Name: Multipleksowa zogniskowana stymulacja ultradźwiękowa z mikroskopią fluorescencyjną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę LIPUS do nieinwazyjnej stymulacji komórek w badaniach mechanobiologicznych z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia precyzyjne pomiar odpowiedzi komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Michaiłowi Shapiro i Nikicie Reznikowi za owocne dyskusje. Prace te były wspierane przez fundusze start-upowe z Zachodniego Uniwersytetu Nauk o Zdrowiu oraz grant NIH R21NS101384.

1. Hodowla komórek na akustycznie przejrzystej folii poliestrowej
<ol>
	<li>Za pomocą wiertarki stołowej wywierć w dnie standardowej szalki hodowlanej o średnicy 35 mm otwór o średnicy 12 mm. Przesuwaj wiertło powoli i stosuj ochronę oczu. Usuń kawałki plastiku przywierające do dna szalki za pomocą ostrza, aby uzyskać gładką powierzchnię po zewnętrznej stronie (Rysunek 2).</li>
	<li>Nanieś cienką warstwę epoksydu klasy morskiej lub kleju na zewnętrzną powierzchnię dna szalki.</li>
	<li>Przyłóż folię poliestrową (grubość 2,5 µm) do zewnętrznej powierzchni dna szalki i mocno dociśnij, aby upewnić się, że epoksyd/klej równomiernie rozłożył się między folią a grubą powierzchnią tworzywa. Delikatnie rozciągnij folię palcami w kierunku odśrodkowym, aby stworzyć płaską powierzchnię (Rysunek 2).</li>
	<li>Po wyschnięciu epoksydu/kleju krótko opłucz i osusz szalkę z poliestrowym dnem 95% etanolem, a następnie wysterylizuj, umieszczając szalkę oraz wewnętrzną powierzchnię jej pokrywki pod silnym źródłem wzbudzenia UV o długości fali 254 nm. Dostosuj czas i natężenie tak, aby dostarczyć dawkę UV wynoszącą około 330 mJ cm-2 w celu całkowitego zniszczenia większości typów mikroorganizmów. Energia ta odpowiada w przybliżeniu czasowi 5 min przy oświetleniu UV o natężeniu 1 000 µW cm-2.</li>
	<li>Przygotuj alikwoty komercyjnie dostępnych mieszanin białek macierzy zewnątrzkomórkowej (EMPM) w małych probówkach (50-100 µL) i przechowuj je w warunkach sterylnych w temperaturze -20 °C lub niższej.</li>
	<li>W środowisku sterylnym (np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza) rozcieńcz zamrożony roztwór stokowy EMPM odpowiednią pożywką hodowlaną w stosunku 1:100. Pracuj na lodzie, aby zapobiec polimeryzacji EMPM w temperaturze pokojowej. Szybko nanieś 100 µL mieszaniny z pożywką na folię poliestrową. Nałóż pokrywkę na szalkę, aby zachować sterylność.</li>
	<li>Inkubuj szalki z poliestrowym dnem powleczonym EMPM w inkubatorze do hodowli komórkowych z CO2 w temperaturze 37 °C przez 6-12 h.</li>
	<li>Po inkubacji odessaj nadmiar pożywki i bezpośrednio zasiaj komórki na powierzchni z pożądaną gęstością. Pracuj w warunkach sterylnych, aby zachować czystość biologiczną.</li>
</ol>
2. Implementacja LIPUS
<ol>
	<li>Umieść zbiornik z wodą pod obiektywem mikroskopu pionowego o dużej przestrzeni roboczej i bez elementów oświetlenia w torze transmisyjnym.</li>
	<li>Wykorzystując dostępne komercyjnie komponenty optomechaniczne, umieść uchwyt próbki pod obiektywem, a uchwyt przetwornika pod uchwytem próbki. W celu późniejszego wyszukania próbki i wyrównania ultradźwięków zamontuj oba uchwyty na stolikach translacyjnych.
	<ol>
		<li>Umieść ruchome części i siłowniki stolików translacyjnych poza zbiornikiem lub powyżej poziomu wody, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych działaniem wody. W przypadku komponentów optomechanicznych zanurzonych w wodzie stosuj wyłącznie materiały niekorozyjne, takie jak aluminium anodowane lub stal nierdzewna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed użyciem przetwornika immersyjnego napełnij zbiornik dejonizowaną i odgazowaną wodą. Poziom wody powinien pokrywać się z poziomą płaszczyzną uchwytu próbki (Rycina 3). 
	UWAGA: Woda dejonizowana zapobiega sprzężeniu elektrycznemu w obecności silnych pól elektrycznych. Odgazowanie zapobiegnie również rozpraszaniu i zniekształceniom fal akustycznych. Po każdym eksperymencie odprowadź wodę za pomocą pompy lub zaworu, tak aby poziom wody spadł poniżej pozycji przetwornika. Ponadto często wymieniaj lub filtruj wodę oraz w razie potrzeby czyść zbiornik, aby zapobiec rozwojowi mikroorganizmów.</li>
</ol>
3. Skośne wzbudzenie akustyczne
<ol>
	<li>Wykorzystując dostępne komercyjnie komponenty optomechaniczne, ustaw przetwornik pod kątem w stosunku do drogi optycznej. Zapewni to, że wszelkie fale odbite zostaną skierowane z dala od próbki (Rysunek 3 oraz Rysunek 4).</li>
</ol>
4. Sterowanie przetwornikiem
UWAGA: Przetworniki ultradźwiękowe przekształcają oscylującą energię elektryczną w mechaniczne rozszerzanie/kurczenie się materiału piezoelektrycznego. Konwersja ta powoduje stratę energii w postaci energii cieplnej. W związku z tym, mimo że przetworniki posiadają limit szczytowego napięcia wejściowego, posiadają one również limit mocy elektrycznej, aby uniknąć uszkodzeń termicznych elementu piezoelektrycznego: 
<img alt="Wzór na obliczanie mocy, P = duty cycle × Vrms²/Z, schemat równania dla analizy elektrycznej." src="/files/ftp_upload/58781/58781eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1"> 
gdzie duty cycle to względna część czasu symulacji elektrycznej, P to moc elektryczna (w watach), Vrms to napięcie wejściowe efektywne (w woltach) źródła napięcia przemiennego, a Z to impedancja elektryczna (w omach). 
<img alt="Wzór na Vrms, \( V_{rms} = \frac{V_{pp}}{2\sqrt{2}} \), obliczenia obwodu elektrycznego." src="/files/ftp_upload/58781/58781eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2"> 
gdzie Vpp to napięcie wejściowe szczyt-szczyt przyłożone do przetwornika.
<ol>
	<li>Za pomocą komercyjnego generatora funkcji należy utworzyć przebieg sinusoidalny o pożądanej częstotliwości, liczbie cykli w impulsie oraz częstotliwości powtarzania impulsów. Jednakże stosunkowo wysoka wartość Vpp, niezbędna do efektywnego wzbudzenia standardowych przetworników ultradźwiękowych, często wymaga zastosowania wzmacniacza mocy w celu wzmocnienia sygnału wyjściowego (t. j. zwiększyć amplitudę Vpp) generatora funkcji. 
	UWAGA: Na przykład producent przetwornika wskazuje, że limit mocy dla danego przetwornika wynosi 35 W. Czy sinusoidalne wejściowe napięcie szczyt-szczyt (Vw) o wartości 500 mV przy cyklu pracy 50%, wzmocniony przez wzmacniacz 50 dB/100 W, zmieści się w limicie mocy tego przetwornika?
	<ol>
		<li>Aby odpowiedzieć na to pytanie, należy obliczyć napięcie po wzmocnieniu. W przypadku wzmacniacza mocy radiowej (RF) współczynnik wzmocnienia (dB) definiuje się następująco: 
		<img alt="Wzór na obliczanie decybeli, dB=20log(Vout/Vin), równanie do analizy wzmocnienia sygnału." src="/files/ftp_upload/58781/58781eq3.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"> 
		Zatem wzmocnione napięcie ma amplitudę wyjściową Vpp (Vpp = Vna zewnątrz) z: <img alt="Obliczanie napięcia, równanie Vpp=0,5×10^(dB/20)=158V, wzór z inżynierii elektrycznej." src="/files/ftp_upload/58781/58781eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"> 
		Korzystając z równań 1 i 2 oraz przyjmując impedancję elektryczną wynoszącą 50 Ω, moc generowana przez to napięcie wynosi: 
		<img alt="Obliczenie wzoru na moc, P=(0,5×[0,5×0,707×158]²)/50≈31W, równanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/58781/58781eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"> 
		Stymulacja ta mieści się zatem w granicy mocy przetwornika.</li>
		<li>Kierując się powyższym przykładem, oblicz parametry kształtu fali (Vpp, częstotliwość, czas trwania impulsu oraz częstotliwość powtarzania impulsów), które odpowiadają limitom mocy i napięcia podanym przez producenta przetwornika. Należy przestrzegać tych limitów, aby uniknąć uszkodzenia przetwornika oraz innych podłączonych urządzeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy wybrać generator funkcji pracujący w zakresie częstotliwości zgodnym z przetwornikiem ultradźwiękowym. Następnie należy ustawić częstotliwość generatora funkcji na nominalną częstotliwość szczytową przetwornika.</li>
	<li>Za pomocą trybu seryjnego (burst mode) generatora funkcji należy utworzyć sinusoidalny impuls napięcia o pożądanej czasie trwania i częstotliwości powtarzania. Napięcie szczyt-szczyt należy ustawić na wybraną wartość. Należy upewnić się, że czas trwania impulsu jest krótszy niż czas odstępu między dwoma kolejnymi impulsami.</li>
	<li>Należy sprawdzić, czy przebieg odpowiada pożądanemu sygnałowi, podłączając wyjście generatora funkcji do wejścia oscyloskopu.</li>
	<li>Podłącz wyjście generatora funkcji do wejścia wzmacniacza mocy RF (Rysunek 4). Należy upewnić się, że parametry stymulacji mieszczą się w granicach określonych przez producenta przetwornika.</li>
</ol>
5. Ustawianie wiązki
<ol>
	<li>Wybierz hydrofon, który pracuje w zakresie częstotliwości i przy natężeniu akustycznym zgodnym z częstotliwością i natężeniem przetwornika ultradźwiękowego.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadź końcówkę sondy hydrofonu w ognisko w polu widzenia obiektywu, w pozycji odpowiadającej pozycji próbki (Rysunek 4).</li>
	<li>Upewnij się, że zarówno sonda, jak i przetwornik są zanurzone w odgazowanej wodzie dejonizowanej. Nie uderzaj końcówką hydrofonu o żaden obiekt fizyczny poza wodą, ponieważ zmieni to jego powłokę i wpłynie na pomiar.</li>
	<li>Wykonaj wstępne, zgrubne wyrównanie przetwornika, ustawiając wizualnie jego oś akustyczną w stronę sondy hydrofonu. Upewnij się, że odległość między powierzchnią przetwornika a końcówką hydrofonu odpowiada w przybliżeniu ogniskowej przetwornika.</li>
	<li>Podłącz wyjście hydrofonu do jednego z wejść sygnałowych oscyloskopu. Podłącz wyzwalacz synchronizacji z generatora funkcji do innego wejścia oscyloskopu. Wyświetl oba sygnały jednocześnie na oscyloskopie.</li>
	<li>Wzbudź przetwornik kilkoma cyklami ultradźwiękowymi przy niskim cyklu pracy i niskiej amplitudzie, aby uniknąć uszkodzenia sondy. Sprawdź warunki bezpiecznej pracy podane przez producenta hydrofonu, aby uniknąć uszkodzenia końcówki hydrofonu.</li>
	<li>Ustaw pokrętło s/division zgodnie z czasem przejścia ultradźwięków od powierzchni przetwornika do hydrofonu. Szukaj sygnału z hydrofonu na oscyloskopie po wyzwalaczu synchronizacji.</li>
	<li>Powoli przemieszczaj przetwornik za pomocą zmotoryzowanego lub ręcznego stołu XYZ. Pozostaw przetwornik w pozycji, która koreluje z maksymalnym sygnałem hydrofonu (Rysunek 4). 
	UWAGA: Jeśli sygnał nie zostanie wykryty, możliwe jest, że natężenie impulsów akustycznych jest zbyt niskie lub wiązka jest źle wyrównana lub rozproszona przez jakiś obiekt. Regularnie sprawdzaj, czy hydrofon i przetwornik są wizualnie wstępnie wyrównane oraz czy na drodze wiązki nie znajdują się pęcherzyki powietrza ani żadne obiekty fizyczne poza folią poliestrową. Jeśli sygnał nadal nie jest wykrywany, nieznacznie zwiększ napięcie wejściowe, aby zwiększyć amplitudę sygnału hydrofonu.</li>
</ol>
6. Wyznaczanie ciśnienia i natężenia impulsu ultradźwiękowego
<ol>
	<li>Po wyrównaniu wiązki zmierz amplitudę szczyt-szczyt sygnału wyjściowego hydrofonu za pomocą oscyloskopu dla różnych napięć sterujących przetwornikiem. Należy upewnić się, że nie zostanie przekroczony limit ciśnienia zalecany przez producenta hydrofonu.</li>
	<li>Przelicz te pomiary na wartości ciśnienia i/lub natężenia akustycznego, korzystając z metody kalibracji dostarczonej przez producenta hydrofonu. 
	UWAGA: Natężenie akustyczne można wyznaczyć na podstawie ciśnienia i odwrotnie, korzystając ze wzoru: 
	<img alt="Wzór na natężenie \( I = \frac{P^2}{\rho c} \), Równanie 4, pojęcie fizyczne." src="/files/ftp_upload/58781/58781eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6"> 
	gdzie I to natężenie akustyczne (w W m-2), P to ciśnienie akustyczne (w Pa), ρ to gęstość ośrodka propagacji (1 000 kg m-3 dla wody), a c to prędkość dźwięku w ośrodku propagacji (dla wody c = 1 500 m s-1).</li>
	<li>Stwórz krzywe kalibracyjne na podstawie tych pomiarów. 
	UWAGA: Krzywe zależności ciśnienia od napięcia oraz natężenia od napięcia mają odpowiednio kształt liniowy i paraboliczny.</li>
	<li>Wyznacz wartość ciśnienia i/lub natężenia dla pożądanego napięcia sterującego, korzystając z odpowiedniej krzywej kalibracyjnej.</li>
</ol>
7. Obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek wrażliwych na wapń/LIPUS
<ol>
	<li>Wymień pożywkę hodowlaną komórek na wybrany bufor do obrazowania zawierający 5 µM przenikającego do komórek barwnika wrażliwego na wapń (np. Fluo-4 AM). Inkubuj szalkę hodowlaną w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 1 h.</li>
	<li>Ostrożnie przemyj komórki tym samym buforem, ale bez dodatku barwnika.</li>
	<li>Umieść szalkę w uchwycie na próbkę. Pobudź komórki za pomocą niebieskiego światła (490 nm), a następnie dostosuj intensywność pobudzenia i czas ekspozycji kamery, aby uniknąć nadmiernego blaknięcia sygnału lub nasycenia pikseli.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie poklatkowe (time-lapse), stosując wybrane ustawienia akwizycji obrazu. Aby uzyskać lepszą jakość obrazu oraz zredukować niepożądane odblaski, użyj obiektywu imersyjnego o dużej odległości roboczej (patrz Rysunek 4).</li>
</ol>

<ol><li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+intensity+focused+ultrasound%3A+The+fundamentals%2C+clinical+applications+and+research+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+and+Interventional+Imaging%22%5BJournal%5D)">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li>
<li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aToccaceli%2C+G+%22Emerging+strategies+and+future+perspective+in+neuro-oncology+using+Transcranial+Focused+Ultrasound+Technology%22">Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology</a>. , World Neurosurgery. (2018).</li>
<li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li>
<li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li>
<li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanobiology+of+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li>
<li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound%3F+A+continuum+mechanics+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li>
<li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li>
<li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity%2C+low-frequency+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511(2008).</li>
<li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Therapeutic+Ultrasound%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30(2017).</li>
<li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li>
<li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264(2015).</li>
<li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li>
<li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+modulates+ion+channel+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170(2016).</li>
<li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115(2013).</li>
<li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li>
<li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-biophysics+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrigendum%3A+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148(2017).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736(2012).</li>
<li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li>
<li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li>
<li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344(2017).</li>
<li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Główną zaletą zogniskowanych ultradźwięków jest ich zdolność do nieinwazyjnego dostarczania energii mechanicznej i/lub cieplnej do próbek biologicznych z dużą precyzją czasoprzestrzenną. Inne techniki mające na celu mechaniczną stymulację komórek zwykle wykorzystują inwazyjne sondy fizyczne (np. szturchanie komórek) lub wymagają interakcji wiązek laserowych o wysokiej energii z ciałami obcymi (np. pęseta optyczna). Ogrzewanie magnetyczne może ogrzewać określone lokalizacje przestrzenne wewnątrz próbek b...

Wiele chorób wymaga jakiejś formy inwazyjnej interwencji medycznej. Procedury te są często kosztowne, ryzykowne, wymagają okresów rekonwalescencji, a tym samym stanowią dodatkowe obciążenie dla systemów opieki zdrowotnej. Nieinwazyjne metody terapeutyczne mogą stanowić bezpieczniejszą i tańszą alternatywę dla konwencjonalnych procedur chirurgicznych. Jednak obecne nieinwazyjne podejścia, takie jak farmakoterapia lub przezczaszkowa stymulacja magnetyczna, są często ograniczone przez kompromisy między penetracją tkanek, rozdzielczością czasoprzestrzenną i niepożądanymi efektami poza celem. W tym kontekście zogniskowane ultradźwięki stanowią obiecującą nieinwazyjną technologię, która może manipulować funkcjami biologicznymi głęboko w tkankach z dużą dokładnością czasoprzestrzenną i ograniczonymi efektami poza celem.
Skoncentrowana stymulacja ultradźwiękowa polega na dostarczaniu energii akustycznej w ściśle określone miejsca głęboko w organizmach żywych. W zależności od parametrów impulsu akustycznego, energia ta może mieć różne zastosowania medyczne. Na przykład Agencja ds. Żywności i Leków zatwierdziła stosowanie skoncentrowanych ultradźwięków o wysokiej intensywności (HiFU) do ablacji termicznej guzów prostaty, obszarów mózgu powodujących drżenie, mięśniaków macicy i powodujących ból zakończeń nerwowych w przerzutach do kości1. Kawitacja mikropęcherzykowa za pośrednictwem HiFu jest również wykorzystywana do przejściowego otwierania bariery krew-mózg w celu ukierunkowanego dostarczania leków podawanych ogólnoustrojowo2. Średnia intensywność impulsu w szczycie przestrzennym (Isppa) i średnia intensywność czasowa w szczycie przestrzennym (Ispta) stosowane w zastosowaniach HiFU są zwykle powyżej kilku kW cm-2 i wytwarzają ciśnienie impulsu kilkudziesięciu MPa. Te wartości intensywności są znacznie powyżej zatwierdzonych przez FDA limitów Isppa i Ispta dla ultrasonografii diagnostycznej, odpowiednio 190 W cm-2 i 720 mW cm-23. W przeciwieństwie do tego, ostatnie badania wykazały, że nieniszcząca pulsacyjna stymulacja ultradźwiękowa, która znajduje się w zakresie lub w pobliżu limitów intensywności diagnostycznych ultradźwięków (LIPUS), może być skuteczna w zdalnym i bezpiecznym manipulowaniu wypalaniem neuronów4,5,6,7,8, wydzielanie hormonów9,10 oraz bioinżynieria komórek11. Jednak mechanizmy komórkowe i molekularne, za pomocą których komórki wyczuwają i reagują na ultradźwięki, pozostają niejasne, co wyklucza kliniczną translację LIPUS. W związku z tym w ciągu ostatnich kilku lat badania sztucznych błon, hodowanych komórek i zwierząt stymulowanych ultradźwiękami nabrały tempa, aby ujawnić procesy biofizyczne i fizjologiczne modulowane przez LIPUS12,13,14,15.
Dźwięk składa się z wibracji rozchodzącej się przez fizyczny nośnik. Ultradźwięki to dźwięk o częstotliwości przekraczającej zakres słyszalny dla człowieka (tj. powyżej 20 kHz). W warunkach laboratoryjnych fale ultradźwiękowe są zwykle wytwarzane przez przetworniki piezoelektryczne, które zawierają materiał, który wibruje w odpowiedzi na pole elektryczne oscylujące w określonym paśmie wysokiej częstotliwości. Istnieją dwa rodzaje przetworników: przetworniki jednoelementowe i układy przetworników. Jednoelementowe przetworniki piezoelektryczne mają zakrzywioną powierzchnię, która działa jak soczewka skupiająca, a tym samym koncentruje energię akustyczną w określonym obszarze zwanym strefą ogniskową. Przetworniki jednoelementowe są znacznie tańsze i łatwiejsze w obsłudze niż matryce przetworników. W tym artykule skupimy się na przetwornikach jednoelementowych.
Rozmiar strefy ogniskowej jednoelementowego przetwornika zależy od właściwości geometrycznych soczewki akustycznej i od jej częstotliwości akustycznej. Aby uzyskać milimetrową strefę ogniskową z jednoelementowym przetwornikiem, zazwyczaj wymagane są częstotliwości ultradźwiękowe w zakresie MHz. Niestety, fale akustyczne o takiej częstotliwości są bardzo szybko tłumione, gdy rozchodzą się w rzadkim ośrodku, takim jak powietrze. W związku z tym fale ultradźwiękowe MHz muszą być generowane i rozchodzone do próbki w gęstszym materiale, takim jak woda. Jest to pierwsze wyzwanie związane z integracją modalności LIPUS z mikroskopem.
Drugim wyzwaniem jest zminimalizowanie fizycznych granic między materiałami o różnych impedancjach akustycznych (co jest iloczynem gęstości materiału i prędkości akustycznej) wzdłuż ścieżki akustycznej. Interfejsy te mogą odbijać, załamywać, rozpraszać i pochłaniać fale akustyczne, co utrudnia ilościowe określenie ilości energii akustycznej skutecznie dostarczanej do próbki. Mogą również tworzyć niechciane artefakty mechaniczne. Na przykład odbicia wytwarzane prostopadle do interfejsów impedancji niedopasowania akustycznego tworzą fale rozchodzące się wstecznie, które zakłócają fale rozchodzące się do przodu. Wzdłuż ścieżki interferencyjnej fale znoszą się nawzajem w ustalonych obszarach przestrzeni zwanych węzłami i sumują się w naprzemiennych obszarach zwanych antywęzłami, tworząc tak zwane fale stojące (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ważne jest, aby eksperymentator był w stanie kontrolować lub eliminować te eksperymentalne interfejsy in vitro, ponieważ mogą one nie istnieć in vivo.
Pomiar fluorescencji reporterów optycznych jest dobrze znaną metodą badania przezroczystych próbek biologicznych w czasie rzeczywistym i bez fizycznych zakłóceń. Podejście to jest zatem idealne do badań LIPUS, ponieważ wszelkie sondy fizyczne obecne w obszarze sonikowanym wprowadzą artefakty mechaniczne. Protokół ten opisuje implementację i działanie LIPUS w komercyjnym mikroskopie epifluorescencyjnym.

<table><tbody><tr><td>mikroskop pionowy o dużej objętości roboczej</td><td>Mikroskop pionowy Thorlabs</td><td>CERNA</td><td></td></tr><tr><td>o dużej objętości roboczej</td><td>Elementy</td> optomechaniczne Scientifica <td>SliceScope</td><td></td></tr><tr><td>hydrofon igłowy bez igły</td><td>ONDA Corporation</td><td>Seria HNP/C/R/A/T + hydrofon igłowy przedwzmacniacza</td><td></td>AH/G</tr><tr><td></td><td></td><td></td> Precyzja <td></td></tr><tr><td></td><td> Akustyka</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>hydrofon światłowodowy</td><td>ONDA Corporation</td> Hydrofon światłowodowy serii <td></td><td>HFO</td></tr><tr><td></td><td>Precision Acoustics</td><td>brak</td><td></td></tr><tr><td>oscyloskopu</td><td>Technologia Keysight</td><td>DSOX2004A (4-kanałowy 70 MHz)</td><td></td></tr> <tr><td>generator funkcyjny</td><td>Keysight Technology</td><td>33500B (jednokanałowy 20 MHz)</td><td></td></tr> <tr><td>Wzmacniacz mocy RF</td><td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td><td>325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz mocy RF</td><td>Elektronika i Innowacje (E& I)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>zanurzeniowy przetwornik ultradźwiękowy</td><td>Olympus</td><td>skupione zanurzeniowe przetworniki ultradźwiękowe</td><td></td>Olympus</tr> zanurzeniowy <tr><td>przetwornik ultradźwiękowy</td><td>Benthowave Instrument</td><td>Przetwornik HiFu Zanurzeniowy</td> przetwornik ultradźwiękowy serii <td></td>BII-76</tr><tr><td></td><td>Precision Acoustics</td> Przetworniki <td></td><td>piezoceramiczne lub HiFu</td></tr><tr><td>zanurzeniowy przetwornik ultradźwiękowy</td><td>Ultrasonic-S-lab</td><td>Przetworniki HiFu produkowane na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel o dużej gęstości Corning</td><td></td><td>VWR 80094-330</td><td></td></tr><tr><td>Folia Mylar 2,5 mikrona</td><td>Chemplex</td><td>CAT.NO:107</td><td></td></tr></tbody></table>

multipleksowa zogniskowana stymulacja ultradźwiękowa z mikroskopią fluorescencyjną

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Poprzez skupianie impulsów ultradźwiękowych o niskiej intensywności, które przenikają do tkanek miękkich, LIPUS stanowi obiecującą technologię biomedyczną do zdalnego i bezpiecznego manipulowania odpalaniem neuronów, wydzielaniem hormonów i genetycznie przeprogramowanymi komórkami. Jednak zastosowanie tej technologii do zastosowań medycznych jest obecnie utrudnione ze względu na brak mechanizmów biofizycznych, za pomocą których docelowe tkanki wyczuwają i reagują na LIPUS. Odpowiednim podejściem do identyfikacji tych mechanizmów byłoby wykorzystanie bioczujników optycznych w połączeniu z LIPUS w celu określenia podstawowych szlaków sygnałowych. Jednak zastosowanie LIPUS w mikroskopie fluorescencyjnym może wprowadzić niepożądane artefakty mechaniczne ze względu na obecność fizycznych interfejsów, które odbijają, pochłaniają i załamują fale akustyczne. W artykule przedstawiono krok po kroku procedurę włączania LIPUS do dostępnych na rynku pionowych mikroskopów epifluorescencyjnych przy jednoczesnej minimalizacji wpływu fizycznych interfejsów wzdłuż ścieżki akustycznej. Opisano prostą procedurę obsługi jednoelementowego przetwornika ultradźwiękowego i doprowadzenia strefy ogniskowej przetwornika do punktu ogniskowego obiektywu. Zastosowanie LIPUS zilustrowano przykładem stanów przejściowych wapnia indukowanych przez LIPUS w hodowanych ludzkich komórkach glejaka, mierzonych za pomocą obrazowania wapnia.

Rysunek 5 przedstawia przykład eksperymentu LIPUS zmultipksowanego z obrazowaniem wapnia. Komórki glejaka (A-172) hodowano na powleczonej EMPM folii poliestrowej w standardowej pożywce hodowlanej (uzupełnionej o 10% surowicy i 1% antybiotyków) i inkubowano z fluo-4 AM, fluorescencyjnym reporterem czułym na wapń. Obrazowanie komórek przeprowadzono przy użyciu obiektywu imersyjnego 10X, oświetlając preparat białym źródłem światła LED; sygnał fluorescencyjny zbi...

Niskointensywna pulsacyjna stymulacja ultradźwiękowa (LIPUS) to metoda nieinwazyjnej mechanicznej stymulacji komórek endogennych lub inżynieryjnych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym artykule opisano, jak wdrożyć LIPUS do mikroskopu epifluorescencyjnego i jak zminimalizować niedopasowanie impedancji akustycznej wzdłuż ścieżki ultradźwięków, aby zapobiec niepożądanym artefaktom mechanicznym.

Multipleksowa zogniskowana stymulacja ultradźwiękowa z mikroskopią fluorescencyjną

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w mechanobiologii, takie jak to, jak próbki biologiczne reagują na siły mechaniczne wytwarzane przez stymulację ultradźwiękową o niskiej intensywności. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona eksperymentatorowi na nieinwazyjne przyłożenie sił mechanicznych do próbki i pomiar różnych obwodów biologicznych w czasie rzeczywistym. Aby rozpocząć, powoli wywierć 12-milimetrowy otwór na dnie standardowej 35-milimetrowej naczynia hodowlanej za pomocą pionowej wiertarki.Po wywierceniu usuń kawałki plastiku przymocowane do dna naczynia za pomocą ostrza, aby uzyskać gładką powierzchnię po stronie zewnętrznej. Następnie nałóż cienką warstwę żywicy epoksydowej lub kleju klasy morskiej na zewnętrzną dolną powierzchnię naczynia. Na wierzchu kleju umieść dwupunktową folię poliestrową o grubości pięciu mikronów, mocno dociskając, aby upewnić się, że klej równomiernie rozprowadza się między folią a grubą powierzchnią tworzywa sztucznego.Delikatnie pociągnij folię palcami w sposób odśrodkowy, aby uzyskać płaską powierzchnię. Po wyschnięciu kleju krótko spłucz dolne naczynie poliestrowe 95% etanolem. Następnie wysterylizuj naczynie promi

multiplexing-focused-ultrasound-stimulation-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Demonstrujemy metodę obrazowania wielu cząsteczek w heterogenicznych nanostrukturach z dokładnością do pojedynczej cząsteczki, wykorzystując sekwencyjne wiązanie i elucję fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Ściśle skoncentrowany laser femtosekundowy może dostarczać precyzyjną stymulację komórkom poprzez połączenie z mikroskopią konfokalną, umożliwiając obserwację w czasie rzeczywistym i fotostymulację. Fotostymulacja może aktywować zdarzenia molekularne komórki, w tym szlak sygnałowy ERK i mitochondrialne błyski reaktywnych form tlenu.

Fotostymulacja laserem femtosekundowym aktywuje sygnalizację kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) lub zdarzenia mitochondrialne w komórkach docelowych

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Ten protokół opisuje procedury chirurgiczne i techniczne, które umożliwiają w czasie rzeczywistym wielofotonowe obrazowanie fluorescencyjne mózgu gryzonia podczas skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzykowych w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg.

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg

Przedstawione protokoły mogą być użyte do scharakteryzowania reakcji znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków przeznaczonych do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym ich mechanizmów aktywacji, jak również ich efektów biologicznych. W artykule omówiono szereg technik mikroskopii in vitro i in vivo wykonanych w celu uchwycenia odpowiednich długości i skal czasowych.

Wieloczasowe metody mikroskopowe do charakterystyki mikropęcherzyków znakowanych fluorescencyjnie do uwalniania leków wywołanego ultradźwiękami

Pokazano szybki i otwarty ultrafioletowy mikroskop fotoakustyczny, który może śródoperacyjnie dostarczać obrazy histologiczne do chirurgicznej analizy marginesów, w tym konfiguracji systemu, wyrównania optycznego, przygotowania próbki i procedur eksperymentalnych.

Szybka mikroskopia fotoakustyczna w ultrafiolecie do obrazowania histologicznego z wirtualnym barwieniem wspomagana przez głębokie uczenie

Protokół obejmuje produkcję przetworników, raportowanie parametrów, zabieg chirurgiczny i rejestrację sygnału dla całego operacyjnego przepływu pracy jednoczesnej skoncentrowanej neuromodulacji ultradźwiękowej i rejestracji fotometrii światłowodowej u myszy o swobodnym ruchu.

Jednoczesna zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa i zapis fotometrii światłowodowej w myszy swobodnej

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Poznaj metodę LIPUS do nieinwazyjnej stymulacji komórek w badaniach mechanobiologicznych z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia precyzyjne pomiar odpowiedzi komórkowych w czasie rzeczywistym.

Multipleksowa zogniskowana stymulacja ultradźwiękowa z mikroskopią fluorescencyjną

Przeglądaj więcej filmów