Diagnostyka choroby Hirschsprunga na podstawie biopsji odbytniczej z barwieniem immunologicznym w kierunku kalretyniny, białka S100 i produktu genu białka 9.5

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania w diagnostyce choroby Hirschsprunga. Metoda i funkcje tej techniki, jeśli przestrzegasz protokołu, wykazują wysoką czułość i wskaźniki swoistości, które przetwarzają w tym samym czasie. Procedurę zademonstruje Mijing Fang, technik z mojego laboratorium.

Zacznij od utrwalenia biopsji ssącej doodbytnicy w pięciokrotnie większej objętości tkanki w 4% paraformaldehydzie przez sześć godzin w temperaturze pokojowej. Odwodnić utrwalone tkanki w patologicznym odwadniaczu tkanek przez 11 godzin i zanurzyć przetworzone tkanki z biopsji ssania odbytnicy w blokach parafinowych. Przytnij bloki na mikrotomie, aż odsłonięta zostanie cała płaszczyzna przekroju tkanki.

Następnie za pomocą mikrotomu uzyskaj skrawki osadzonej tkanki o grubości 0,4 mikrometra. Umieść w wodzie o temperaturze od 45 do 50 stopni Celsjusza, aby sekcje mogły rozłożyć się na płaskim planie. Przełóż spłaszczone sekcje na szklane szkiełka i piecz je w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu godzin.

Umieść odparafinowane szkiełka w dwóch 15-minutowych przemianach ksylenu, a następnie ich uwodnienie w sekwencyjnych pięciominutowych zanurzeniach w etanolu. Następnie płucz szkiełka w oczyszczonej wodzie z odwróconej osmozy przez dodatkowe pięć minut. W celu pobrania antygenu umieść szkiełka w słoiku do barwienia Coplin z roztworem do pobierania i umieść słoik w podgrzanej kąpieli z wrzącą wodą.

Po 20 minutach pozostaw słoik do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez około 10 minut i delikatnie spłucz szkiełka PBS. Następnie użyj markera hydrofobowego, aby otoczyć każdą sekcję tkanki i umieść szkiełka w mokrym pudełku. Aby zablokować wszelkie nadtlenki, dodaj dwie lub trzy krople 3% roztworu nadtlenku wodoru na każdą tkankę i umieść szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut.

Pod koniec inkubacji przepłukać szkiełka trzema pięciominutowymi płukaniami PBS, a następnie zablokować 5% albuminą surowicy bydlęcej przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć nadmiar albuminy surowicy bydlęcej i oznacz komórki 50 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka spłucz szkiełka trzema trzyminutowymi płukaniami w PBS i dodaj 50 mikrolitrów wzmacniacza polimerowego do każdego szkiełka.

Po 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza umyj szkiełka trzykrotnie w PBS i dodaj 50 mikrolitrów wtórnego przeciwciała B do każdego odcinka tkanki. Po 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza spłucz sekcje trzema pięciominutowymi płukaniami w PBS i dodaj kroplę świeżo przygotowanego roztworu roboczego DAB do każdego szkiełka. Gdy odpowiedni poziom brązowego zabarwienia zostanie wykryty za pomocą mikroskopii świetlnej, należy płukać szkiełka w PBS przez pięć minut i przeciwdziałać barwieniu jąder jedną kroplą hematoksyliny przez jedną minutę.

Usuń nadmiar plamy pod strużką wody przez około 30 do 40 sekund, a następnie umyj ją przez 25 do 30 sekund w świeżym PBS. Różnicować tkanki w 1% etanolu kwasu solnego przez 10 sekund, a następnie przemyć PBS przez jedną minutę. Odwodnić szkiełka za pomocą pięciominutowych zanurzeń w kolejności odwrotnej do nawodnienia i wystawić szkiełka na dwie pięciominutowe zmiany ksylenu.

Następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą ultra czystego mocowania i pozwól szkiełkom wyschnąć przed ich wizualizacją pod mikroskopem świetlnym. W tym reprezentatywnym badaniu z udziałem 318 pacjentów z biopsją wycięcia odbytnicy, 99 pacjentów wstępnie zdiagnozowano na podstawie biopsji odcinka odbytnicy. Wiele komórek zwojowych, które wyrażają kalretyninę, zaobserwowano w normalnych biopsjach tkanek.

Nie wykryto jednak komórek zwojowych w żadnym obszarze tkanki z segmentów choroby Hirschsprunga. Barwienie immunologiczne S-100 i PGP9.5 ujawniło przerośnięte pnie nerwowe w błonie podśluzowej chorej tkanki, a w normalnie unerwionym jelicie zaobserwowano jedynie ziarniste zabarwienie niektórych małych gałązek nerwowych. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zwróceniu uwagi na takie szczegóły, jak wielkość biopsji ssącej doodbytnicy i grubość odcinków.

Po defragmentacji technika ta utoruje drogę do badań w dziedzinie chirurgii dziecięcej, które pomogą w rozpoznaniu choroby Hirschsprunga.