Name: Oznaczanie na obecność nieorganicznego polifosforanu w bakteriach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj szybką metodę oznaczania nieorganicznego polifosforanu w bakteriach Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. Technika ta jest czuła, tania i znacznie prostsza niż tradycyjne podejścia laboratoryjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez fundusze startowe University of Alabama at Birmingham Department of Microbiology oraz R35GM124590 grantów NIH (dla MJG) i grantów NIH R01AI121364 (dla FW).

1. Oczyszczająca egzopolifosfataza drożdżowa (ScPPX)
<ol>
	<li>Przekształć szczep nadekspresji białka E. coli BL21(DE3)31 za pomocą plazmidu pScPPX26 przez elektroporację32 lub przemianę chemiczną33.</li>
	<li>Zaszczepić 1 l bulionu lizogennego (LB) zawierającego 100 μg mL-1 ampicyliny w 2 l kolbie bez przegrody pojedynczą kolonią BL21(DE3) zawierającą pScPPX2 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania, do absorbancji przy 600 nm (A600) wynoszącej około 0,3, mierzonej w spektrofotometrze.</li>
	<li>Rozpocznij wytrząsanie kultury (180 obr./min) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C, w tym czasie komórki osiągną poziom A600 wynoszący 0,4 - 0,5.</li>
	<li>Dodać β-D-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM i dodatkowe 100 μg mL-1 ampicyliny, następnie inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 180 obr./min. 
	UWAGA: Ten protokół nadekspresji generuje dużą ilość rozpuszczalnego ScPPX. Jednak nadekspresja ScPPX jest bardzo wyrozumiała, a do skutecznego oczyszczenia ScPPX zastosowano wiele innych popularnych protokołów nadekspresji białek.</li>
	<li>Przenieść komórki do 1 litrowej butelki wirówkowej i zebrać je przez odwirowanie przez 20 minut w temperaturze 5000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i przenieść osad komórkowy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Granulki komórkowe można przechowywać w nieskończoność w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozmrozić granulki na lodzie, a następnie ponownie zawiesić je w 9 ml 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl i 5 mM imidazolu (pH 8) do całkowitej objętości około 10 ml.</li>
	<li>Dodać (stężenia końcowe) 1 mg lizozymu mL-1, 2 mM MgCl2 i 50 jednostek mL-1 endonukleazy rozkładającej RNA i DNA (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 30 minut na lodzie. 
	UWAGA: ScPPX wiąże kwasy nukleinowe (dane nie pokazane), więc obróbka nukleazą jest niezbędna podczas oczyszczania.</li>
	<li>Za pomocą sonikatora z mikrokońcówką (patrz Tabela Materiałów), zjonizuj komórki przez 2 cykle sonikacji na lodzie przy 50% mocy, pulsując 5 s włączając i 5 s wyłączając, z 2-minutową przerwą między cyklami. 
	UWAGA: Podczas sonikacji należy stosować odpowiednią ochronę słuchu. Podobnie jak w przypadku nadekspresji, do oczyszczania ScPPX dopuszczalne są różne metody lizy komórek.</li>
	<li>Usunąć nierozpuszczalne zanieczyszczenia przez odwirowanie lizatu przez 20 minut w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Przefiltrować otrzymany supernatant (około 10 ml) przez filtr strzykawkowy z octanu celulozy o wielkości porów 0,8 μm.</li>
	<li>Załadować lizat do naładowanej niklem kolumny chelatującej o pojemności 5 ml (patrz tabela materiałów) za pomocą pompy perystaltycznej lub dużej strzykawki.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 50 ml 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazolu (pH 8).</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 50 ml 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazolu (pH 8).</li>
	<li>Elute ScPPX za pomocą 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl i 0,5 M imidazolu (pH 8), zbierając 15 frakcji 1-ml. Przetestuj te frakcje elucyjne pod kątem zawartości białka za pomocą testu białkowego Bradforda34 (patrz Tabela materiałów) i uruchom SDS-PAGE gel35, aby potwierdzić, które frakcje zawierają oczyszczony ScPPX (masa cząsteczkowa = 45 kDa).</li>
	<li>Połączyć frakcje zawierające czysty ScPPX i dostosować stężenie połączonego białka do około 2 mg mL-1 z 50 mM HEPES i 0,5 M NaCl. W następnym kroku mogą wytrącić się wyższe stężenia białka.</li>
	<li>Oczyszczony ScPPX należy wymienić na bufor magazynowy (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM KCl, 10% [v/v] glicerolu) przez dializę. Umieścić zebrane frakcje ScPPX w szczelnie zamkniętych rurkach membranowych do dializy o masie cząsteczkowej 12 000 - 14 000 Da (patrz tabela materiałów) i zawiesić w 1 l buforu do przechowywania, ciągle mieszając w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny. Powtórz ten krok z nowym buforem magazynu, aby uzyskać łącznie 3 zmiany bufora.</li>
	<li>Przenieść oczyszczone, zdializowane białko do probówki lub probówek wirówkowych i wirować przez 20 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich nierozpuszczalnych agregatów. Ostrożnie przenieść supernatant do czystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dostosować stężenie oczyszczonego ScPPX do 1 mg mL-1 z buforem do przechowywania, dodać 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej wolnej od proteazy (BSA; stężenie końcowe) i przechowywać przez okres do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: ScPPX traci ponad 90% swojej aktywności, gdy jest zamrożony13.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek do ekstrakcji polifosforanu
<ol>
	<li>Hoduj bakterie w warunkach interesujących Cię do określenia zawartości poliP. W tym protokole hoduj Lactobacillus reuteri36 przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania w pożywce do indukcji enzymów jabłkowych (MEI) class37 bez cysteiny (MEI-C).</li>
	<li>Zbierz wystarczającą ilość komórek przez odwirowanie w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać łącznie 50 – 100 μg białka komórkowego (patrz krok 3 poniżej). W przypadku E. coli jest to 1 ml kultury w fazie logarytmicznej w A600 0,2 - 0,4. W przypadku L. reuteri jest to 1 ml kultury przeprowadzonej przez noc. Dostosuj w razie potrzeby dla innych interesujących gatunków.</li>
	<li>Całkowicie usunąć supernatant z osadów komórkowych.</li>
	<li>Zawiesić osady komórkowe w 250 μl buforu do lizy GITC (4 M izotiocyjanian guanidyny, 50 mM Tris-HCl, pH 7) i poddać lizie przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Bądź konsekwentny w czasie lizy, ponieważ przedłużona inkubacja w wysokiej temperaturze może spowodować degradację poliP przez hydrolizę38. Lizaty można przechowywać w nieskończoność w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Izotiocyjanian guanidyny jest solą chaotropową i należy obchodzić się z nią w rękawiczkach i utylizować jako odpady niebezpieczne.</li>
</ol>
3. Pomiar zawartości białka w lizatach komórkowych
<ol>
	<li>Przygotować wzorce BSA zawierające 0, 0,1, 0,2 i 0,4 mg mL-1 BSA w buforze do lizy GITC. 
	UWAGA: Ważne jest, aby standardy BSA były stosowane w GITC, ponieważ GITC wpływa na rozwój koloru testu Bradforda. Wzorce BSA mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Podwielokrotność 5 μl rozmrożonych, dobrze wymieszanych lizatów komórkowych i wzorców BSA do oddzielenia studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Dodać 195 μl odczynnika Bradford34 do każdej studzienki i zmierzyć absorbancję przy 595 nm (A595) w czytniku płytek (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Obliczyć ilość białka w każdym basenie przez porównanie z krzywą wzorcową BSA, korzystając ze wzoru y = mx + b, gdzie y wynosi A595, x jest μg BSA, m jest nachyleniem krzywej wzorcowej, a b jest punktem przecięcia y krzywej standardowej. Pomnóż otrzymaną wartość przez 0,05, aby określić całkowitą ilość mg białka w każdej próbce.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja polifosforanu
<ol>
	<li>Dodaj 250 μl 95% etanolu do każdej próbki poddanej lizie GITC i wymieszaj.</li>
	<li>Nałożyć tę mieszaninę na kolumnę wirową z membraną krzemionkową i wirować przez 30 s przy 16 100 x g.</li>
	<li>Odrzuć przepływ, a następnie dodaj 750 μl 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% etanolu i wiruj przez 30 s przy 16 100 x g.</li>
	<li>Odrzucić przepływowy i odwirowywać przez 2 minuty przy 16 100 x g.</li>
	<li>Umieść kolumnę w czystej probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i dodaj 150 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie eluować poliP przez wirowanie przez 2 minuty przy 8 000 x g. 
	UWAGA: W razie potrzeby eluaty można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 tydzień.</li>
</ol>
5. Trawienie polifosforanu
<ol>
	<li>Przygotować wzorce zawierające 0, 5, 50 lub 200 μM fosforanu potasu w 50 mM Tris-HCl (pH 8). 
	UWAGA: Wzorce fosforanu potasu można przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podwielokrotność 100 μl każdego wzorca fosforanowego i wyekstrahowanych próbek poliP do oddzielnych studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą (na próbkę): 30 μL 5x buforu reakcyjnego ScPPX (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM octanu amonu, pH 7,5)13, 19 μLH2Oi 1 μL oczyszczonego ScPPX (1 mg mL-1).</li>
	<li>Dodać 50 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: W razie potrzeby strawione próbki poliP mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony.</li>
</ol>
6. Wykrywanie wolnego fosforanu24
<ol>
	<li>Przygotować bazę roztworu detekcyjnego, rozpuszczając 0,185 g winianu antymonu i potasu w 200 ml wody, dodając 150 ml 4 N H2SO4, a następnie dodając 1,49 g heptamolibdenianu amonu. Mieszać do rozpuszczenia, a następnie doprowadzić do końcowej objętości 456 ml. Przefiltrować roztwór w celu usunięcia cząstek stałych i przechowywać w temperaturze 4 °C przed światłem przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 1 M kwasu askorbinowego. Przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Każdego dnia należy przygotować świeży zapas roboczy roztworu detekcyjnego, mieszając 9,12 ml zasady roztworu detekcyjnego z 0,88 ml 1 M kwasu askorbinowego. Przed użyciem odczekać, aż roztwór detekcyjne osiągnie temperaturę pokojową.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu detekcyjnego do każdej próbki i wzorca na 96-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze pokojowej przez około 2 minuty, aby umożliwić uzyskanie koloru.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 882 nm za pomocą czytnika płytek i obliczyć stężenie fosforanów w każdej próbce przez porównanie z krzywą wzorcową fosforanu potasu. 
	UWAGA: Roztwór detekcyjne zawiera toksyczne sole i silne kwasy. Nosić rękawice i traktować nadmiar roztworu jako odpad toksyczny.</li>
</ol>
7. Obliczanie zawartości polifosforanu w komórkach
<ol>
	<li>Przeliczyć stężenia fosforanów oznaczone w kroku 6.5 na nanomole fosforanu pochodzącego z poliP w każdym lizacie całej komórki zgodnie z następującym wzorem: 
	nmol polyP = 1,5 x (μM fosforan / 10) 
	UWAGA: Metoda oparta na krzywej wzorcowej w kroku 6 określa stężenie fosforanu (w μM) w każdej próbce poliP o objętości 100 μl podanej w kroku 5.2. Aby przeliczyć to stężenie na liczbę nmol, 100 μl dzieli się przez 106, aby uzyskać objętość w L, pomnożoną przez stężenie (μmol L-1), a następnie pomnożoną przez 1,000 (liczba nmol w μmol). Sprowadza się to do podzielenia stężenia przez 10. Całkowita objętość ekstraktu przygotowanego w kroku 4 wynosi 150 μl, dlatego konieczne jest pomnożenie otrzymanej wartości przez 1,5, aby obliczyć nmol fosforanu obecnego w całym ekstrakcie.</li>
	<li>Znormalizuj zawartość poliP komórkowego do całkowitego białka komórkowego, dzieląc poliP nmol przez mg białka całkowitego w każdej próbce oznaczonej w kroku 3.4. Poziomy poliP są wyrażane w postaci stężenia poszczególnych wolnych fosforanów pochodzących z poliP. 
	UWAGA: W niektórych przypadkach ilość fosforanu pochodzącego z poliP obecna w próbce może wykraczać poza zakres liniowy krzywej wzorcowej fosforanu (krok 6.5). Jeżeli poziomy poliP są bardzo wysokie, nadmiar eluatu zawierającego poliP z kroku 4.6 można rozcieńczyć w stosunku 1:10 lub 1:100, w zależności od potrzeb, a następnie ponownie zmierzyć, jak opisano w krokach od 5 do 7.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół upraszcza i przyspiesza kwantyfikację poziomów poliP u różnych bakterii, przy czym typowy zestaw 24 próbek zajmuje około 1,5 godziny do pełnego przetworzenia. Pozwala to na szybkie badania przesiewowe próbek i analizę bibliotek mutantów oraz upraszcza eksperymenty kinetyczne mierzące akumulację poliP w czasie. Wykazaliśmy, że protokół działa skutecznie na przedstawicielach trzech różnych typów: proteobakterii, firmicutes i promieniowców, które są znane ze swoich odpornych, trudnych do lizy ścian ko...

Polifosforan nieorganiczny (poliP) to liniowy biopolimer jednostek fosforanowych połączonych z bezwodnikiem fosfobezwodnikowym, który występuje we wszystkich dziedzinach życia1,2,3. W przypadku różnych bakterii poliP jest niezbędny do odpowiedzi na stres, ruchliwości, tworzenia biofilmu, kontroli cyklu komórkowego, oporności na antybiotyki i zjadliwości4,5,6,7,8,9,10,11. Badania nad metabolizmem poliP u bakterii mogą zatem dostarczyć fundamentalnych informacji na temat zdolności bakterii do wywoływania chorób i rozwoju w różnych środowiskach. Jednak w wielu przypadkach dostępne metody ilościowego oznaczania poliP w komórkach bakteryjnych są czynnikiem ograniczającym w tych badaniach.
Obecnie stosuje się kilka metod pomiaru poziomów poliP w materiałach biologicznych. Metody te zazwyczaj obejmują dwa odrębne etapy: ekstrakcję poliP i ilościowe określenie poliP obecnego w tych ekstraktach. Obecna metoda złotego standardu, opracowana dla drożdży Saccharomyces cerevisiae przez Bru i współpracowników12, ekstrahuje poliP wraz z DNA i RNA przy użyciu fenolu i chloroformu, a następnie wytrąca etanol, traktuje deoksyrybonukleazą (DNazę) i rybonukleazą (RNazę) oraz trawi powstały oczyszczony poliP za pomocą egzopolifosfatazy enzymu rozkładającego poliP S. cerevisiae (ScPPX)13 w celu uzyskania wolnego fosforanu, który jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego na bazie zieleni malachitowej. Procedura ta jest wysoce ilościowa, ale pracochłonna, ogranicza liczbę próbek, które można przetworzyć w jednym eksperymencie, i nie jest zoptymalizowana pod kątem próbek bakteryjnych. Inni donosili o ekstrakcji poliP z różnych komórek i tkanek za pomocą kulek krzemionkowych ("glassmilk") lub kolumn membrany krzemionkowej6,14,15,16,17,18. Metody te nie są w stanie skutecznie wyodrębnić krótkołańcuchowego polyP (mniej niż 60 jednostek fosforanowych)12,14,15, chociaż jest to mniej niepokojące dla bakterii, które ogólnie uważa się za syntetyzujące głównie długołańcuchowe poliP3. Starsze metody ekstrakcji poliP przy użyciu mocnych kwasów19,20 nie są już powszechnie stosowane, ponieważ poliP jest niestabilny w środowisku kwaśnym12.
Istnieją również różne metody ilościowego oznaczania poliP. Jednym z najczęstszych jest 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI), barwnik fluorescencyjny częściej stosowany do barwienia DNA. Kompleksy DAPI-polyP mają inne maksima wzbudzenia i emisji fluorescencji niż kompleksy DAPI-DNA21,22, ale występuje znaczna interferencja ze strony innych składników komórkowych, w tym RNA, nukleotydów i fosforanów inozytolu12,15,16,23, zmniejszając swoistość i czułość pomiarów poliP wykonanych tą metodą. Alternatywnie, poliP i difosforan adenozyny (ADP) można przekształcić w trifosforan adenozyny (ATP) za pomocą oczyszczonej kinazy poliP Escherichia coli (PPK), a otrzymany ATP określić ilościowo za pomocą lucyferazy14,17,18. Pozwala to na wykrycie bardzo małych ilości poliP, ale wymaga dwóch etapów reakcji enzymatycznej oraz zarówno lucyferyny, jak i bardzo czystego ADP, które są drogimi odczynnikami. ScPPX specyficznie trawi poliP do wolnego fosforanu6,12,13,24, który można wykryć za pomocą prostszych metod, ale ScPPX jest hamowany przez DNA i RNA12, co wymaga traktowania ekstraktów zawierających poliP za pomocą DNazy i RNazy. Ani PPK, ani ScPPX nie są dostępne na rynku, a oczyszczanie PPK jest stosunkowo złożone25,26.
PoliP w lizatach komórkowych lub ekstraktach komórkowych można również wizualizować na żelach poliakrylamidowych za pomocą negatywnego barwienia DAPI27,28,29,30, metoda, która pozwala na ocenę długości łańcucha, ale jest mało przepustowa i słabo ilościowa.
Teraz informujemy o szybkim, niedrogim, średnioprzepustowym teście poliP, który pozwala na szybką kwantyfikację poziomów poliP u różnych gatunków bakterii. Metoda ta rozpoczyna się od lizy komórek bakteryjnych w temperaturze 95 °C w 4 M izotiocyjanianu guanidyny (GITC)14 w celu inaktywacji fosfataz komórkowych, a następnie ekstrakcji kolumną z membraną krzemionkową zoptymalizowanej pod kątem szybkiego przetwarzania wielu próbek. Powstały ekstrakt zawierający poliP jest następnie trawiony z dużym nadmiarem ScPPX, eliminując potrzebę leczenia DNazą i RNazą. Dołączamy protokół prostego oczyszczania powinowactwa do niklu z mg ilości ScPPX. Wreszcie, wolny fosforan pochodzący z poliP jest oznaczany ilościowo za pomocą prostego, czułego, kolorymetrycznego testu kolorymetrycznego na bazie kwasu askorbinowego24 i normalizowany do całkowitego białka komórkowego. Ta metoda usprawnia pomiar poliP w komórkach bakteryjnych i demonstrujemy jej zastosowanie z reprezentatywnymi gatunkami bakterii Gram-ujemnych, bakterii Gram-dodatnich i prątków.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Millipore Sigma</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pScPPX2</td><td>Addgene</td><td>112877</td><td>dostępny dla instytucji akademickich i innych instytucji non-profit</td></tr><tr><td>Bulion LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-2</td><td>E. coli podłoże wzrostowe</td></tr><tr><td>ampicylina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176025</td><td></td></tr><tr><td>izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-400-1</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250500</td><td>do regulacji pH roztworów buforowanych przez HEPES</td></tr><tr><td>chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Fisher Naukowy</td><td>O3196500</td><td></td></tr><tr><td>lizozymu</td><td>Fisher Scientific AAJ6070106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Universal Nuclease</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88700</td><td>Benzonaza (Sigma-Aldrich kat. # E1014) jest dopuszczalnym substytutem</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-120</td><td>inne metody lizy komórek (np. French Press) mogą być również skuteczne</td></tr>: <tr><td>5 ml kolumny chelatującej HP</td><td>HiTrap GE Life Sciences</td><td>17040901</td><td>dowolnej kolumnie chromatograficznej lub żywicy o powinowactwie niklu można zastąpić</td></tr><tr><td>sześciowodnym siarczanem niklu(II)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC415611000</td><td>do ładowania kolumny HiTrap</td></tr><tr><td>0,8 i mikro; m Wielkość porów Filtry strzykawkowe z octanu celulozy</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-302-168</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum&nbsp; Spectra/Por 4 RC Rurki membranowe do dializy 12 000 do 14 000 dalton MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667B</td><td>inne membrany dializacyjne o MWCO < 30 000 Da powinny również działać</td></tr><tr><td>kwas solny (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>do regulacji pH roztworów buforowanych trisem</td></tr><tr><td>chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217500</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2294</td><td></td></tr><tr><td>10x MOPS średnia mieszanina</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td>E. coli pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td></td><td>glukozy Fisher Scientific</td><td>D161</td><td></td></tr><tr><td>monozasadowy fosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>dwuzasadowy fosforan potasu (K2HPO4)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>suszony ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0</td><td></td></tr><tr><td>trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-50</td><td></td></tr><tr><td>jednowodny siarczan manganu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M113-500</td><td></td></tr><tr><td>guanidyna izotiocyjanian</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP221-250</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (bez proteazy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>przezroczyste 96-dołkowe płytki z płaskim dnem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812-100EA</td><td>każda przezroczysta płytka 96-dołkowa będzie działać</td></tr><tr><td>Tecan M1000 Nieskończony czytnik płytek</td><td>Tecan, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Każdy czytnik płytek zdolny do pomiaru absorbancji przy 595 i 882 nm będzie działał</td></tr> etanol <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>kolumny wirujące z membraną krzemionkową</td><td>Epoch Life Science</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrofuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9580154</td><td></td></tr><tr><td>octan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>winian potasu antymonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1088922</td><td></td></tr><tr><td>4 N kwas siarkowy (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA818-500</td><td></td></tr><tr><td>heptamolibdenian amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1376630</td><td></td></tr><tr><td>kwas askorbinowy</td><td>Fisher AC401471000</td><td></td><td></td> naukowe</tr></tbody></table>

oznaczanie na obecność nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Nieorganiczny polifosforan (poliP) jest biologicznym polimerem występującym w komórkach ze wszystkich dziedzin życia i jest niezbędny do zjadliwości i reakcji na stres u wielu bakterii. Istnieje wiele metod ilościowego oznaczania poliP w materiałach biologicznych, z których wiele jest albo pracochłonnych, albo niewrażliwych, co ogranicza ich użyteczność. Przedstawiamy tutaj uproszczoną metodę oznaczania ilościowego poliP u bakterii, wykorzystującą ekstrakcję kolumną z membraną krzemionkową zoptymalizowaną pod kątem szybkiego przetwarzania wielu próbek, trawienia poliP za pomocą egzopolifosfatazy specyficznej dla poliP ScPPX oraz wykrywania powstałego wolnego fosforanu za pomocą czułego testu kolorymetrycznego na bazie kwasu askorbinowego. Ta procedura jest prosta, niedroga i umożliwia wiarygodną kwantyfikację poliP w różnych gatunkach bakterii. Przedstawiamy reprezentatywną kwantyfikację poliP z bakterii Gram-ujemnej (Escherichia coli), Gram-dodatniej bakterii kwasu mlekowego (Lactobacillus reuteri) i gatunków prątków (Mycobacterium smegmatis). Dołączamy również prosty protokół oczyszczania powinowactwa do niklu z mg ilości ScPPX, który nie jest obecnie dostępny na rynku.

Kluczowe etapy protokołu przedstawiono w formie uproszczonego schematu na Rysunku 1.
Aby zademonstrować zastosowanie tego protokołu w przypadku bakterii Gram-ujemnych, szczep dziki E. coli MG165539 hodowano do środkowej fazy logarytmicznej w bogatym medium LB w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200 rpm), a następnie przemyto i inkubowano przez kolejne 2 h w minimaln...

Opisujemy prostą metodę szybkiego oznaczania ilościowego nieorganicznego polifosforanu w różnych bakteriach, w tym Gram-ujemnych, Gram-dodatnich i mykobakteriach.

Oznaczanie na obecność nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

Nieorganiczny polifosforan jest kluczowym elementem w odpowiedzi bakterii na stres. Jednak starsze metody ekstrakcji i pomiaru poliP w bakteriach są złożone i pracochłonne. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia szybką, czułą i niedrogą ocenę ilościową poziomów poliP w wielu różnych gatunkach bakterii.Procedura zostanie zademonstrowana przez Aryę Pokhrel, studentkę studiów licencjackich z mojego laboratorium. Na początek hoduj bakterie Lactobacillus reuteri w pożywce do indukcji enzymów jabłkowych bez cystyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc bez wstrząsania. Odwiruj jeden mililitr tej nocnej kultury w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej, aby zebrać wystarczającą liczbę komórek, aby uzyskać łącznie od 50 do 100 mikrogramów białka komórkowego.Całkowicie usunąć supernatant z osadu komórkowego, a następnie dodać 250 mikrolitrów buforu do lizy GITC i ponownie zawiesić przez wirowanie. Inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby zmylić komórki. Przechowuj lizat w temperaturze 80 stopni Celsjusza.Najpierw przygotuj wzorce BSA zawierające zero, 1, 2 i 4 miligramy na mililitr BSA w buforze do lizy GITC. Podwielokrotność pięciu mikrolitrów rozmrożonych, dobrze wymieszanych lizatów komórkowych i pięć mikrolitrów wzorców BSA w celu oddzielenia studzienek na przezroczystej płytce 96-dołkowej. Dodaj 195 mikrolitrów odczynnika Bradford do każdej studzienki i zmierz absorbancję przy 595 nanometrach w czytniku płytek.Obliczyć ilość białka w każdym dołku przez porównanie ze standardową krzywą BSA, jak opisano w manuskrypcie. Aby określić całkowitą ilość białka w każdej próbce, pomnóż otrzymaną wartość przez 05. Aby rozpocząć ekstrakcję polifosforanów, dodaj 250 mikrolitrów 95% etanolu do każdej próbki poddanej lizie GITC i zwiruj do wymieszania.Odpipetować tę mieszaninę do kolumny wirowej z membraną krzemionkową umieszczonej w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować przy 16, 100 g przez 30 sekund. Odrzuć przepływ i dodaj 750 mikrolitrów mieszaniny trischlorowodorku, chlorku sodu, EDTA i etanolu.Wirować przy 16, 100 g przez 30 sekund. Odrzucić przepływ i odwirować kolumnę wirową przy 16, 100 g przez dwie minuty. Umieść kolumnę w czystej 1.5 mililitrowej probówce do mikrofuge.Dodaj 150 mikrolitrów 8-trichlorowodorku o pH 50 milimolowym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Eluować poliP przez odwirowanie w stężeniu 8 000 g przez dwie minuty. Zacznij od przygotowania wzorców zawierających zero, pięć, 50 lub 200 mikromolowych fosforanów potasu w 50 milimolowym pH ośmiokrotnego chlorowodorku tris.Podwielokrotność 100 mikrolitrów każdego wzorca fosforanowego i 100 mikrolitrów wyekstrahowanych próbek poliP do oddzielnych studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą, na próbkę, 30 mikrolitrów buforu reakcyjnego 5X ScPPX, 19 mikrolitrów wody i jeden mikrolitr oczyszczonego ScPPX. Dodać 50 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.I inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W dniu wykrycia należy przygotować świeży zapas roboczy roztworu detekcyjnego, mieszając 9,12 mililitra roztworu detekcyjnego z 88 mililitrami jednego molowego kwasu askorbinowego i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej przed użyciem. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu detekcyjnego do każdej próbki i wzorców na płytce 96-dołkowej.Aby umożliwić rozwój koloru, inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez około dwie minuty. Za pomocą czytnika płytek zmierz absorbancję przy 882 nanometrach i oblicz stężenie fosforanów w każdej próbce przez porównanie z krzywą wzorcową fosforanu potasu. Następnie przelicz stężenia fosforanów na nanomole fosforanu pochodzącego z poliP w każdym lizacie komórkowym i znormalizuj zawartość poliP w komórkach do całkowitego białka komórkowego, jak opisano w manuskrypcie.Dzika E. coli, bakteria Gram-ujemna, wyhodowana w LB, nie wytwarzała polipów. Ale podczas uprawy w MOPS wytworzył około 192 nanomoli poliP na miligram całkowitego białka. Mutant E.coli delta ppk, który nie ma kinazy poliP, nie wytwarzał poliP w żadnym z pożywek.Mutant delta ppx, który nie ma egzopolifosfatazy, wytwarzał w przybliżeniu taką samą ilość poliP jak typ dziki. A mutant delta phoB, który jest wadliwy w transporcie fosforanów, wytwarzał znacznie mniej poliP niż typ dziki. L.reuteri typu dzikiego, bakteria Gram-dodatnia wyhodowana przez noc na pożywce MEIC, zgromadziła około 51 nanomoli poliP na miligram białka całkowitego.Mutant zerowy L.reuteri ppk1 pozbawiony kinazy poliP zawierał mniej niż połowę tej ilości. Ta obecność poliP w mutancie zerowym ppk1 jest prawdopodobnie spowodowana tym, że L.reuteri zawiera drugą kinazę poliP. Mycobacterium smegmatis szczep SMR pięć, wyhodowany na pożywce Hartmans-de Bont przy braku etanolu, zgromadził około 141 nanomoli poliP na miligram białka całkowitego.Podczas gdy obróbka etanolem spowodowała trzykrotny wzrost. Po tej procedurze można przeprowadzić elektroforezę w żelu akrylowym w celu oceny różnic w długości łańcucha poliP. Próbując wykonać tę procedurę, unikaj typowych błędów.Pamiętaj, aby unikać powstawania pęcherzyków w studzienkach na płytkach do mikromiareczkowania i zachować ostrożność, aby przenieść próbki do odpowiedniej probówki podczas przełączania z kolumny na probówkę do mikrofuge. Nie zapominaj, że praca z GITC i silnymi kwasami może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić odpowiedni sprzęt ochronny.

assaying-for-inorganic-polyphosphate-in-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustową metodę hydrolizy enzymatycznej, w której wykorzystuje się czytnik mikropłytek do pomiaru i klasyfikacji fosforu glebowego jako monoestrów P, diestrów P oraz fosforu nieorganicznego. W standardowych warunkach laboratoryjnych jednorazowo można zmierzyć do 96 próbek.

Wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych

Pirofosforany inozytolu odgrywają istotną rolę w patologiach ludzkich, takich jak nowotwory, cukrzyca i otyłość; jednak dokładny mechanizm ich działania pozostaje kwestią sporną. Brak komercyjnie dostępnych pirofosforanów inozytolu sprawia, że szczegółowe badania są problematyczne. W niniejszej pracy opisujemy prosty protokół produkcji i izolacji miligramowych ilości pirofosforanów inozytolu.

Przygotowanie wysokiej jakości pirofosforanów inozytolu

Źródło: Pokhrel, A., et al. Oznaczanie na obecność nieorganicznego polifosforanu w bakteriach. J. Vis. Exp. (2019).Ten film przedstawia test kolorymetryczny do pomiaru nieorganicznego polifosforanu (poliP) w próbkach bakteryjnych. Procedura polega na enzymatycznym przekształceniu poliP w wolny fosforan, który następnie reaguje z molibdenianem i kwasem askorbinowym, tworząc kompleks o niebieskim zabarwieniu. Porównując absorbancję tego kompleksu ze standardową krzywą znanych stężeń fosforanów,...

Test do oznaczania ilościowego nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

Źródło: Vidilaseris, K., et al. Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia test kolorymetryczny do badania przesiewowego inhibitorów pirofosfatazy związanej z błoną bakteryjną (mPPazy) poprzez ilościowe określenie uwalniania ortofosforanu. Metoda umożliwia identyfikację związków hamujących mPPazę z Thermotoga maritima, potencjalnego celu dla leków przeciwdrobnoustrojowych.

Przesiewowe inhibitory pirofosfatazy związanej z błoną bakteryjną za pomocą testu kolorymetrycznego 

Ten artykuł wprowadza procedurę badania adsorpcji fosfonianów na materiałach filtracyjnych zawierających żelazo, szczególnie granulowanym wodorotlenku żelaza, przy niewielkim wysiłku i wysokiej niezawodności. W roztworze buforowym fosfonian jest doprowadzany do kontaktu z adsorbentem za pomocą rotatora, a następnie analizowany za pomocą zminiaturyzowanej metody oznaczania fosforu.

Zoptymalizowana procedura oznaczania adsorpcji fosfonianów na granulowanym wodorotlenku żelaza przy użyciu metody oznaczania zminiaturyzowanego fosforu

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

W tym manuskrypcie ustaliliśmy metodę wysokoprzepustową do ilościowego oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej w hodowli biofilmu S. aureus z 96-dołkowej płytki do hodowli...

Analiza kolorymetryczna aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus

Wzrost kultur bakterii znakowanych radioaktywnie w mikromiareczkowych szalkach ułatwia pobieranie próbek o wysokiej przepustowości, co pozwala na wiele technicznych i biologicznych testów replikacji obfitości puli nukleotydów, w tym (p)ppGpp. Można monitorować skutki przemian wzrostowych wywołanych przez źródła stresu fizjologicznego, a także powrót do zdrowia po stresie.

Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej

Tutaj prezentujemy metodę przesiewową dla inhibitorów pirofosfatazy związanej z błoną (z Thermotoga maritima) opartą na reakcji błękitu molibdenowego w formacie płytki 96-dołkowej.

Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Opisano procedurę elektroforezy kapilarnej, spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania do bezwzględnego oznaczania ilościowego pirofosforanów inozytolu z ekstraktów komórkowych ssaków.

Bezwzględna ocena ilościowa pirofosforanów inozytolu za pomocą elektroforezy kapilarnej Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania

Poznaj szybką metodę oznaczania nieorganicznego polifosforanu w bakteriach Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. Technika ta jest czuła, tania i znacznie prostsza niż tradycyjne podejścia laboratoryjne.

Oznaczanie na obecność nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

Przeglądaj więcej filmów