Oznaczanie na obecność nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

Nieorganiczny polifosforan jest kluczowym elementem w odpowiedzi bakterii na stres. Jednak starsze metody ekstrakcji i pomiaru poliP w bakteriach są złożone i pracochłonne. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia szybką, czułą i niedrogą ocenę ilościową poziomów poliP w wielu różnych gatunkach bakterii.

Procedura zostanie zademonstrowana przez Aryę Pokhrel, studentkę studiów licencjackich z mojego laboratorium. Na początek hoduj bakterie Lactobacillus reuteri w pożywce do indukcji enzymów jabłkowych bez cystyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc bez wstrząsania. Odwiruj jeden mililitr tej nocnej kultury w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej, aby zebrać wystarczającą liczbę komórek, aby uzyskać łącznie od 50 do 100 mikrogramów białka komórkowego.

Całkowicie usunąć supernatant z osadu komórkowego, a następnie dodać 250 mikrolitrów buforu do lizy GITC i ponownie zawiesić przez wirowanie. Inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby zmylić komórki. Przechowuj lizat w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Najpierw przygotuj wzorce BSA zawierające zero, 1, 2 i 4 miligramy na mililitr BSA w buforze do lizy GITC. Podwielokrotność pięciu mikrolitrów rozmrożonych, dobrze wymieszanych lizatów komórkowych i pięć mikrolitrów wzorców BSA w celu oddzielenia studzienek na przezroczystej płytce 96-dołkowej. Dodaj 195 mikrolitrów odczynnika Bradford do każdej studzienki i zmierz absorbancję przy 595 nanometrach w czytniku płytek.

Obliczyć ilość białka w każdym dołku przez porównanie ze standardową krzywą BSA, jak opisano w manuskrypcie. Aby określić całkowitą ilość białka w każdej próbce, pomnóż otrzymaną wartość przez 05. Aby rozpocząć ekstrakcję polifosforanów, dodaj 250 mikrolitrów 95% etanolu do każdej próbki poddanej lizie GITC i zwiruj do wymieszania.

Odpipetować tę mieszaninę do kolumny wirowej z membraną krzemionkową umieszczonej w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować przy 16, 100 g przez 30 sekund. Odrzuć przepływ i dodaj 750 mikrolitrów mieszaniny trischlorowodorku, chlorku sodu, EDTA i etanolu.

Wirować przy 16, 100 g przez 30 sekund. Odrzucić przepływ i odwirować kolumnę wirową przy 16, 100 g przez dwie minuty. Umieść kolumnę w czystej 1.5 mililitrowej probówce do mikrofuge.

Dodaj 150 mikrolitrów 8-trichlorowodorku o pH 50 milimolowym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Eluować poliP przez odwirowanie w stężeniu 8 000 g przez dwie minuty. Zacznij od przygotowania wzorców zawierających zero, pięć, 50 lub 200 mikromolowych fosforanów potasu w 50 milimolowym pH ośmiokrotnego chlorowodorku tris.

Podwielokrotność 100 mikrolitrów każdego wzorca fosforanowego i 100 mikrolitrów wyekstrahowanych próbek poliP do oddzielnych studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą, na próbkę, 30 mikrolitrów buforu reakcyjnego 5X ScPPX, 19 mikrolitrów wody i jeden mikrolitr oczyszczonego ScPPX. Dodać 50 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.

I inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W dniu wykrycia należy przygotować świeży zapas roboczy roztworu detekcyjnego, mieszając 9,12 mililitra roztworu detekcyjnego z 88 mililitrami jednego molowego kwasu askorbinowego i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej przed użyciem. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu detekcyjnego do każdej próbki i wzorców na płytce 96-dołkowej.

Aby umożliwić rozwój koloru, inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez około dwie minuty. Za pomocą czytnika płytek zmierz absorbancję przy 882 nanometrach i oblicz stężenie fosforanów w każdej próbce przez porównanie z krzywą wzorcową fosforanu potasu. Następnie przelicz stężenia fosforanów na nanomole fosforanu pochodzącego z poliP w każdym lizacie komórkowym i znormalizuj zawartość poliP w komórkach do całkowitego białka komórkowego, jak opisano w manuskrypcie.

Dzika E. coli, bakteria Gram-ujemna, wyhodowana w LB, nie wytwarzała polipów. Ale podczas uprawy w MOPS wytworzył około 192 nanomoli poliP na miligram całkowitego białka. Mutant E.coli delta ppk, który nie ma kinazy poliP, nie wytwarzał poliP w żadnym z pożywek.

Mutant delta ppx, który nie ma egzopolifosfatazy, wytwarzał w przybliżeniu taką samą ilość poliP jak typ dziki. A mutant delta phoB, który jest wadliwy w transporcie fosforanów, wytwarzał znacznie mniej poliP niż typ dziki. L.reuteri typu dzikiego, bakteria Gram-dodatnia wyhodowana przez noc na pożywce MEIC, zgromadziła około 51 nanomoli poliP na miligram białka całkowitego.

Mutant zerowy L.reuteri ppk1 pozbawiony kinazy poliP zawierał mniej niż połowę tej ilości. Ta obecność poliP w mutancie zerowym ppk1 jest prawdopodobnie spowodowana tym, że L.reuteri zawiera drugą kinazę poliP. Mycobacterium smegmatis szczep SMR pięć, wyhodowany na pożywce Hartmans-de Bont przy braku etanolu, zgromadził około 141 nanomoli poliP na miligram białka całkowitego.

Podczas gdy obróbka etanolem spowodowała trzykrotny wzrost. Po tej procedurze można przeprowadzić elektroforezę w żelu akrylowym w celu oceny różnic w długości łańcucha poliP. Próbując wykonać tę procedurę, unikaj typowych błędów.

Pamiętaj, aby unikać powstawania pęcherzyków w studzienkach na płytkach do mikromiareczkowania i zachować ostrożność, aby przenieść próbki do odpowiedniej probówki podczas przełączania z kolumny na probówkę do mikrofuge. Nie zapominaj, że praca z GITC i silnymi kwasami może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić odpowiedni sprzęt ochronny.