 obrotów/min.</li>
	<li>Następnego dnia dodać 0,10 ml kultury przez noc do 2 ml wstępnie ogrzanego BHI i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, aż gęstość optyczna (OD600) wyniesie od 0,4 do 0,6.</li>
	<li>Określ przybliżone miano bakterii za pomocą empirycznie wyznaczonego wzoru konwersji. W naszym laboratorium wykładniczo rosnąca kultura Lm w BHI wynosi około 1,3 x 109 jednostek tworzących kolonie (CFU) / OD600. Zminimalizuj czas, w którym kultury bakterii są wystawione na działanie temperatury pokojowej.</li>
	<li>Tuż przed zakażeniem dostosować miano do 5 x 107 CFU/ml, używając wstępnie podgrzanego DMEM/FCS jako rozcieńczalnika.</li>
</ol>
3. Infekcja
<ol>
	<li>Pracując szybko i precyzyjnie, dodać 20 μl (1 x 106 CFU; wielokrotność infekcji, MOI = 5) świeżo przygotowanego inokulum Lm (krok 2.4 powyżej) do studzienek, lekko przechylając szalkę i ostrożnie umieszczając końcówkę pipety w leżącej pożywce; 
	UWAGA: unikaj dotykania ścianek studni końcówką pipety.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować zawartość każdej studzienki, aby zapewnić całkowite wymieszanie; nie potrząsać ani nie przechylać płytki znacząco, ponieważ spowoduje to rozprowadzenie Lm po ściankach studzienki. Umieścić naczynie do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 . </li>
	<li>Przygotować roztwór gentamycyny o stężeniu 10 μg/ml, używając kondycjonowanych pożywek z niezakażonych studzienek jako rozcieńczalnika.</li>
	<li>Po 30 minutach od zakażenia (mpi) ostrożnie dodać 30 μl roztworu gentamycyny (końcowe stężenie 2,5 μg/ml) i delikatnie odpipetować zawartość studzienki jak poprzednio, a następnie umieścić naczynie do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
	<li>Przy 60 mpi należy zebrać odpowiednie dołki do testu CFU (punkt czasowy 60 mpi) lub analizy FCM (jak opisano poniżej odpowiednio w sekcjach 4 i 5).</li>
	<li>W przypadku pozostałych studzienek, w różnych momentach po ich zakończeniu, albo pobiera się komórki, jak poprzednio, albo, w przypadku testu wschodów Lm, całkowicie usuwa się pożywkę ze studzienki i zastępuje się ją 150 μl pożywki kondycjonowanej bez gentamycyny.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek, przetwarzanie i analiza wewnątrzkomórkowych i emergentnych Lm za pomocą testu CFU
<ol>
	<li>Aby zebrać, lekko przechyl naczynie i ostrożnie wyjmij całe podłoże ze studni. Dodać 0,50 ml destylowanej sterylnej wody (dsH2O) do studzienki. Po 30 s przenieś powstały lizat wodny (10:0) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i energicznie wiruj przez 10 s.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenia 10-1 i 10-2, dodając 4,5 μl lub 50 μl lizatu wodnego do 450 μl dsH2O i krótko przemieszać, aby zapewnić dokładne wymieszanie.</li>
	<li>Rozprowadzić 50 μl 10 0, 10-1 i/lub 10-2 próbek na płytkach agarowych z bulionu lizogennego (LB).</li>
	<li>Aby oznaczyć obecność Lm (krok 3.6 powyżej), należy usunąć 10 μl pożywki wierzchniej i podzielić ją na dwie podwielokrotności po 5 μl: do jednej podwielokrotności dodać 5 μl DMEM/FCS, a do drugiej podwielokrotności dodać 5 μl DMEM/FCS zawierającej 5 μg/ml gentamycyny. Ta ostatnia kontrola rozróżnia zewnątrzkomórkowy Lm (wrażliwy na gentamycynę) i wewnątrzkomórkowy Lm (odporny na gentamycynę) w kolejnym teście CFU.</li>
	<li>Po 5 minutach w temperaturze pokojowej dodać 90 μl dsH2O, energicznie wirować przez 10 s i rozprowadzić 50 μl na płytkach agarowych LB.</li>
	<li>Wymienić kolonie Lm na płytkach agarowych LB po 2 dniach inkubacji w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek, przetwarzanie i analiza wewnątrzkomórkowych i emergentnych lm za pomocą cytometrii przepływowej (FCM)
<ol>
	<li>Przygotuj komórki RAW 264.7 zgodnie z opisem w krokach 1.1-4. Dostosuj komórki do 1 x 106 komórek/ml i dodaj 1 ml (1 x 106 komórek) do studzienek 6-dołkowego naczynia do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Przygotować inokulum bakterii zgodnie z opisem w kroku 2.1-2.3 i zainfekować komórki objętością inokulum odpowiadającą MOI wynoszącej 50 (5 x 107 CFU).</li>
	<li>Po 1,5 godziny od zakażenia (hpi) zebrać pożywkę z pierwszego zestawu studzienek i umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i umieścić na lodzie, aż wszystkie studzienki zostaną przetworzone.</li>
	<li>Aby zebrać wewnątrzkomórkowy Lm, dodaj 1 ml dsH2O do studzienki i po 60 s przenieś powstały lizat wodny do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z 500 μl 4% PFA. Wiruj energicznie przez 10 s i umieść na lodzie, aż wszystkie dołki zostaną przetworzone. (Przetwarzanie próbki opisano w kroku 5.8 poniżej).</li>
	<li>W przypadku pozostałych studzienek usuń pożywkę i zastąp 1 ml DMEM/FCS 5 μg/ml gentamycyny, aby zabić zewnątrzkomórkowy Lm i natychmiast zwrócić komórki do inkubatora.</li>
	<li>Po 30 minutach (2 hpi) usuń pożywkę i zastąp ją DMEM/FCS bez gentamycyny.</li>
	<li>Po 2 i 4 godzinach (4 i 6 hpi) należy wykonać drugi i trzeci punkt czasowy, zbierając pożywki i lizaty w krokach 5.3 i 5.4.</li>
	<li>Probówki wirówkowe o masie 10 000 x g przez 7 min. Usunąć supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Zawiesić każdą granulkę w koktajlu barwiącym zawierającym 50 μl 4% PFA i 15 μl falloidyny. Inkubować probówki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 1 ml buforu FACS do każdej probówki i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać.</li>
	<li>Wirować probówki o sile 10 000 x g przez 7 min. Usunąć supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Zawiesić każdą osadkę w 400 μl buforu FACS do natychmiastowego użycia lub 200 μl buforu FACS i 200 μl 4% PFA, jeśli jest przechowywana do późniejszej analizy.</li>
	<li>Uruchom próbki na cytometrii przepływowej i przeanalizuj zebrane dane.</li>
</ol>
6. Pobieranie próbek, przetwarzanie i analiza kolonizacji Lm i reakcji gospodarza w wątrobie
<ol>
	<li>Przygotuj Lm na infekcję zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.3.</li>
	<li>Oblicz niezbędną ilość subkultury dla pożądanego miana 3 x 106 jtk/ml.</li>
	<li>Tuż przed infekcją rozcieńczyć ilość obliczonych bakterii wstępnie podgrzanym zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) w końcowej objętości 1 ml. Jest to inokulum wejściowe, które jest wstrzykiwane myszy.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki insulinowej 28 G1/2 100U pobrać 100 μl (3 x 105 CFU) inokulum wejściowego i usunąć wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Umieścić mysz (szczep C57BL/6; samce w wieku od 6 do 12 tygodni) w uchwycie i użyć ciepłej wody (nie wyższej niż 45 °C) do rozszerzenia żyły ogonowej, a następnie wstrzyknąć inokulum wejściowe do żyły.</li>
	<li>Rozcieńczenia inokulum wejściowego na płytkach 10-2 i 10-3 na płytkach LB agar 10bcm i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w celu określenia rzeczywistej dawki wejściowej.</li>
	<li>W wieku 18 hpi humanitarnie poddaj mysz eutanazji (uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy) i za pomocą sterylnych nożyczek rozetnij otrzewną myszy, aby zebrać płat czołowy wątroby za pomocą oddzielnych par pęset i nożyczek na zewnątrz i wewnątrz myszy. Umieść wątrobę na 6-centymetrowej szalce Petriego na lodzie.</li>
	<li>Pokrój wątrobę w drobną kostkę i umieść w szklanej fiolce z magnetycznym mieszadłem. Dodać 2 ml kolagenazy D o stężeniu 2 mg/ml rozpuszczonej w DMEM bez FCS. Inkubować fiolki w temperaturze 37 °C na mieszadle magnetycznym przez 30−45 min. Po homogenizacji tkanki dodaj 3 ml DMEM/FCS, aby dezaktywować kolagenazę.</li>
	<li>Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 μm do stożkowej probówki, w razie potrzeby dodając więcej DMEM/FCS.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 800 x g do osadzania w temperaturze 4 °C przez 10 minut, usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu ACK w celu lizy czerwonych krwinek.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w buforze ACK. Zawieś komórki w 1 ml DMEM/FCS.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 800 x g do osadzania w temperaturze 4 °C przez 10 minut, usunąć supernatant i zawiesić w 1 ml DMEM/FCS. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Przenieś 1 x 106 komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj do granulek. Następnie zawiesić w 1 ml dsH2O i wirować w celu lizy komórek. Umieścić 50 μl na płytkach LB w nierozcieńczonych i 10-2 rozcieńczeniach i inkubować w temperaturze 37 °C w celu oznaczenia Lm do analizy CFU.</li>
	<li>Przenieść 1 x 106 komórek do probówek FACS dla każdej próbki tkanki zgodnie z liczbą komórek i przemyć 1 ml buforu FACS.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 800 x g do osadzania w temperaturze 4 °C przez 10 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przygotować koktajl przeciwciał zawierający interesujące przeciwciała w oparciu o zalecane stężenie dla każdego przeciwciała i buforu FACS. Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z zalecanymi ilościami użytymi w analizie.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl koktajlu przeciwciał i inkubować probówki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 2 ml buforu FACS do każdej probówki i zawiesić komórki.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 800 x g do granulacji w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Następnie zawiesić osad w 400 μl buforu FACS do natychmiastowego użycia lub 200 μl buforu FACS i 200 μl 4% PFA w przypadku przechowywania na później.</li>
	<li>Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej (patrz krok 5.13).</li>
</ol>

<ol><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
<li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li>
<li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li>
<li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li>
<li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085(2018).</li>
<li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li>
<li>Blériot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut%2C+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li>
<li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li>
<li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li>
<li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+%28HRI%29+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754(2013).</li>
<li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2%CE%B1+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707(2018).</li>
<li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734(2017).</li>
<li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na szybki i procesowy program infekcji komórkowych, Lm jest idealnym patogenem do badania aktywności komórkowej, która wpływa na infekcję. Zidentyfikowano szereg czynników gospodarza, które pozytywnie lub negatywnie wpływają na infekcję komórkową Lm 11,12,13,14. Dwa takie czynniki gospodarza scharakteryzowane w naszym laboratorium, Perforyna-2 i inhibitor regulowany...

Eksperymentalne modele oparte na infekcjach są z natury trudne ze względu na ich zależność od warunków początkowych gospodarza i patogenu, różne strategie infekcji patogenów oraz trudności w przypisywaniu procesów sterowanych przez patogeny i gospodarzy na podstawie wyników. Bakteria Listeria monocytogenes (Lm) stała się idealnym patogenem do badania odpowiedzi obronnych gospodarza ze względu na jej genetyczną i mikrobiologiczną podatność, szybką i procesową strategię infekcji komórkowej oraz stosunkowo wyraźny związek między fenotypami infekcji na poziomie komórkowym i organizmu. Infekcja komórkowa Lm przebiega przez cztery odrębne fazy1: (i) inwazja komórkowa, która kończy się zamknięciem Lm w wakuoli; (ii) rozpuszczanie błony wakuoli kierowane Lm i uwalnianie Lm do cytozolu; (iii) replikacja wewnątrzcytozolowa; oraz (iv) fizyczna penetracja błony plazmatycznej, która powoduje albo zakażenie bezpośrednio sąsiadujących komórek (takich jak arkusz nabłonka), albo, w komórkach pojedynczych, uwolnienie Lm do środowiska zewnątrzkomórkowego. Każda z tych faz jest promowana przez specyficzne czynniki kodowane przez Lm (zwane "czynnikami wirulencji"), które po usunięciu powodują defekty infekcji zarówno w modelach komórkowych, jak i zwierzęcych. Ta ogólna strategia infekcji została niezależnie rozwinięta przez szereg tak zwanych "cytozolowych" patogenów2.
Testy jednostek tworzących kolonie (CFU) są szeroko stosowane do oceny zarówno in vitro (tj. komórkowych), jak i in vivo (tj. organizmów) wyników infekcji. Oprócz wysokiej czułości, szczególnie w przypadku zakażeń in vivo, testy CFU zapewniają jednoznaczny odczyt inwazji patogenu i przeżycia/proliferacji wewnątrzkomórkowej. Testy CFU są szeroko stosowane do analizy zarówno Lm, jak i determinantów komórek gospodarza, które wpływają na infekcję. Jakkolwiek pouczające były te wcześniejsze badania analizujące inwazję komórkową i replikację wewnątrzcytozolową, testy CFU nie były, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, wykorzystywane do śledzenia czwartej fazy procesu infekcji Lm: ucieczki komórkowej. W tym miejscu opisujemy stosunkowo proste sposoby, w jaki ucieczka komórkowa (zwana dalej "wynurzeniem") może być monitorowana za pomocą testu CFU (a także cytometrii przepływowej) i pokazujemy przykłady, w jaki sposób zarówno czynniki kodowane przez patogen, jak i gospodarza regulują tę fazę cyklu infekcji LM. Analiza końcowej fazy komórkowego cyklu infekcji Lm może umożliwić identyfikację dodatkowych czynników i działań specyficznych dla patogenu i komórki gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Bufor ACK Lysing</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>ArC Aminowe reaktywne koraliki kompensacyjne&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>Rosół BHI (Brain Heart Infusion)</td><td>EMD Milipore</td><td>110493</td><td></td></tr><tr><td>sitko do komórek, 70 i mikro; m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>nośniki DMEM&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Rury FACS&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Inaktywacja termiczna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Zrównoważony roztwór soli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>agar Grow Cells MS</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do naprawy żółtych martwych komórek&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina falloidyna&nbsp;</td>Analizator spektralny <td>Thermo Fischer</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>SP6800</td><td></td> Strzykawka Sony <td></td><td></td></tr><tr><td>28 G 1/2 "1cc</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>TPP Kultura tkankowa 48 dołków&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92048</td><td></td></tr><tr><td>Kultura tkankowa TPP Płytki 6-dołkowe&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td><silny>antygenowy</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrom = PE Cy5, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = M1/70</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Flurochrom Biolegend</td><td></td><td>= AF 647, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = N418</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrom = APC Cy7, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = 30-F11</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrom = PE, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = BM8</td></tr><tr><td>Żywy/Martwy</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Flurochrom = AmCyN, Rozcieńczenie = 1/100</td></tr><tr><td>Ly6C</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PacBlue, Rozcieńczenie = 1/200, Klon = HK1.4</td></tr><tr><td>MHC II</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrom = AF 700, Rozcieńczenie = 1/200, Klon = M5/114.15.2</td></tr><tr><td>NK 1.1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrom = BV 605, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = PK136</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Istnieje wiele strategii stosowanych przez patogeny bakteryjne, aby przetrwać i namnażać się wewnątrz komórki eukariotycznej. Tak zwane "cytozolowe" patogeny (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis i Rickettsia spp.) uzyskują dostęp do zakażonej cytozolu komórkowego poprzez fizyczną i enzymatyczną degradację pierwotnej błony wakuolarnej. Po dostaniu się do cytozolu patogeny te zarówno namnażają się, jak i generują wystarczające siły mechaniczne, aby przeniknąć przez błonę plazmatyczną komórki gospodarza w celu zainfekowania nowych komórek. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ten końcowy etap cyklu infekcji komórkowej L. monocytogenes (Lm) można określić ilościowo zarówno za pomocą testów jednostek tworzących kolonie, jak i cytometrii przepływowej, a także podajemy przykłady, w jaki sposób czynniki kodowane przez patogen i gospodarza wpływają na ten proces. Wykazaliśmy również ścisłą zgodność dynamiki infekcji Lm w hodowanych komórkach zakażonych in vitro i komórkach wątroby pochodzących od myszy zakażonych in vivo. Te testy oparte na funkcjach są stosunkowo proste i można je łatwo skalować do opartych na odkryciach wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla modulatorów funkcji komórek eukariotycznych.

Ocena roli czynników kodowanych przez patogen i gospodarza wpływających na infekcję komórkową 
Stosując opisane powyżej warunki infekcji, po 1,5 h współinkubacji z hodowanymi makrofagami odzyskano 0,15% wprowadzonych bakterii Lm typu dzikiego (Rysunek 1A). W kolejnym etapie współinkubacji trwającym 1,5 h (3 h po infekcji, hpi) odnotowano 4-krotny wzrost odzysku żywych Lm, a od 3 do 6 hpi nastąpił dodatkow...

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Patogeny mikrobiologiczne, które replikują się wewnątrzkomórkowo, muszą w końcu opuścić zainfekowaną komórkę. Co, w porównaniu z innymi aspektami interakcji patogenów gospodarza, jest stosunkowo słabo zbadane. W tym miejscu opisujemy techniki analizy wypływu patogenów.Pokazujemy, jak stosunkowo proste testy można wykorzystać do oceny wydajności wypływu lub scharakteryzowania patogenów po wypływie Ogólne techniki opisane tutaj mają szerokie zastosowanie, chociaż modele komórek gospodarza konkretnego patogenu mogą różnić się kinetyką, dawkami i ewentualnie odczytami. Podobnie jak w przypadku tworzenia każdego systemu doświadczalnego, konieczne jest ustanowienie jasnych kontroli, które zapewnią, że w próbkach lub kohortach eksperymentalnych zaobserwowane są autentyczne procesy biologiczne. Procedurę zademonstruje Petoria Gayle, doktorantka z mojego laboratorium.Aby rozpocząć eksperyment z infekcją, użyj pipety, aby dodać 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego inokulum Lm do studzienek, z naczyniem lekko przechylonym i końcówką pipety ostrożnie umieszczoną w leżącej pożywce. Unikaj dotykania ścianek studzienki końcówką pipety. Delikatnie odpipetuj zawartość każdej studzienki, aby zapewnić całkowite wymieszanie.Nie potrząsaj ani nie przechylaj mocno płyty, aby uniknąć rozprowadzania LM po ściankach studni. Umieść naczynie do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięcioprocentowym dwutlenku węgla. Użyj kondycjonowanej pożywki z niezakażonych komórek jako rozcieńczalnika, aby przygotować 10 mikrogramów na mililitr roztworu gentamycyny.Po 30 minutach od zakażenia ostrożnie dodaj 30 mikrolitrów roztworu gentamycyny do naczynia, aby osiągnąć końcowe stężenie dwóch mikrogramów na mililitr. Delikatnie odpipetować zawartość studzienki, aby wymieszać i włożyć naczynie do hodowli komórkowej do inkubatora. Aby zebrać, lekko przechyl naczynie i ostrożnie użyj pipety, aby usunąć całe podłoże ze studni.Dodaj do studzienki pięć mililitrów destylowanej, sterylnej wody. Po 30 sekundach przenieś powstały lizat wodny do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki mikrowirówki i energicznie wiruj przez 10 sekund. Dodaj cztery przecinki-pięć mikrolitrów i 50 mikrolitrów lizatu wodnego do 450 mikrolitrów destylowanej, sterylnej wody, aby przygotować dziesięciokrotne i stukrotne rozcieńczenia.Krótko zwirować, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Dodać 50 mikrolitrów oryginalnych dziesięciokrotnie rozcieńczonych i stukrotnie rozcieńczonych próbek na płytki agarowe bulionu lizogenicznego i rozprowadzić za pomocą rozsiewacza płytek. Aby oznaczyć pojawiający się LM, wyekstrahuj 10 mikrolitrów pożywki nakładającej z naczynia i podziel ją na dwie pięciomikrolitrowe porcje i mikroprobówki wirówkowe.Dodać pięć mikrolitrów DMEM/FCS do jednej podwielokrotności i dodać pięć mikrolitrów DMEM/FCS zawierających pięć mikrolitrów na mililitr gentamycyny do drugiej podwielokrotności jako kontrolę. Odczekaj pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 90 mikrolitrów destylowanej sterylnej wody do każdej podwielokrotności i energicznie wiruj przez 10 sekund.Następnie dodać 50 mikrolitrów próbki na płytki agarowe LB i rozprowadzić za pomocą rozsiewacza płytkowego. Przechowuj płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni przed zliczeniem kolonii Lm. Korzystając z automatycznego licznika komórek, dostosuj przygotowane, surowe komórki dwa-sześć-cztery-siedem-punkty do stężenia jeden razy 10 do szóstych komórek na mililitr.Dodać jeden mililitr próbki do studzienek sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej. Zainfekuj komórki przygotowanym inokulum Lm, co odpowiada wielokrotności infekcji wynoszącej 50. W ciągu pięciu godzin od zakażenia, w mikrowirówce o pojemności jednego punktu i pięciu mililitrów wypełnionej 500 mikrolitrami czteroprocentowego PFA, zbierz pożywkę z pierwszego zestawu studzienek i umieść probówkę na lodzie.Aby zebrać wewnątrzkomórkowy Lm, dodaj jeden mililitr destylowanej, sterylnej wody do każdej studzienki. Po 60 sekundach przenieś powstały lizat wodny do mikrowirówki o pojemności jednego punktu i pięciu mililitrów z 500 mikrolitrami czteroprocentowego PFA. Energicznie obracaj probówkę przez 10 sekund i umieść ją na lodzie.W przypadku pozostałych studzienek usuń pożywkę i zastąp ją jednym mililitrem DMEM/FCS z pięcioma mikrogramami na mililitr gentamycyny, aby zabić zewnątrzkomórkową Lm. Niezwłocznie zwróć naczynie do inkubatora. Po 30 minutach usuń pożywkę i zastąp ją DMEM/FCS bez gentamycyny. Po kolejnych dwóch i czterech godzinach zbierz pożywkę w lizatach dla drugiego i trzeciego punktu czasowego do probówek i umieść je na lodzie do schłodzenia.Odwirować probówki pod ciśnieniem 10 000 razy G przez siedem minut. Za pomocą pipety usunąć supernatant bez naruszania osadu. Dodaj koktajl barwiący zawierający 50 mikrolitrów czteroprocentowego PFA i 15 mikrolitrów falloidyny do probówki i wymieszaj, aby zawiesić każdą granulkę.Inkubuj probówki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr buforu FACS do każdej probówki i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Wirować probówki w wirówce pod ciśnieniem 10 000 razy G przez siedem minut.Usunąć sklarowany osad bez naruszania osadu. Do natychmiastowego użycia zawiesić każdą granulkę w 400 mikrolitrach bufora FAX. W przypadku przechowywania do późniejszej analizy dodaj 200 mikrolitrów buforu FAX i 200 mikrolitrów czteroprocentowego PFA do probówki i wymieszaj do zawieszenia.Wykorzystując warunki infekcji w krótkim leczeniu antybiotykiem gentamycyną w celu wyeliminowania niezinternalizowanego Lm, punkt zerowy-jeden-pięćprocent Lm typu dzikiego jest odzyskiwany po jednej lub pięciu godzinach wspólnej inkubacji z hodowanymi makrofagami. W późniejszej koinkubacji nastąpił czterokrotny i siedmiopunktowy pięciokrotny wzrost odzyskiwania żywotnego Lm, który reprezentuje wyłącznie proliferację wewnątrzkomórkową. Porównywalny profil zaobserwowano dla szczepu Lm posiadającego hiperwirulentny prfA podczas początkowej infekcji, ale nie między trzema a sześcioma HPI.Gdy prfA został usunięty ze szczepu Lm, następuje zmniejszenie odzysku szczepu po długotrwałej koinkubacji. Gdy gentamycyna jest usuwana z dołków przy sześciu HPI, zewnątrzkomórkowy Lm może być wykryty godzinę później zarówno dla szczepów prfA typu dzikiego, jak i hiperwirulentnego, ale nie dla szczepu z usuniętym prfA. Pożywki nakładające się zarówno na niezakażone, jak i zakażone makrofagi zawierały rozpraszające światło cząstki wielkości bakterii.Jednak tylko pożywki z zakażonych makrofagów posiadały dodatnie sygnały GFP w obrębie bramkowania wielkości. Zależny od czasu wzrost pojawiania się faloidyno-dodatniego Lm zaobserwowano w przypadku zakażonych makrofagów. Podczas wysiewania makrofagów w 48-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowej, pozostaw niektóre studzienki bez komórek.Te studzienki kontrolne bez komórek są następnie traktowane dokładnie tak samo, jak studzienki zawierające komórki, pod względem dodawania patogenu, antybiotyków itp., aby zapewnić, że sygnały eksperymentalne są zależne od obecności komórek gospodarza. Podobnie jak w eksperymentach pokazanych na rysunkach pierwszym i trzecim, czynniki patogenu lub gospodarza i/lub małe cząsteczki mogą być badane pod kątem ich wpływu na wypływ komórkowy patogenu.

using-bacterial-pathogen-to-probe-for-cellular-organismic-level-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ogólny protokół badania inwazji komórek gospodarza przez patogen bakteryjny, skupiający się na Staphylococcus aureus oraz ludzkich komórkach śródbłonka.

Inwazja komórek ludzkich przez patogen bakteryjny

Ten film demonstruje technikę kwantyfikacji in vitro w celu określenia zakażenia Listeria monocytogenes makrofagami za pomocą testu jednostki tworzącej kolonię. Kolonie bakteryjne na płytce agarowej reprezentują wewnątrzkomórkową populację bakterii, która wymyka się mechanizmowi obronnemu gospodarza i przeżywa w makrofagach.

Kwantyfikacja infekcji bakteryjnej w komórkach gospodarza za pomocą testu jednostkowego tworzącego kolonię

Ten film demonstruje technikę oceny zdolności Porphyromonas gingivalis, beztlenowej bakterii chorobotwórczej, do przylegania i atakowania ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Po zakażeniu komórek gospodarza bakteriami, komórki gospodarza są poddawane lizie w celu uwolnienia zarówno przylegających, jak i zinternalizowanych bakterii. Gdy lizat jest posiewany w odpowiednim pożywce, obecność kolonii wskazuje na udane interakcje bakteria-komórka gospodarza.

Test infekcji bakteryjnej do badania interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Listeria monocytogenes to Gram-dodatni patogen bakteryjny, często używany jako główny model do badania pasożytnictwa wewnątrzkomórkowego. Obrazowanie późnych etapów infekcji L. monocytogenes w kontekście małych interferujących badań przesiewowych RNA pozwala na globalne badanie szlaków komórkowych wymaganych do infekcji bakteryjnej docelowych komórek gospodarza.

Obrazowanie wydzielania InlC w celu zbadania zakażenia komórkowego patogenem bakteryjnym Listeria monocytogenes

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Opisano dwa testy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na mikroskopii czynników gospodarza związanych z infekcją Brucellą. Test wejściowy wykrywa czynniki gospodarza wymagane do wniknięcia Brucella, a test końcowy te, które są wymagane do replikacji wewnątrzkomórkowej. Chociaż ma zastosowanie do alternatywnych podejść, badania przesiewowe siRNA w komórkach HeLa są wykorzystywane do zilustrowania protokołów.

Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Wykrywanie interakcji patogenów gospodarz-bakteria na podstawie przestrzegania fenotypu za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego wraz z automatycznymi metodami analizy statystycznej umożliwia szybką ocenę potencjalnych interakcji bakteryjnych z komórkami gospodarza.

Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza

Poznaj metody analizy efeksu patogenów wewnątrzkomórkowych przy użyciu testów zakażenia in vitro i in vivo. Techniki te pozwalają ocenić aktywność czynników gospodarza oraz skuteczność wydalania patogenów.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Przeglądaj więcej filmów