Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Patogeny mikrobiologiczne, które replikują się wewnątrzkomórkowo, muszą w końcu opuścić zainfekowaną komórkę. Co, w porównaniu z innymi aspektami interakcji patogenów gospodarza, jest stosunkowo słabo zbadane. W tym miejscu opisujemy techniki analizy wypływu patogenów.

Pokazujemy, jak stosunkowo proste testy można wykorzystać do oceny wydajności wypływu lub scharakteryzowania patogenów po wypływie Ogólne techniki opisane tutaj mają szerokie zastosowanie, chociaż modele komórek gospodarza konkretnego patogenu mogą różnić się kinetyką, dawkami i ewentualnie odczytami. Podobnie jak w przypadku tworzenia każdego systemu doświadczalnego, konieczne jest ustanowienie jasnych kontroli, które zapewnią, że w próbkach lub kohortach eksperymentalnych zaobserwowane są autentyczne procesy biologiczne. Procedurę zademonstruje Petoria Gayle, doktorantka z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć eksperyment z infekcją, użyj pipety, aby dodać 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego inokulum Lm do studzienek, z naczyniem lekko przechylonym i końcówką pipety ostrożnie umieszczoną w leżącej pożywce. Unikaj dotykania ścianek studzienki końcówką pipety. Delikatnie odpipetuj zawartość każdej studzienki, aby zapewnić całkowite wymieszanie.

Nie potrząsaj ani nie przechylaj mocno płyty, aby uniknąć rozprowadzania LM po ściankach studni. Umieść naczynie do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięcioprocentowym dwutlenku węgla. Użyj kondycjonowanej pożywki z niezakażonych komórek jako rozcieńczalnika, aby przygotować 10 mikrogramów na mililitr roztworu gentamycyny.

Po 30 minutach od zakażenia ostrożnie dodaj 30 mikrolitrów roztworu gentamycyny do naczynia, aby osiągnąć końcowe stężenie dwóch mikrogramów na mililitr. Delikatnie odpipetować zawartość studzienki, aby wymieszać i włożyć naczynie do hodowli komórkowej do inkubatora. Aby zebrać, lekko przechyl naczynie i ostrożnie użyj pipety, aby usunąć całe podłoże ze studni.

Dodaj do studzienki pięć mililitrów destylowanej, sterylnej wody. Po 30 sekundach przenieś powstały lizat wodny do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki mikrowirówki i energicznie wiruj przez 10 sekund. Dodaj cztery przecinki-pięć mikrolitrów i 50 mikrolitrów lizatu wodnego do 450 mikrolitrów destylowanej, sterylnej wody, aby przygotować dziesięciokrotne i stukrotne rozcieńczenia.

Krótko zwirować, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Dodać 50 mikrolitrów oryginalnych dziesięciokrotnie rozcieńczonych i stukrotnie rozcieńczonych próbek na płytki agarowe bulionu lizogenicznego i rozprowadzić za pomocą rozsiewacza płytek. Aby oznaczyć pojawiający się LM, wyekstrahuj 10 mikrolitrów pożywki nakładającej z naczynia i podziel ją na dwie pięciomikrolitrowe porcje i mikroprobówki wirówkowe.

Dodać pięć mikrolitrów DMEM/FCS do jednej podwielokrotności i dodać pięć mikrolitrów DMEM/FCS zawierających pięć mikrolitrów na mililitr gentamycyny do drugiej podwielokrotności jako kontrolę. Odczekaj pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 90 mikrolitrów destylowanej sterylnej wody do każdej podwielokrotności i energicznie wiruj przez 10 sekund.

Następnie dodać 50 mikrolitrów próbki na płytki agarowe LB i rozprowadzić za pomocą rozsiewacza płytkowego. Przechowuj płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni przed zliczeniem kolonii Lm. Korzystając z automatycznego licznika komórek, dostosuj przygotowane, surowe komórki dwa-sześć-cztery-siedem-punkty do stężenia jeden razy 10 do szóstych komórek na mililitr.

Dodać jeden mililitr próbki do studzienek sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej. Zainfekuj komórki przygotowanym inokulum Lm, co odpowiada wielokrotności infekcji wynoszącej 50. W ciągu pięciu godzin od zakażenia, w mikrowirówce o pojemności jednego punktu i pięciu mililitrów wypełnionej 500 mikrolitrami czteroprocentowego PFA, zbierz pożywkę z pierwszego zestawu studzienek i umieść probówkę na lodzie.

Aby zebrać wewnątrzkomórkowy Lm, dodaj jeden mililitr destylowanej, sterylnej wody do każdej studzienki. Po 60 sekundach przenieś powstały lizat wodny do mikrowirówki o pojemności jednego punktu i pięciu mililitrów z 500 mikrolitrami czteroprocentowego PFA. Energicznie obracaj probówkę przez 10 sekund i umieść ją na lodzie.

W przypadku pozostałych studzienek usuń pożywkę i zastąp ją jednym mililitrem DMEM/FCS z pięcioma mikrogramami na mililitr gentamycyny, aby zabić zewnątrzkomórkową Lm. Niezwłocznie zwróć naczynie do inkubatora. Po 30 minutach usuń pożywkę i zastąp ją DMEM/FCS bez gentamycyny. Po kolejnych dwóch i czterech godzinach zbierz pożywkę w lizatach dla drugiego i trzeciego punktu czasowego do probówek i umieść je na lodzie do schłodzenia.

Odwirować probówki pod ciśnieniem 10 000 razy G przez siedem minut. Za pomocą pipety usunąć supernatant bez naruszania osadu. Dodaj koktajl barwiący zawierający 50 mikrolitrów czteroprocentowego PFA i 15 mikrolitrów falloidyny do probówki i wymieszaj, aby zawiesić każdą granulkę.

Inkubuj probówki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr buforu FACS do każdej probówki i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Wirować probówki w wirówce pod ciśnieniem 10 000 razy G przez siedem minut.

Usunąć sklarowany osad bez naruszania osadu. Do natychmiastowego użycia zawiesić każdą granulkę w 400 mikrolitrach bufora FAX. W przypadku przechowywania do późniejszej analizy dodaj 200 mikrolitrów buforu FAX i 200 mikrolitrów czteroprocentowego PFA do probówki i wymieszaj do zawieszenia.

Wykorzystując warunki infekcji w krótkim leczeniu antybiotykiem gentamycyną w celu wyeliminowania niezinternalizowanego Lm, punkt zerowy-jeden-pięćprocent Lm typu dzikiego jest odzyskiwany po jednej lub pięciu godzinach wspólnej inkubacji z hodowanymi makrofagami. W późniejszej koinkubacji nastąpił czterokrotny i siedmiopunktowy pięciokrotny wzrost odzyskiwania żywotnego Lm, który reprezentuje wyłącznie proliferację wewnątrzkomórkową. Porównywalny profil zaobserwowano dla szczepu Lm posiadającego hiperwirulentny prfA podczas początkowej infekcji, ale nie między trzema a sześcioma HPI.

Gdy prfA został usunięty ze szczepu Lm, następuje zmniejszenie odzysku szczepu po długotrwałej koinkubacji. Gdy gentamycyna jest usuwana z dołków przy sześciu HPI, zewnątrzkomórkowy Lm może być wykryty godzinę później zarówno dla szczepów prfA typu dzikiego, jak i hiperwirulentnego, ale nie dla szczepu z usuniętym prfA. Pożywki nakładające się zarówno na niezakażone, jak i zakażone makrofagi zawierały rozpraszające światło cząstki wielkości bakterii.

Jednak tylko pożywki z zakażonych makrofagów posiadały dodatnie sygnały GFP w obrębie bramkowania wielkości. Zależny od czasu wzrost pojawiania się faloidyno-dodatniego Lm zaobserwowano w przypadku zakażonych makrofagów. Podczas wysiewania makrofagów w 48-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowej, pozostaw niektóre studzienki bez komórek.

Te studzienki kontrolne bez komórek są następnie traktowane dokładnie tak samo, jak studzienki zawierające komórki, pod względem dodawania patogenu, antybiotyków itp., aby zapewnić, że sygnały eksperymentalne są zależne od obecności komórek gospodarza. Podobnie jak w eksperymentach pokazanych na rysunkach pierwszym i trzecim, czynniki patogenu lub gospodarza i/lub małe cząsteczki mogą być badane pod kątem ich wpływu na wypływ komórkowy patogenu.