Name: Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowej mikroskopii do badania przyciągania procesów mikroglejowych w ostrych wycinkach mózgu myszy. Technika ta pozwala analizować odpowiedzi komórek na ATP i serotoninę w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Zakładowi Obrazowania Komórek i Tkanek w Institut du Fer à Moulin, gdzie przeprowadzono wszystkie akwizycje i analizy obrazów. Prace te były częściowo wspierane przez Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Sorbonne Université Sciences oraz przez granty z Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie University (program Emergence-UPMC 2011/2014), Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", francuskie Ministerstwo Badań Naukowych (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 i program Investissements d'Avenir "Bio-Psy Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) oraz program Collaborative Research in Computational Neuroscience, National Science Foundation/Francuska Narodowa Agencja Badań Naukowych (numer : 1515686). Wszyscy autorzy są afiliowani w grupach badawczych będących członkami Paris School of Neuroscience (ENP) oraz Bio-Psy Labex. F.E. jest doktorantem afiliowanym na Sorbonne Université, Collège Doctoral, F-75005 Paryż, Francja i jest finansowany przez Bio-Psy Labex. V.M. jest adiunktem finansowanym przez program Collaborative Research in Computational Neuroscience, National Science Foundation/Francuską Narodową Agencję Badań (numer: 1515686). Autorzy dziękują Marcie Kołodziejczak, która brała udział w zainicjowaniu projektu.

<ol><li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li>
<li>Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+across+the+lifespan%3A+from+origin+to+function+in+brain+development%2C+plasticity+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. , (2016).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuronal+NMDA+receptors+triggers+transient+ATP-mediated+microglial+process+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).</li>
<li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Hristovska, I., Pascual, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+Resting+Microglial+Morphology+and+Process+Motility+from+a+Synaptic+Prospect%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Integrative+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231(2016).</li>
<li>Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+morphological+dynamics+of+activated+microglia+after+induction+of+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 202(2015).</li>
<li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients%2C+Impairs+Microglial+Motility%2C+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis%2FMicroglial+Phagocytosis+Uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biology. 14 (5), e1002466(2016).</li>
<li>Madry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Ramification%2C+Surveillance%2C+and+Interleukin-1%CE%B2+Release+Are+Regulated+by+the+Two-Pore+Domain+K%2BChannel+THIK-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1.</a> Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).</li>
<li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+or+ADP+induce+chemotaxis+of+cultured+microglia+through+Gi%2Fo-coupled+P2Y+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-induced+chemotaxis+of+microglial+processes+requires+P2Y+receptor-activated+initiation+of+outward+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents.</a> Glia. 55 (8), 810-821 (2007).</li>
<li>Kolodziejczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+Modulates+Developmental+Microglia+via+5-HT+2BReceptors%3A+Potential+Implication+during+Synaptic+Refinement+of+Retinogeniculate+Projections%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Sculpt+Postnatal+Neural+Circuits+in+an+Activity+and+Complement-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+hippocampal+long-term+potentiation+increases+the+morphological+dynamics+of+microglial+processes+and+prolongs+their+contacts+with+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines.</a> Scientific Reports. 6, 32422(2016).</li>
<li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Promote+Learning-Dependent+Synapse+Formation+through+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Ohsawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12+receptor-mediated+integrin-beta1+activation+regulates+microglial+process+extension+induced+by+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP.</a> Glia. 58 (7), 790-801 (2010).</li>
<li>Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+activation%2C+motility%2C+and+homing+of+neonatal+microglia+to+injured+neurons+does+not+require+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis.</a> Glia. 54 (1), 58-70 (2006).</li>
<li>Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microglial+activation%3A+a+confocal+time-lapse+analysis+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices.</a> Glia. 33 (3), 256-266 (2001).</li>
<li>Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+Immunolabeling+of+Brain+Slices%3A+SNAPSHOT+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method.</a> Current Protocols in Neuroscience. 71, 1.23.1-12 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icy%3A+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li>
<li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+methods+for+brain+slices%3A+a+discussion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li>
<li>Paris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProMoIJ%3A+A+new+tool+for+automatic+three-dimensional+analysis+of+microglial+process+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility.</a> Glia. 66 (4), 828-845 (2018).</li>
<li>Pagani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+microglial+development+in+the+hippocampus+of+Cx3cr1+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111(2015).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 221-242 (2014).</li>
<li>Mainen, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+in+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18 (2), San Diego, CA. 231-239 (1999).</li>
<li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li>
<li>Gyoneva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+inflammation+regulates+microglial+responses+to+tissue+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo.</a> Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).</li>
<li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Morphological+Analysis+of+Microglia+After+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106(2018).</li>
<li>Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+microglia+in+brain+slices+and+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging microglia in brain slices and slice cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Utrzymując, w przeciwieństwie do zdysocjowanych lub organotypowych kultur warstwowych, integralność strukturalną z ograniczonymi dostosowaniami sieci, ostre wycinki mózgu pozwalają naukowcom badać mikroglej w jego fizjologicznym środowisku. Jednak jednym z głównych ograniczeń jest fakt, że procedura krojenia powoduje urazy, które mogą szybko zagrozić żywotności neuronów, szczególnie w dorosłym mózgu. Ponieważ mikroglej jest szczególnie reaktywny na uszkodzenia komórek, ważne jest, aby w jak największym stopniu ograniczyć...

Komórki mikrogleju są makrofagami rezydującymi w mózgu i odgrywają rolę zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych1,2. Mają silnie rozgałęzioną morfologię i stale wydłużają i cofają swoje procesy3,4. Uważa się, że to zachowanie "skanowania" jest związane i konieczne do badania ich otoczenia. Plastyczność morfologiczna mikrogleju wyraża się w trzech trybach. Po pierwsze, niektóre związki szybko modulują morfologię mikrogleju: dodanie ATP5,6 lub NMDA5,7 w średnio kąpiących się ostrych wycinkach mózgu zwiększa złożoność rozgałęzień mikrogleju, podczas gdy noradrenalina zmniejsza it6. Efekty te są albo bezpośrednio pośredniczone przez receptory mikrogleju (dla ATP i noradrenaliny), albo wymagają uwalniania ATP z neuronów (dla NMDA). Po drugie, na szybkość wzrostu i retrakcji procesów mikrogleju, zwanych ruchliwością lub "nadzorem", mogą wpływać czynniki zewnątrzkomórkowe8, zakłócenia homeostazy9,10, lub mutacje9,10,11. Po trzecie, oprócz tych izotropowych zmian morfologii i ruchliwości, mikroglej ma zdolność do rozszerzania swoich procesów kierunkowo w kierunku pipety dostarczającej ATP3,5,12,13,14, w hodowli, w ostrych wycinkach mózgu lub in vivo, lub dostarczając 5-HT w ostrych wycinkach mózgu15. Tak zorientowany wzrost procesów mikrogleju, zwany również ruchliwością kierunkową, został po raz pierwszy opisany jako odpowiedź na lokalne uszkodzenie laserowe3,4. Tak więc, fizjologicznie, może to być związane z reakcją na uraz lub wymagane do kierowania procesów mikrogleju w kierunku synaps lub regionów mózgu wymagających przycinania podczas rozwoju15,16, lub w physiological17,18,19 lub sytuacje patologiczne9,18,19,20 w wieku dorosłym. Trzy typy zmian morfologicznych opierają się na różnych mechanizmach wewnątrzkomórkowych11,13,20, a jeden dany związek niekoniecznie moduluje wszystkie z nich (np. NMDA, który działa pośrednio na mikroglej, ma wpływ na morfologię, ale nie indukuje ruchliwości kierunkowej5,7). Dlatego, dążąc do scharakteryzowania wpływu związku, mutacji lub patologii na mikroglej, ważne jest scharakteryzowanie trzech składników jego plastyczności morfologicznej. W tym miejscu opisujemy metodę badania kierunkowego wzrostu procesów mikrogleju w kierunku lokalnego źródła związku, którym jest ATP lub 5-HT.
Istnieje kilka modeli do badania atrakcyjności procesów mikrogleju: kultury pierwotne w środowisku 3D6,18,19, ostre plastry mózgu6,13,15, oraz obrazowanie in vivo3,13. Podejście in vivo jest najlepsze dla zachowania fizjologicznego stanu mikrogleju. Jednak obrazowanie przyżyciowe głębokich obszarów wymaga skomplikowanych zabiegów chirurgicznych i dlatego często ogranicza się do powierzchownych warstw kory mózgowej. Zastosowanie pierwotnej hodowli mikrogleju jest najłatwiejszą techniką testowania dużej liczby warunków na ograniczonej liczbie zwierząt. Niemniej jednak niemożliwe jest uzyskanie takiej samej morfologii komórek jak in vivo, a komórki tracą swoje fizjologiczne interakcje z neuronami i astrocytami. Ostre wycinki mózgu stanowią kompromis między tymi dwoma podejściami. Model ten pozwala naukowcom badać struktury mózgu, do których w inny sposób trudno jest dotrzeć, i obrazować w wysokiej rozdzielczości in vivo, a także badać wycinki z etapów noworodkowych, podczas gdy mikroskopia przezczaszkowa jest najczęściej wykonywana w wieku dorosłym. Wreszcie, umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym efektów miejscowego stosowania leków oraz powtarzanie eksperymentów z wykorzystaniem ograniczonej liczby zwierząt. Niemniej jednak problemem związanym z ostrymi wycinkami mózgu jest ograniczony czas (kilka godzin), podczas którego komórki pozostają żywe, szczególnie w przypadku wycinków myszy starszych niż dwa tygodnie, oraz potencjalna zmiana morfologii mikrogleju w czasie21,22.
Tutaj opisujemy protokół przygotowania ostrych wycinków mózgu młodych i dorosłych myszy Cx3cr1GFP/+ do dwóch miesięcy, z zachowaniem morfologii i ruchliwości mikrogleju przez kilka godzin. Następnie opisujemy, jak wykorzystać te wycinki do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związków takich jak ATP lub 5-HT.

<table><tbody><tr><td>do przygotowania pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr>Clark <tr><td>Borokrzemianowe cienkościenne kapilary</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0065</td><td>Borokrzemian cienkościenny bez żarnika, 1,5 mm OD, 1,17 mm ID, 75 mm L , opakowanie 225</td></tr><tr><td>DMZ Uniwersalny ściągacz</td><td>Zeitz Instrumente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>do roztworów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)Sigma</td><td></td> <td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek choliny</td><td>Sigma</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu 1 M (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu SigmaUltra >99.0% (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda</td><td>MilliQ</td><td></td><td>do wszystkich roztworów</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>for Przygotowanie plastrów</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x 200 ml naczyń</td><td></td><td></td><td></td>krystalizujących</tr><tr><td>80 ml zlewki</td><td></td><td></td><td></td>Pyrex</tr><tr><td>Antlia-3C Cyfrowa pompa perystaltyczna</td><td>DD Biolab</td><td>178961</td><td>Dla myszy perfuzja i perfuzja w komorze 2-fotonowej (aCSF)</td></tr><tr><td>Karbogen 5% CO2/95% O2</td><td>Air Liquide Francja Industrie</td><td></td><td></td></tr> Bibuła filtracyjna <tr><td>Dolethal</td><td>Vetoquinol</td><td>Dolethal 50 mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>(Whatman)</td><td>Sigma</td><td>WHA1001042</td><td>Jakościowa bibuła filtracyjna Whatman, klasa 1 (wielkość porów: 11&mikro; M)</td></tr> <tr><td>Cienkie nożyczki - Ostre</td><td>narzędzia do nauki</td><td>14060-60</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko na żywność o średnicy 10 cm, klej o wysokości</td><td></td><td></td><td></td>8 cm</tr><tr><td>(cyjanoakrylan etylu)</td><td>Loctite</td><td>super glue 3 power flex</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie hipokampowe (szpatułka)</td><td>Narzędzia do nauki o napięciu</td><td>10099-15</td><td>Największa kończyna musi być pochylona pod kątem 90&</td></tr><tr><td>Kleszcze do tęczówki lodowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(zakrzywione)</td><td>Moria</td><td>MC31</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczka do czyszczenia soczewek</td><td>THOR LABS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitko</td><td></td><td></td> z siatki nylonowej <td>o średnicy 7 cm</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72000</td><td>Do ostrza</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>skalpela</td></tr> krajalnicy <tr><td>Uchwyt interfejsu Slice</td><td></td><td></td><td>domowej roboty, plik do druku 3D znajduje się w</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td> z materiału uzupełniającego - Sharp <td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica wibracyjna</td><td>Thermo Scientific</td><td>720-2709</td><td>Model: HM 650V (mikrotom z ostrzem wibracyjnym)</td></tr> <tr><td>Kąpiel</td><td></td><td></td> wodna <td>Zestaw na 32 & stopni; C (pierwszy etap odzyskiwania)</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>do obrazowania slice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&times; 25 0,95 NA obiektyw do zanurzenia w wodzie</td><td>Leica Microsystems (Niemcy)</td><td>HCX Irapo</td><td></td></tr><tr><td>2-fotonowy mikroskop pionowy MP5 ze skanerami rezonansowymi (8 kHz) i dwoma detektorami hybrydowymi HyD</td><td>Leica Microsystems (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antlia-3C Cyfrowa pompa perystaltyczna</td><td>DD Biolab</td><td>178961</td><td>Do perfuzji w komorze 2-fotonowej z aCSF</td></tr><tr><td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td><td>Air Liquide France Industrie</td><td>I1501L50R2A001</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra2 Ti: laser szafirowy</td><td>Coherent (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>jednorazowe pipety transferowe, szeroka usta</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>na przykład: 232-11</td><td>5,8 ml z końcówką żeberkową, ale przycięliśmy ją (ok. 7 cm), aby mieć filtr emisyjny o średnicy 4 mm</td></tr><tr><td>SP680</td><td>Leica Microsystems (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kostka fluorescencyjna zawierająca filtr emisji 525/50 i filtr dichroiczny 560 (do zbierania fluorescencji)</td><td>Leica Microsystems (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>szklana zlewka z 50 ml ACSF w celu utrzymania stałej perfuzji plastra</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System grzewczy</td><td>Automatyczny sterownik grzałki</td><td>Warner Instrument Corporation</td> TC-324B <td>do utrzymywania roztworu perfuzyjnego na poziomie 32 stopni; Komora</td></tr><tr><td></td><td></td><td>perfuzyjna</td> C <td>domowej roboty, plik do druku 3D znajduje się w materiale uzupełniającym</td></tr><tr><td>uchwyt na plastry ("harfa")</td><td></td><td></td><td>domowej roboty: spinka do włosów wykonana z platyny z dwiema gałęziami połączonymi równoległymi nylonowymi nitkami</td></tr><tr><td><mocny>Nazwa</mocny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td> Uwagi</td></tr><tr><td>do stymulacji plastrów </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna 5&-trifosforan sól disodowa hydrat (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A-26209</td> do <td>przygotowania ex temporane: 1 mg/ml (3 mM) roztwór podstawowy przygotowany w dniu doświadczenia, przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C (kilka godzin) i rozcieńczone tuż przed użyciem</td></tr><tr><td>Fluoresceina (opcjonalnie)</td><td>Sigma</td><td>F-6377</td><td>stosować w stężeniu 1 &mikro; M końcowy</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Luigs i Neumann</td><td>SM7</td><td>podłączony do mikropipety trzyma</td></tr><tr>uchwyt <td></td><td></td><td>na mikropipety</td><td>taki sam jak w eletrofjologii</td></tr><tr><td>Chlorowodorek serotoniny</td><td>Sigma</td><td>H-9523</td><td>podwielokrotności 50mM roztwór podstawowy w H20 utrzymywany w temperaturze -20 &deg;C. 500 &mikro; M roztwór przygotowany w dniu eksperymentu.</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml (bez igły)</td><td>Produkty medyczne Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste rurki</td><td>Fischer Scientific</td><td>11750105</td><td>Saint Gobain Performance Plastics&trade; Tygon&handel; E-3603 Rurki bez DEHP</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>do analizy obrazu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td>Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038</td></tr><tr><td>Icy</td><td>Institut Pasteur</td><td>http://icy.bioimageanalysis.org</td><td>de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX3CR1-GFP myszy</td><td>Jung i wsp., 2000</td><td></td><td>samiec lub samica, P3 do 2 miesięcy; Skrzyżowaliśmy wstecznie te myszy na tle 129SV.</td></tr><tr><td>Myszy CX3CR1creER-YFP</td><td>Parkhurst i in. 2013</td><td></td><td>samce lub samice, P3 do 2 miesięcy; Skrzyżowaliśmy wstecznie te myszy na tle 129sv.</td></tr></tbody></table>

dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do atp lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Komórki mikrogleju to wrodzone komórki odpornościowe mózgu, które nieustannie skanują swoje otoczenie swoimi długimi procesami, a po zakłóceniu homeostazy ulegają szybkim zmianom morfologicznym. Na przykład zmiana laserowa indukuje w ciągu kilku minut zorientowany wzrost procesów mikroglejowych, zwanych również "ruchliwością kierunkową", w kierunku miejsca urazu. Podobny efekt można uzyskać dostarczając miejscowo ATP lub serotoninę (5-hydroksytryptaminę [5-HT]). W tym artykule opisujemy protokół indukowania kierunkowego wzrostu procesów mikrogleju w kierunku lokalnego zastosowania ATP lub 5-HT w ostrych wycinkach mózgu młodych i dorosłych myszy oraz obrazowania tego przyciągania w czasie za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Zaproponowano prostą metodę kwantyfikacji za pomocą bezpłatnego oprogramowania do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym. Wyzwaniem, które nadal charakteryzuje ostre wycinki mózgu, jest ograniczony czas, skracający się wraz z wiekiem, podczas którego komórki pozostają w stanie fizjologicznym. Protokół ten podkreśla zatem pewne ulepszenia techniczne (pożywka, komora interfejsu powietrze-ciecz, komora obrazowania z podwójną perfuzją) mające na celu optymalizację żywotności komórek mikrogleju w ciągu kilku godzin, zwłaszcza w wycinkach od dorosłych myszy.

Niniejszy protokół opisuje metodę indukowania, obserwacji i ilościowego określania zorientowanego wzrostu wypustek mikroglialnych w kierunku lokalnie zastosowanego związku, na przykład ATP lub 5-HT, w ostrych skrawkach mózgu młodych lub dorosłych (co najmniej dwumiesięcznych) myszy. Wśród czynników przyczyniających się do utrzymania skrawków mózgu zwierząt dorosłych w stanie zdrowym przez kilka godzin znajduje się zastosowanie dwóch narzędzi zaprojektowanych w celu optymalizacji przeżywal...

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Aby w pełni scharakteryzować fenotyp mikrogleju, ważne jest, aby zająć się zarówno ruchliwością podstawową, jak i kierunkową. Protokół ten może być wykorzystany do badania kierunkowej ruchliwości mikrogleju za pomocą obrazowania dwufotonowego w wycinkach mózgu myszy, przy użyciu niestandardowego interfejsu druku 3D i komór perfuzyjnych. Procedurę zademonstrują Fanny Etienne, doktorantka, i Vincenzo Mastriolia, badacz ze stopniem doktora, oboje z naszych laboratoriów.Co najmniej 30 minut przed sekcją zacznij bulgotać 70 mililitrów sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego choliny lub choliny aCSF na lodzie. Dodaj 150 mililitrów choliny aCSF w temperaturze 32 stopni Celsjusza z karbogenem. Umieść 200-mililitrowe naczynie krystalizujące z magnesem sztabkowym w szczelnie zamkniętym pudełku na żywność i dodaj 200 mililitrów aCSF do naczynia.Umieść wydrukowany w 3D uchwyt na plasterki interfejsu na wierzchu naczynia i usuń nadmiar płynu z naczynia krystalizującego, aż pozostanie tylko cienka warstwa roztworu pokrywająca siatkę uchwytu suwaka interfejsu. Dodaj kilka milimetrów CSF na dnie pudełka na żywność i zacznij bulgotać płyn karbogenem. Następnie zamknij szczelne pudełko, utrzymując stałą karbonizację, aby stworzyć nawilżoną, bogatą w 95% tlen i 5% dwutlenek węgla komorę interfejsową.Po zbiorach umieść mózg na kawałku bibuły filtracyjnej nasączonej płynem CSF i wypreparuj interesujący Cię obszar, zgodnie z preferowanym kątem krojenia. W przypadku plastrów koronalnych umieść i przyklej ogonową powierzchnię mózgu do 10-centymetrowej szalki Petriego przymocowanej do bloku tnącego wibracyjnej krajalnicy i umieść blok w komorze zbiornika wibrującej krajalnicy w dużej komorze wypełnionej lodem. Napełnij naczynie lodowatą choliną aCSF i użyj krajalnicy, aby uzyskać plastry mózgu o grubości 300 mikrometrów, używając jednorazowej pipety transferowej o średnicy czterech milimetrów po każdym przejściu ostrza, aby zebrać każdy plasterek.Pozwól każdemu plasterkowi zregenerować się w 32 stopniach Celsjusza cholina aCSF przez około 10 minut po uzyskaniu, zanim przeniesiesz plasterki na kawałki bibuły do czyszczenia soczewek, zwieńczone kroplą choliny aCSF. Następnie odessać nadmiar choliny aCSF i za pomocą szpatułki przenieść plastry na siatkę komory interfejsu, pozwalając plastrom odzyskać siły w tym środowisku przez co najmniej 30 minut. Na 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania podłącz pompę perystaltyczną do dostosowanej komory rejestrującej z górną i dolną perfuzją w celu optymalizacji natlenienia i żywotności wycinków tkanki, a następnie wyczyść cały system perfuzyjny 50 mililitrami ultraczystej wody.Pod koniec cyklu czyszczenia należy rozpocząć perfuzję w komorze rejestracyjnej z 50 mililitrami aCSF w szklanej zlewce przy stałym karbonowaniu i użyć jednorazowej pipety do przenoszenia z szeroką parążką, aby przenieść pierwszy plasterek, który ma być zobrazowany, do zlewki w celu usunięcia bibuły do soczewek. Gdy fragment opadnie na dno zlewki, przenieś go do komory rejestrującej i umieść uchwyt plastra na plasterku, aby zminimalizować ruch wywołany przepływem perfuzji. Użyj oświetlenia jasnego pola, aby skupić się na obszarze mózgu pod powiększeniem od pięciu do 10 razy.Następnie użyj obiektywu 25x z soczewką zanurzeniową 0,35x, aby dostosować położenie pola widzenia. Użyj oświetlenia fluorescencyjnego, aby zlokalizować fluorescencyjne komórki mikrogleju i napełnić pipetę 10 mikrolitrami aCSF zawierającego interesujący nas związek o jego końcowym stężeniu. Skieruj końcówkę w dół, delikatnie potrząsając, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w końcówce i zamontuj napełnioną pipetę w uchwycie na pipety podłączonym do pięciomililitrowej strzykawki z tłokiem umieszczonym w pozycji pięciu mililitrów i zamontowanym na trójosiowym mikromanipulatorze.Delikatnie opuść pipetę w kierunku plasterka, jednocześnie kontrolując i regulując obiektyw, aż końcówka pipety lekko dotknie powierzchni plasterka. Teraz dostrój laser i przełącz mikroskop w tryb wielofotonowy. Upewnij się, że komora jest osłonięta od wszelkich źródeł światła i włącz detektory bez deskanowania.Ustaw wzmocnienie i użyj tabeli przeglądowej z górnym limitem oznaczonym kolorami, aby uniknąć nasycenia pikseli na obrazie. Następnie rozpocznij nagrywanie przez łączny czas co najmniej 30 minut, powoli wciskając tłok strzykawki z pozycji od pięciu do jednego mililitra, po pięciu minutach, przez okres pięciu sekund, aby nałożyć związek na sekcję. W celu analizy obrazu należy najpierw wykonać projekcję z i korekcję dryfu za pomocą ImageJ na interesującym Cię pliku.Następnie otwórz zmodyfikowany plik w Icy i narysuj okrągły obszar zainteresowania o średnicy 35 mikrometrów, wyśrodkowany nad miejscem wstrzyknięcia. Uruchom film ponownie z ROI, aby upewnić się, że jest dobrze ustawiony. Następnie użyj wtyczki Region of Interest Intensity Evolution, aby zmierzyć średnią intensywność w czasie w obszarze zainteresowania i zapisać wyniki jako plik xls.Protokół ten pozwala na pomiar odpowiedzi indukowanych przez różne związki, takie jak ATP lub serotonina. Chociaż wstrzyknięcie ATP wywołuje wzrost fluorescencji, po większości wstrzyknięć ATP następuje natychmiastowy, niewielki spadek fluorescencji spowodowany zniekształceniem tkanek, które powraca po kilku minutach. Rozmiar obszaru zainteresowania również wpływa na kwantyfikację, ponieważ zwiększenie średnicy zmniejsza zmienność między eksperymentami, ale zmniejsza dokładność i wielkość wykrytej odpowiedzi.Ocena odpowiedzi mikrogleju w określonym punkcie czasowym może być przydatna do statystycznego porównania różnych związków lub do zbadania wpływu określonych antagonistów dodanych do roztworu perfuzyjnego. Aby określić ilościowo ruchliwość w trzech wymiarach, należy pamiętać, że może być konieczna zmiana interwału kroku z i częstotliwości próbkowania akwizycji, aby dopasować się do wymagań analizy.

two-photon-imaging-microglial-processes-attraction-toward-atp-or

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Źródło: Etienne, F.  i wsp. Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do badania przyciągania procesów mikroglejowych w kierunku wstrzykniętego związku w wycinkach mózgu. Zawiera przegląd przygotowywania wycinków mózgu myszy, wstrzykiwania związku testowego chemoatraktantu i obrazowania znakowanego fluorescencyjnie mikrogleju w celu wizualizacji ich...

Mikroskopia dwufotonowa do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związku w wycinku mózgu myszy

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Poznaj metodę dwufotonowej mikroskopii do badania przyciągania procesów mikroglejowych w ostrych wycinkach mózgu myszy. Technika ta pozwala analizować odpowiedzi komórek na ATP i serotoninę w czasie rzeczywistym.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów