Generowanie klonów komórek rakowych w celu wizualizacji telomerowego RNA TERRA zawierającego powtórzenia wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące telomerów, takie jak lokalizacja telomerów niekodujących RNA TERRA drożdży, i mogę upierać się, że jest to telomer pochodzenia lub w trans, różne cromes-mants Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala naukowcom wizualizować cząsteczki TERRA wyrażające się z pojedynczego telomeru w żywych komórkach. Procedurę zademonstrują Claudio Oss Pegorar i Nicole Bettin, dwie doktorantki z mojego laboratorium. Aby rozpocząć hodowlę komórek AGS zgodnie z protokołem tekstowym.

Następnie, gdy komórki osiągną 50 do 60% konfluencji, przeprowadź je za pomocą wektora eksprymującego sgRNA Cas9 i kasety MS2. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną pożywką zawierającą neomycynę. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 0,25% Tripsyn do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce.

Za pomocą mikroskopu i markera zaznacz pozycję każdego klonu widocznego w naczyniu. Zastąp pożywkę do hodowli neomycyny wystarczającą ilością PBS, aby utworzyć cienką warstwę płynu na klonach. Używając pipety o pojemności 10 mikrolitrów zawierającej pięć mikrolitrów trypsyny, powoli uwolnij trypsynę do kolonii.

Pozwól trypsynie oderwać komórki na jedną minutę. Zeskrob kolonię końcówką i zassaj ją do końcówki. Następnie przenieś komórki z kolonii do studzienki z 96-dołkową płytką.

Inkubować płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie napełnij studzienkę 150 mikrolitrami selektywnej pożywki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów żelatyny do każdego dołka z trzech 96-dołkowych płytek.

Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut i dwukrotnie umyć płytki PBS. Gdy klony osiągną 90% konfluencji, odessać pożywkę z każdej studzienki płytki i umyć płytkę PBS. Następnie dodaj 30 mikrolitrów trypsyny do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie dodaj 70 mikrolitrów selektywnej pożywki do każdej z studzienek. Rozbijaj komórki, pipetując w górę iw dół. Przenieść 30 mikrolitrów mieszaniny do studzienki zżelowanej płytki DNA zawierającej 120 mikrolitrów selektywnej pożywki.

Następnie przenieść 30 mikrolitrów mieszaniny na żelatynową płytkę zamrażającą zawierającą 50 mikrolitrów pożywki. Umieść DNA w inkubatorze i pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną 90% konfluencji. Następnie dodaj 80 mikrolitrów lodowatego podłoża do zamrażania do każdej studzienki płyty zamrażającej.

Uszczelnij płytkę parafilmem, załóż pokrywkę i zawiń płytkę w folię aluminiową. Następnie utrzymuj płytki zamrażające w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Po tym, jak klony w płytce DNA osiągną 90% konfluencji, umyj płytkę dwukrotnie PBS.

Następnie poddać komórki lizie za pomocą 50 mikrolitrów buforu do lizy. Przykryj płytkę parafilmem, załóż pokrywkę i zawiń płytkę w folię saran. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia dodaj 100 mikrolitrów roztworu etanolu chlorku sodu do każdej studzienki i pozwól na wytrącanie DNA przez sześć godzin lub na noc w temperaturze pokojowej. Następnie odwróć płytkę i umyj ją trzykrotnie 200 mikrolitrami etanolu 70% na studzienkę. Dodaj 20 mikrolitrów roztworu RNazy A do każdego dołka płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie użyj trzech mikrolitrów genomowego DNA do amplifikacji PCR i skonfiguruj maszynę do PCR. Hoduj klony z dodatnim wynikiem PCR na sześciu płytkach dołkowych zgodnie z protokołem tekstowym. Gdy klony osiągną 90% konfluencji, umyj komórki PBS i dodaj 250 mikrolitrów buforu do lizy z proteinazą K do każdej studzienki.

Użyj skrobaka do komórek, aby zeskrobać komórki i przenieś lizat do 1.5 mililitrowej probówki. Inkubować lizat w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Dodaj jeden mililitr etanolu do lizatu i energicznie wstrząśnij.

Pozwól klonom rosnąć na pożywce F-12K zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodaj adenowirusa z ekspresją Cre do komórek, gdy osiągną 70% konfluencji. 48 godzin po zakażeniu podziel komórki na trzy 10-centymetrowe szalki.

Następnie hoduj trzecie szalki w celu zamrożenia komórek i ekstrakcji RNA. Najpierw umieść klony TERRA-MS2 i komórki AGS typu dzikiego w naczyniach ze szklanym dnem. Następnie dodać do pożywki Polybrene i MS2-GFP wykazujące ekspresję retrowirusa.

Po 24 godzinach wyrzuć pożywkę zawierającą retrowirusa i dodaj do komórek świeżą pożywkę bez czerwieni fenolowej. Na koniec, za pomocą odwróconego mikroskopu i czułej kamery obrazują komórki z odpowiednim obiektywem i aperturą. W tym protokole stworzono i zobrazowano klony komórek rakowych zawierające znacznik sekwencji MS2 w pojedynczym subtelomorze.

Klony oporne na neomycynę poddano badaniom przesiewowym za pomocą PCR. Dodatnie klony hodowano w lizie w celu ekstrakcji genomowego DNA i analizy Southern blot. Klony z dodatnim wynikiem testu PCR i analizy Southern blot zostały zakażone adenowirusem z ekspresją CRE-GFP w celu usunięcia genu neomycyny obecnego w kasecie MS2.

Po potwierdzeniu eliminacji genu oporności na neomycynę, RNA wyekstrahowane z klonów przetestowano pod kątem ekspresji transkryptów TERRA-MS2. W celu wizualizacji transkryptów TERRA-MS2 w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej, wybrane klony zostały zakażone retrowirusem wykazującym ekspresję białka fuzyjnego MS2-GFP. Transkrypty i telomery TERRA-MS2 zostały jednocześnie uwidocznione w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej poprzez koekspresję białka fuzyjnego MS2-GFP i białka wiążącego telomery skondensowanego mCherry, TRF2, w wybranych klonach.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby dołożyć wszelkich starań, aby wybrać pojedynczy klon zamiast mieszanej populacji klonów. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak DNA FISH na chromosomach rozprzestrzeniających się, w celu wizualizacji integracji kasety MS2 w utrwalonych komórkach. Po jej opracowaniu, technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się telomerami do zbadania lokalizacji komórkowej pojedynczych cząsteczek telomerów TERRA w żywych komórkach ludzkich.

Nie zapominaj, że praca z wektorami wirusowymi i materiałami radioaktywnymi może być bardzo niepewna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartuchów laboratoryjnych, rękawic i używanie osłon z pleksiglasu w celu zminimalizowania promieniowania.