Multipleksowa zogniskowana stymulacja ultradźwiękowa z mikroskopią fluorescencyjną

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w mechanobiologii, takie jak to, jak próbki biologiczne reagują na siły mechaniczne wytwarzane przez stymulację ultradźwiękową o niskiej intensywności. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona eksperymentatorowi na nieinwazyjne przyłożenie sił mechanicznych do próbki i pomiar różnych obwodów biologicznych w czasie rzeczywistym. Aby rozpocząć, powoli wywierć 12-milimetrowy otwór na dnie standardowej 35-milimetrowej naczynia hodowlanej za pomocą pionowej wiertarki.

Po wywierceniu usuń kawałki plastiku przymocowane do dna naczynia za pomocą ostrza, aby uzyskać gładką powierzchnię po stronie zewnętrznej. Następnie nałóż cienką warstwę żywicy epoksydowej lub kleju klasy morskiej na zewnętrzną dolną powierzchnię naczynia. Na wierzchu kleju umieść dwupunktową folię poliestrową o grubości pięciu mikronów, mocno dociskając, aby upewnić się, że klej równomiernie rozprowadza się między folią a grubą powierzchnią tworzywa sztucznego.

Delikatnie pociągnij folię palcami w sposób odśrodkowy, aby uzyskać płaską powierzchnię. Po wyschnięciu kleju krótko spłucz dolne naczynie poliestrowe 95% etanolem. Następnie wysterylizuj naczynie promieniami UV, umieszczając je pod silnym źródłem wzbudzenia UV o długości 254 nanometrów.

Dostosuj czas trwania i intensywność, aby dostarczyć dawkę UV około 330 milidżuli na centymetr kwadratowy. Następnie rozcieńczyć dostępną w handlu mieszaninę białek macierzy zewnątrzkomórkowej żądaną pożywką hodowlaną w stosunku od jednego do 100. Pracuj na lodzie, aby zapobiec polimeryzacji matrycy, i szybko nałóż 100 mikrolitrów mieszaniny podłoża na folię poliestrową.

Umieść pokrywkę z powrotem na naczyniu, aby zachować sterylność. Po przykryciu inkubować pokryte matrycą, poliestrowe płytki dolne w inkubatorze buforowanym dwutlenkiem węgla w kulturze komórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do 12 godzin. Po inkubacji odessać nadmiar pożywki i bezpośrednio zasiać powierzchnię komórkami o pożądanej gęstości.

Umieść zbiornik na wodę pod obiektywem mikroskopu pionowego. Następnie, korzystając z dostępnych na rynku komponentów optomechanicznych, umieść uchwyt próbki między obiektywem a przetwornikiem. Upewnij się, że ruchome części i siłowniki stopni translacyjnych znajdują się na zewnątrz zbiornika lub nad linią wodną, aby uniknąć uszkodzenia przez wodę.

Następnie napełnij zbiornik wodą zdejonizowaną i odgazowaną do płaszczyzny poziomej uchwytu próbki, przed użyciem przetwornika zanurzeniowego. Używając niekorozyjnych, dostępnych w handlu elementów optomechanicznych, upewnij się, że przetwornik znajduje się w pozycji ukośnej w stosunku do ścieżki optycznej. Zapewni to, że wszelkie odbite fale zostaną skierowane z dala od próbki.

Dostosuj częstotliwość generatora funkcyjnego do znamionowej częstotliwości szczytowej przetwornika. Następnie utwórz sinusoidalny impuls napięciowy o żądanym czasie trwania i częstotliwości powtarzania, korzystając z trybu burst generatora funkcyjnego. Następnie dostosuj napięcie międzyszczytowe do żądanej wartości.

Upewnij się, że czas trwania impulsu jest krótszy niż czas, który upłynął między dwoma kolejnymi impulsami. Podłącz wyjście generatora funkcyjnego do wejścia oscyloskopu. Użyj oscyloskopu, aby potwierdzić, że przebieg odpowiada żądanemu sygnałowi.

Następnie podłącz wyjście generatora funkcyjnego do wejścia mocy wzmacniacza RF o odpowiedniej wielkości. Używając sondy hydrofonowej, która działa w zakresie częstotliwości i natężeniu akustycznym zgodnym z przetwornikiem ultradźwiękowym, ostrożnie ustaw końcówkę sondy w polu widzenia obiektywu w pozycji próbki. Upewnij się, że zarówno sonda, jak i przetwornik są zanurzone w łaźni wodnej i wykonaj wstępne ustawienie przetwornika, wizualnie ustawiając jego oś akustyczną w kierunku sondy hydrofonu.

Upewnij się, że odległość między nimi odpowiada ogniskowej przetwornika. Nie uderzaj końcówką hydrofonu żadnym fizycznym przedmiotem innym niż woda, ponieważ zmieni to jego powłokę i wpłynie na pomiar. Następnie podłącz wyjście hydrofonu do jednego z wejść sygnałowych oscyloskopu.

Następnie podłącz wyzwalacz synchronizacji z generatora funkcyjnego do innego wejścia oscyloskopu. Wizualizuj oba sygnały jednocześnie na oscyloskopie. Następnie steruj przetwornikiem kilkoma cyklami ultradźwiękowymi przy niskim cyklu pracy i niskiej amplitudzie, aby uniknąć uszkodzenia sondy.

Sprawdź u producenta hydrofonu bezpieczne warunki pracy, aby uniknąć uszkodzenia końcówki hydrofonu. Wyreguluj pokrętło podziału S zgodnie z czasem podróży ultradźwięków od powierzchni przetwornika do hydrofonu. Poszukaj sygnału hydrofonu na oscyloskopie po wyzwoleniu synchronizacji.

Następnie powoli uruchamiaj przetwornik za pomocą zmotoryzowanego lub ręcznego stolika XYZ. Ustaw przetwornik w pozycji, która odpowiada maksymalnemu sygnałowi hydrofonu. Gdy wiązka jest teraz wyrównana, zmierz amplitudę między szczytami wyjścia hydrofonu na oscyloskopie dla różnych napięć napędzających przetwornik.

Upewnij się, że nie przekroczyłeś limitu ciśnienia hydrofonu. Zastąp pożywkę hodowlaną komórki żądanym buforem obrazowania zawierającym pięć mikromolowych barwnika przenikającego przez komórkę, wrażliwego na wapń, takiego jak Fluo-4 AM. Następnie inkubuj szalkę hodowlaną w inkubatorze buforowanym dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji ostrożnie umyć komórki tym samym buforem wolnym od barwnika.

Następnie umieść naczynie w uchwycie na próbkę. Wzbudz komórki za pomocą oświetlenia niebieskim światłem o długości 490 nanometrów. Dostosuj intensywność wzbudzenia i ekspozycję aparatu, aby uniknąć nadmiernego rozjaśniania lub nasycenia pikseli.

Wykonywanie zdjęć poklatkowych przy użyciu obiektywu immersyjnego o dużej odległości roboczej zapewnia lepszą jakość obrazu i redukcję niepożądanych odbić. Tutaj komórki glejaka są pokazane na folii poliestrowej pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową w standardowej pożywce hodowlanej. Komórki te inkubowano za pomocą wrażliwego na wapń reportera fluorescencyjnego.

Na tym zdjęciu czerwone kropki reprezentują pojedyncze komórki fluorescencyjne, zidentyfikowane za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Po stymulacji przez 10 sekund ultradźwiękami uwidoczniono znaczne podwyższenie stężenia wapnia w wielu obszarach zainteresowania. W tym miejscu pokazana jest liczba aktywowanych obszarów zainteresowania w czasie.

Po 10-sekundowej aktywacji za pomocą ultradźwięków stwierdzono, że około 70% regionów przekracza wartości progowe zdefiniowane przez użytkownika. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ustawieniu wiązki ultradźwięków przed wykonaniem pomiaru fluorescencji.