Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Aby w pełni scharakteryzować fenotyp mikrogleju, ważne jest, aby zająć się zarówno ruchliwością podstawową, jak i kierunkową. Protokół ten może być wykorzystany do badania kierunkowej ruchliwości mikrogleju za pomocą obrazowania dwufotonowego w wycinkach mózgu myszy, przy użyciu niestandardowego interfejsu druku 3D i komór perfuzyjnych. Procedurę zademonstrują Fanny Etienne, doktorantka, i Vincenzo Mastriolia, badacz ze stopniem doktora, oboje z naszych laboratoriów.

Co najmniej 30 minut przed sekcją zacznij bulgotać 70 mililitrów sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego choliny lub choliny aCSF na lodzie. Dodaj 150 mililitrów choliny aCSF w temperaturze 32 stopni Celsjusza z karbogenem. Umieść 200-mililitrowe naczynie krystalizujące z magnesem sztabkowym w szczelnie zamkniętym pudełku na żywność i dodaj 200 mililitrów aCSF do naczynia.

Umieść wydrukowany w 3D uchwyt na plasterki interfejsu na wierzchu naczynia i usuń nadmiar płynu z naczynia krystalizującego, aż pozostanie tylko cienka warstwa roztworu pokrywająca siatkę uchwytu suwaka interfejsu. Dodaj kilka milimetrów CSF na dnie pudełka na żywność i zacznij bulgotać płyn karbogenem. Następnie zamknij szczelne pudełko, utrzymując stałą karbonizację, aby stworzyć nawilżoną, bogatą w 95% tlen i 5% dwutlenek węgla komorę interfejsową.

Po zbiorach umieść mózg na kawałku bibuły filtracyjnej nasączonej płynem CSF i wypreparuj interesujący Cię obszar, zgodnie z preferowanym kątem krojenia. W przypadku plastrów koronalnych umieść i przyklej ogonową powierzchnię mózgu do 10-centymetrowej szalki Petriego przymocowanej do bloku tnącego wibracyjnej krajalnicy i umieść blok w komorze zbiornika wibrującej krajalnicy w dużej komorze wypełnionej lodem. Napełnij naczynie lodowatą choliną aCSF i użyj krajalnicy, aby uzyskać plastry mózgu o grubości 300 mikrometrów, używając jednorazowej pipety transferowej o średnicy czterech milimetrów po każdym przejściu ostrza, aby zebrać każdy plasterek.

Pozwól każdemu plasterkowi zregenerować się w 32 stopniach Celsjusza cholina aCSF przez około 10 minut po uzyskaniu, zanim przeniesiesz plasterki na kawałki bibuły do czyszczenia soczewek, zwieńczone kroplą choliny aCSF. Następnie odessać nadmiar choliny aCSF i za pomocą szpatułki przenieść plastry na siatkę komory interfejsu, pozwalając plastrom odzyskać siły w tym środowisku przez co najmniej 30 minut. Na 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania podłącz pompę perystaltyczną do dostosowanej komory rejestrującej z górną i dolną perfuzją w celu optymalizacji natlenienia i żywotności wycinków tkanki, a następnie wyczyść cały system perfuzyjny 50 mililitrami ultraczystej wody.

Pod koniec cyklu czyszczenia należy rozpocząć perfuzję w komorze rejestracyjnej z 50 mililitrami aCSF w szklanej zlewce przy stałym karbonowaniu i użyć jednorazowej pipety do przenoszenia z szeroką parążką, aby przenieść pierwszy plasterek, który ma być zobrazowany, do zlewki w celu usunięcia bibuły do soczewek. Gdy fragment opadnie na dno zlewki, przenieś go do komory rejestrującej i umieść uchwyt plastra na plasterku, aby zminimalizować ruch wywołany przepływem perfuzji. Użyj oświetlenia jasnego pola, aby skupić się na obszarze mózgu pod powiększeniem od pięciu do 10 razy.

Następnie użyj obiektywu 25x z soczewką zanurzeniową 0,35x, aby dostosować położenie pola widzenia. Użyj oświetlenia fluorescencyjnego, aby zlokalizować fluorescencyjne komórki mikrogleju i napełnić pipetę 10 mikrolitrami aCSF zawierającego interesujący nas związek o jego końcowym stężeniu. Skieruj końcówkę w dół, delikatnie potrząsając, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w końcówce i zamontuj napełnioną pipetę w uchwycie na pipety podłączonym do pięciomililitrowej strzykawki z tłokiem umieszczonym w pozycji pięciu mililitrów i zamontowanym na trójosiowym mikromanipulatorze.

Delikatnie opuść pipetę w kierunku plasterka, jednocześnie kontrolując i regulując obiektyw, aż końcówka pipety lekko dotknie powierzchni plasterka. Teraz dostrój laser i przełącz mikroskop w tryb wielofotonowy. Upewnij się, że komora jest osłonięta od wszelkich źródeł światła i włącz detektory bez deskanowania.

Ustaw wzmocnienie i użyj tabeli przeglądowej z górnym limitem oznaczonym kolorami, aby uniknąć nasycenia pikseli na obrazie. Następnie rozpocznij nagrywanie przez łączny czas co najmniej 30 minut, powoli wciskając tłok strzykawki z pozycji od pięciu do jednego mililitra, po pięciu minutach, przez okres pięciu sekund, aby nałożyć związek na sekcję. W celu analizy obrazu należy najpierw wykonać projekcję z i korekcję dryfu za pomocą ImageJ na interesującym Cię pliku.

Następnie otwórz zmodyfikowany plik w Icy i narysuj okrągły obszar zainteresowania o średnicy 35 mikrometrów, wyśrodkowany nad miejscem wstrzyknięcia. Uruchom film ponownie z ROI, aby upewnić się, że jest dobrze ustawiony. Następnie użyj wtyczki Region of Interest Intensity Evolution, aby zmierzyć średnią intensywność w czasie w obszarze zainteresowania i zapisać wyniki jako plik xls.

Protokół ten pozwala na pomiar odpowiedzi indukowanych przez różne związki, takie jak ATP lub serotonina. Chociaż wstrzyknięcie ATP wywołuje wzrost fluorescencji, po większości wstrzyknięć ATP następuje natychmiastowy, niewielki spadek fluorescencji spowodowany zniekształceniem tkanek, które powraca po kilku minutach. Rozmiar obszaru zainteresowania również wpływa na kwantyfikację, ponieważ zwiększenie średnicy zmniejsza zmienność między eksperymentami, ale zmniejsza dokładność i wielkość wykrytej odpowiedzi.

Ocena odpowiedzi mikrogleju w określonym punkcie czasowym może być przydatna do statystycznego porównania różnych związków lub do zbadania wpływu określonych antagonistów dodanych do roztworu perfuzyjnego. Aby określić ilościowo ruchliwość w trzech wymiarach, należy pamiętać, że może być konieczna zmiana interwału kroku z i częstotliwości próbkowania akwizycji, aby dopasować się do wymagań analizy.