Analiza składu i rozmieszczenia bioaerozoli w różnych warunkach środowiskowych
7 stycznia 2019
Zrozumienie składu biologicznego pyłu zawieszonego w środowisku jest ważne dla badania jego znaczącego wpływu na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób. W tym przypadku zastosowaliśmy trzy rodzaje metod pobierania próbek bioaerozoli oraz analizę biologiczną drobnoustrojów unoszących się w powietrzu, aby lepiej zbadać społeczności drobnoustrojów unoszących się w powietrzu w różnych warunkach środowiskowych.
Zrozumienie składu biologicznego pyłu zawieszonego w środowisku jest ważne dla badania jego znaczącego wpływu na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób. W tej metodzie i analizie pobierania próbek bioaerozoli może mieć szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach nauki, takich jak monitorowanie środowiska i wykrywanie patogenów w powietrzu. Aby określić całkowitą liczbę cząstek stałych, najpierw wyposaż powietrzny laserowy licznik cząstek w czujnik do monitorowania temperatury i wilgotności względnej.
Następnie należy zebrać cząstki przez port pobierania próbek powietrza na górze laserowego licznika cząstek i użyć modułów testowych wewnątrz próbnika do jednoczesnego pomiaru wielkości każdej klasy cząstek co pięć minut. Aby pobrać próbki cząstek stałych za pomocą próbników aerozoli cyklonowych, należy ustawić próbnik aerozoli cyklonowych tak, aby pobierał próbkę o przepływie 323 litrów na minutę przez sześciogodzinny okres zbierania i użyć funkcji automatycznego czyszczenia, aby trzykrotnie umyć wnętrze próbnika sterylną wodą. Następnie umieść próbnik sam na półce lub podłodze i rozpocznij kolekcję.
Pod koniec okresu pobierania wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem, do czasu ich analizy. W celu wychwytywania cząstek stałych przez filtry należy wyposażyć próbnik powietrza o dużej objętości w filtry o wymiarach 20,32 x 25,4 centymetra kwadratowego i ustawić natężenie przepływu próbki na 1 000 litrów na minutę przez odpowiedni okres zbierania. Pod koniec okresu pobierania wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem, do czasu ich analizy.
W celu analizy składu biologicznego próbek pobranych przez filtr, umieść każdy filtr w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów, tak aby próbka była skierowana do wewnątrz, a tył filtra skierowany w stronę ścianki rurki. Dodaj 10 kulek w środkową część każdej probówki w kierunku strony filtra zawierającego próbkę i wiruj probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś ciecz z każdej probówki do nowych 50-mililitrowych probówek i amplifikuj region V1 do V3 rekombinowanego bakteryjnego DNA 16S i region ITS rekombinowanego operonu RNA grzyba za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy zgodnie ze standardowymi protokołami.
W celu pobierania próbek i hodowli bakterii i grzybów unoszących się w powietrzu, należy ustawić międzynarodowy standardowy sześciostopniowy próbnik Andersena na natężenie przepływu 28,3 litra na minutę przez 35-minutowy okres pobierania i umieścić płytkę do hodowli agaru z kazeiną sojową w każdym stopniu próbnika. Pobrać próbki z sześciu etapów za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena, zgodnie z wielkością aerodynamiczną cząstek unoszących się w powietrzu, osadzając cząstki bakteryjne na płytkach hodowlanych w miarę ich zbierania. Hodować płytki do zbierania bakterii unoszących się w powietrzu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin przed zliczeniem jednostek bakterii tworzących kolonie na każdej płytce próbki dla każdego etapu.
Po 48 do 72 godzinach hodowli zbierz bakterie z każdej płytki do dwóch mililitrowych probówek wirówkowych i wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z wielu źródeł zgodnie ze standardowymi protokołami. W tej reprezentatywnej próbce z gospodarstwa mlecznego stężenie cząstek aerozolu było najwyższe w grudniu, a najniższe w październiku, prawdopodobnie z powodu zmian temperatury i wilgotności. Stężenie wdychanych cząstek aerozolu, które mogły dotrzeć do głębokich dróg oddechowych, stanowiło ponad 99% całkowitego stężenia cząstek, powodując poważne potencjalne zagrożenia dla ludzi i zwierząt.
Analiza próbek bioaerozoli pobranych podczas mglistych dni na terenie kampusu Pekińskiego Instytutu Technologicznego 20 grudnia 2016 r. wskazuje, że próbnik aerozoli cyklonowych zebrał znacznie więcej rodzajów bakterii niż próbnik powietrza o dużej objętości z filtrami. Oba próbniki wykazały jednak równą skuteczność zbierania i prawie taką samą liczbę liczebności rodzajów do zbierania grzybów. Jak pokazano na tym rysunku, sześciostopniowy próbnik Andersena może być używany do zbierania różnych typów bakterii hodowlanych w powietrzu obecnych w różnych środowiskach, takich jak cztery różne typy chlewni oceniane w tym badaniu.
Późniejsza hodowla próbek unoszących się w powietrzu ujawniła, że zawartość różnych dominujących rodzajów bakterii różniła się w różnych obiektach. Istnieje wiele czynników, takich jak temperatura, wilgotność, stężenie bioaerozolu i warunki środowiskowe, które należy wziąć pod uwagę przy określaniu rodzaju metody pobierania próbek aerozolu. Metagenomika może być również wykorzystywana do pozyskiwania informacji genetycznej jako całości bez konieczności wyodrębniania poszczególnych organizmów.
Nasze protokoły i wyniki mogą pomóc innym badaczom na całym świecie w dalszym badaniu wpływu bioaerozoli grzybowych i bakteryjnych na zdrowie w różnych warunkach środowiskowych.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje skład biologiczny środowiskowego pyłu zawieszonego oraz jego wpływ na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób. Z wykorzystaniem różnych metod pobierania próbek bioaerozoli, w pracy zbadano powietrzne społeczności drobnoustrojów w różnych warunkach środowiskowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nauki o środowisku
- Mikrobiologia
- Zdrowie publiczne
Wstęp
- Środowiskowy pył zawieszony może mieć znaczący wpływ na zdrowie.
- Bioaerozole obejmują drobnoustroje przenoszone drogą powietrzną, które mogą wpływać na rozprzestrzenianie się chorób.
- Zrozumienie ich składu jest kluczowe dla monitorowania środowiska.
- Metody pobierania próbek mogą się różnić w zależności od warunków środowiskowych.
Cel badania
- Analiza mikrobiologicznych społeczności obecnych w powietrzu.
- Ocena skuteczności różnych metod pobierania próbek bioaerozoli.
- Badanie wpływu bioaerozoli na zdrowie w zmiennych warunkach.
Zastosowane metody
- Laserowy licznik cząstek w powietrzu do pomiaru całkowitej liczby cząstek.
- Cyklonowe próbniki aerozoli do zbierania pyłu zawieszonego.
- Próbniki powietrza o dużej wydajności z filtrami do analizy składu biologicznego.
- Sześciostopniowy próbnik Andersena do badania zdolności hodowlanych bakterii i grzybów przenoszonych drogą powietrzną.
Główne wyniki
- Stężenie cząsteczek aerozolu różniło się w zależności od miesiąca.
- Próbniki cyklonowe zebrały więcej rodzajów bakterii niż próbniki wysokoprzepływowe.
- Oba typy próbników wykazały podobną wydajność w pobieraniu grzybów.
- Czynniki środowiskowe wpływały na wyniki pobierania próbek aerozolu.
Wnioski
- Różne metody pobierania próbek dają zróżnicowane wyniki w odniesieniu do społeczności mikrobiologicznych.
- Warunki środowiskowe mają istotny wpływ na stężenia aerozoli.
- Wyniki mogą pomóc w zrozumieniu wpływu bioaerozoli na zdrowie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie składu bioaerozoli wspiera ocenę ryzyka dla zdrowia środowiskowego oraz nadzór nad patogenami w kontekście zdrowia publicznego i medycyny pracy. Niniejszy protokół umożliwia porównawczą ocenę metod pobierania próbek w zmiennych warunkach środowiskowych, co pozwala na dobór metody zapewniającej odtwarzalne wyniki mikrobiologicznych analiz powietrza. Przyczynia się to do mechanistycznej redukcji ryzyka we wczesnej fazie odkryć poprzez wyjaśnienie zmienności bioaerozoli, która może wpływać na modele toksykologiczne lub modele chorób zakaźnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie różnorodności mikrobiologicznej w próbkach środowiskowych w celu wsparcia formułowania hipotez dotyczących ekspozycji na patogeny przenoszone drogą powietrzną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane procedury pobierania próbek mikroorganizmów hodowlanych i niehodowlanych przy użyciu różnych próbników.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie próbek do dalszych analiz molekularnych, takich jak sekwencjonowanie 16S rDNA i ITS.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testu poprzez zdefiniowane szybkości przepływu, czasy pobierania oraz warunki przechowywania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Oferuje istotne w kontekście chorób układy do badania modeli ekspozycji wziewnej oraz odpowiedzi odpornościowych błony śluzowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne monitorowanie dynamiki bioaerozoli w środowiskach kontrolowanych lub terenowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w przepływy pracy biologii odkrywczej, dostarczając scharakteryzowane materiały biologiczne do późniejszego przesiewania lub walidacji modelu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu mikroorganizmów przenoszonych drogą powietrzną na stres komórkowy lub szlaki zapalne.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane ekstrakty z pyłu zawieszonego, odpowiednie do testów cytotoksyczności lub aktywacji immunologicznej.
- Analityka: Generuje ilościowe dane o liczebności drobnoustrojów za pomocą sekwencjonowania i liczenia CFU w celu porównawczej analizy warunków.
- Badania translacyjne: Łączy pobieranie próbek środowiskowych z modelami przedklinicznymi ekspozycji oddechowej lub systemowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku system pobierania próbek i analizy, możliwy do zastosowania w różnych lokalizacjach i porach roku.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez rejestrowanie zarówno sygnatur hodowlanych, jak i molekularnych drobnoustrojów przenoszonych drogą powietrzną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanej kalibracji próbnika, kontroli przepływu i ślepej obsłudze próbek.
- Wartość strategiczna: Redukuje niepewność biologiczną w modelach ryzyka środowiskowego, wspierając decyzje typu go/no-go w walidacji celów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków lub modeli z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o potencjał ekspozycji na bioaerozole.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy eksperckiej z zakresu aerobiologii, mikrobiologii molekularnej oraz pobierania próbek środowiskowych.
- Zależne od dostępu do liczników cząstek, próbników aerozoli, chłodni oraz infrastruktury do PCR i sekwencjonowania.
- Wymaga koordynacji międzyzespołowej w zakresie czasu pobierania próbek, metadanych środowiskowych i kontroli zanieczyszczeń.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji wydajności próbnika w zależności od temperatury, wilgotności i obciążenia cząstkami.
- Ograniczone przez metody zależne od hodowli, które obejmują <1% całkowitej różnorodności mikrobiologicznej, co wymusza zastosowanie uzupełniających metod molekularnych.
